包涵体蛋白的分离和色谱法体外复性纯化研究进展
包涵体蛋白体外复性的研究进展
包涵体蛋白体外复性的研究进展
方敏;黄华
【期刊名称】《生物工程学报》
【年(卷),期】2001(017)006
【摘要】外源基因在大肠杆菌中高水平表达时,通常会形成无活性的蛋白聚集体即包涵体.包涵体富含表达的重组蛋白,经分离、变性溶解后须再经过一个合适的复性过程实现变性蛋白的重折叠,才能够得到生物活性蛋白.近年来,发展了许多特异的策略和方法来从包涵体中复性重组蛋白.最近的进展包括固定化复性以及用一些低分子量的添加剂等来减少复性过程中蛋白质的聚集,提高活性蛋白的产率.
【总页数】5页(P608-612)
【作者】方敏;黄华
【作者单位】中国科学院遗传研究所,;中国科学院遗传研究所,
【正文语种】中文
【中图分类】Q51
【相关文献】
1.包涵体蛋白的复性研究进展 [J], 夏启玉;肖苏生;邓柳红;易小平;张春发
2.脲对Flt3配体包涵体蛋白质体外复性与同时纯化的作用研究 [J], 余秀娟;张如月;卢金铭
3.包涵体蛋白复性的研究进展 [J], 付明娟;林接玉(综述);谢捷明(审校)
4.包涵体蛋白的层析复性技术研究进展 [J], 高飞;范清林;邹文艺;宋礼华
5.重组大肠杆菌表达外源蛋白包涵体复性的研究进展 [J], 牟筱;宗惠;宫皓;杨焱;余四九
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包涵体中蛋白纯化及复性
Purification of inclusion bodies and refolding of proteinsBasic StrongLab protocol, based on a recipe concocted by Pingwei Li, (cite, if used: Steinle, A., Li, P., Morris, D. L., Groh, V., Lanier, L. L., Strong, R. K. & Spies, T. (2001) ‘Interactions of human NKG2D with its ligands MICA, MICB, and homologs of the mouse RAE-1 protein family’Immunogenetics 53, pp. 279-87) a derivative of a recipe originally developed in the Jones lab (O'Callaghan CA, Tormo J, Willcox BE, Blundell CD, Jakobsen BK, Stuart DI, et al. (1998) 'Production, crystallization, and preliminary x-ray analysis of the human MHC class Ib molecule HLA-E' Protein Science7, pp. 1264-1266)++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++1. Preparation of inclusion bodies:a. Harvest bacteria after induction for about 4 hours. (We generally induce expression at OD of about 1.0 for inclusion body preps, this may improve the yield a lot).Troubleshooting for good protein expression can include the following:-- Expression at room temp or at 16 degrees rather than 37.-- Expression from a freshly transfected strain rather than frozen glycerol stock.b. Lyse bacteria by sonication in the following buffer:*50mM Tris-HCl, pH 8.0100mM NaCl5mM EDTA0.1% NaN30.5% Triton-X100 (can use a 25% stock)add 0.1mM PMSF and 1mM DTT immediately before useGenerally we lyse cells from 4 liters of prep in 250ml of lysing buffer and wash with 250ml of the same buffer over the next three steps. 50-mL aliquots work well for sonication.(* = You can also use a microfluidizer at this step.)c. After sonication, add 10mM MgSO4 (use 2.0M stock) to chelate the EDTA, then add DNase (about 0.01mg/ml) and lysozyme to about 0.1mg/ml to the lysate and incubate at RT for 20min.d. Centrifuge to collect inclusion bodies (for example, 6000 rpm for 15 minutes). Crush the pellet with a spatula, then resuspend it completely by sonication in the lysing buffer. Another portion of DNase and lysozyme can be added at this point to improve the purity of the pellet.e. Repeat step d two more times without adding DNase and lysozyme.f. Wash the inclusion body again with lysing buffer without Triton-X100. Resuspend this pellet by sonication as well.Buffer for final wash (no Triton-X):50mM Tris-HCl, pH 8.0100mM NaCl5mM EDTA0.1% NaN3g. Collect the final inclusion body pellet by centrifugation in 50-mL Falcon tubes.In most cases this protocol results in inclusion body preps of more than 80% purity.++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++2. Dissolve the washed inclusion bodies:Collect pure inclusion body in 50ml Falcon tubes, add 30-40ml of 100mM Tris buffer at pH 8.0 with 50mM Glycine.Disperse the pellets completely by sonication and then dissolve the suspension dropwise, stirring vigorously, in 100mM Tris buffer at pH 8.0 with 50mM Glycine and 8.5M urea(100 mL for every 2 L of culture is adequate for normal-sized pellets; a final inclusion-body concentration of about 1.0mg/ml works well for refolding.)Then add 5mM GSSH and 0.5mM GSSG and stir overnight at 4 degrees. This will then be ready for refolding by dialysis. (Incubation at 25 degrees often works as well, and a different pH can be tried at this stage.)(GSSG is oxidized glutathione, GSSH reduced glutathione. If you’re having problems with reduction of disulfides, you could substitute a high concentration of DTT at this point, but this adds another few days over which the DTT must be dialyzed away extensively before beginning to lower the urea concentration.)++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++3. RefoldingRefolding buffers include0.1M Tris0.4M L-Argininesupplement with 4.0M, 2.0M, 1.0M and 0.00M Urea. (4M urea may require heat as well as vigorous stirring to dissolve)Set the pH to 8.0 after adding major components of solution.Then add immediately before use:1 mM EDTA1ug/ml Leupeptin and pepstatin (proteinase inhibitors)0.2mM PMSFstep1. dialyze against RF buffer with 4.0M urea for 24hrsstep2. dialyze against RF buffer with 2.0M urea for 24hrsstep3. dialyze against RF buffer with 1.0M urea for 24hrsstep4. dialyze against RF buffer with 0.0M urea for 24hrsstep5. dilute 0M refolding buffer with water in a 1:4 ratio, dialyze against 1/4*RF buffer for 24hrs step6. dialyze against PNEA with 0.2mM PMSF for 24hrsSome steps can continue longer than 1 day if necessary.If the refolding doesn't work, many factors can be changed in this series of steps to try and improve refolding. These include changing the pH to 6.0, adding 10% glycerol, using 6M guanidinium instead of 8M urea, bringing the protein down to only 0.5M urea then completing the purification and crystallization in 0.5M urea, removing the arginine, and co-refolding with associated protein receptors, etc.PNEA is 25mM PIPES, 150mM NaCl, 1mM EDTA and 0.02% NaN3. This is our running buffer for FPLC; it can be replaced with any other buffer you want to use.Then harvest the refolded protein, centrifuge for 15-20 min. at 12-20,000rpm to remove the precipitant. This supernatant can be concentrated with stir cells or centrifugation concentration, then purified on Superdex 75 column or Ni-NTA column (add MgSO4 to chelate EDTA in the final refolding buffer before loading on Ni column).++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++4. Refolding by rapid dilutionSome people like to do refolding by rapid dilution. This is done by adding solublized inclusion bodies dropwise into a refolding buffer with rapid stirring:Refolding buffer for dilution:Tris 0.1M pH 8.00.4M L-Arg1ug/ml Leupeptin and Pepstatin0.2mM PMSF0.5mM GSSG(oxidized glutathione) and 5mM GSSH (reduced glutathione)In our experience, dilution works as well as dialysis for refolding. The problem is that you end up with a large volume of refolded protein with GSSH, which is inconvenient for purification.++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++5. Analysis of refolding productsWe generally monitor the refolding process with analytical size-exclusion FPLC. In most cases we see a distribution of large aggregates, oligomers, and monomeric forms of our proteins.Generally a large portion of misfolded aggregates and multimers will crash out when the protein is refolded and/or concentrated. The yield by mass of refolded protein from a pellet for most proteins is about 2-5%, although some proteins refold more easily (20%). A yield of 1% is low but not disastrously so.。
基因重组蛋白包涵体的复性研究
蛋白质与介质的疏水 性相互结合
rhIFN-γ，rhIFN-β， 重组人粒细胞集落刺激因子rhGC-CSF
离子交换色谱 蛋白质与介质间存在 Papiloma virus(HPV)， E7MS2 fusion protein，
（IEC）
电荷作用力
重组白细胞分泌抑制因子rSLPI，抗原疫苗蛋白
亲和色谱 （AFC）
需要进行蛋白质翻译后修饰（如糖基化）就具有生物 活性的基因工程蛋白
基因重组蛋白包涵体的复性研究
51％
基因重组蛋白包涵体的复性研究
8.2 包涵体的形成
在大肠杆菌中表达的基因工程蛋白常常以包涵体的形式 沉积于细胞内，表现为无活性的不溶性聚集物
包涵体：外源目的基因在宿主系统中高水平表达时，因各 种原因导致基因表达产物的一级结构（即氨基酸序列）虽 然正确，而其高级结构是错误的，即：没有生物活性的包 涵体。包涵体直径约0.5-1μm，具有很高的密度（约1.3 mg/ml），相差显微镜下有折光性，呈非水溶性，只溶于高 浓度变性剂如尿素、盐酸胍等。
• 由于I向N转化是一个慢的过程，当蛋白质在此时放置较长 的一段时间，I就可以慢慢地向N转化
基因重组蛋白包涵体的复性研究
影响复性效率的因素
• 4）氧化还原环境
• 复性不仅要降低或去除变性剂，同时必须提供SH-氧化形 成S-S的环境→合适的氧化还原环境
• 采用配对的氧化型和还原型巯基物质 • 配对低分子量巯基试剂包括GSSG/GSH、半胱氨酸或巯基
基因重组蛋白包涵体的复性研究
包涵体形成的几种可能性
• 研究发现：低表达时很少形成包涵体，表达量越高越易形成包涵体。 • 1）少量蛋白产生时是可溶的，表达量过高，积聚量超过其在细胞
内溶解度时沉淀； • 2）合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能
包涵体的纯化和复性情况总结
板块一、大肠杆菌（这里讨论的大肠杆菌为非分泌到培养基中的重组蛋白，是否有重组蛋白分泌到培养基中的工程菌我没有见过。
）一、关于菌体的量大肠杆菌表达的基因工程蛋白是纯化人员最方便获得的原料，对纯化工艺开发来说几乎没有原料方面的限制。
常看到有战友用个几毫升的菌液去做纯化，对此我十分不解，同样要做，为什么不多做点呢？很少的菌体会给纯化带来一些难以估计的问题，工艺的重复性和放大往往出现问题。
因此，要做个好工艺就多发酵表达一些菌体吧。
我做纯化时，初始工艺摸索用的菌体量一般为10g左右。
二、关于是否包涵体表达包涵体的定义我就不讲了。
我要讲的是，一个基因工程蛋白是否是包涵体表达的说法本身就不完全准确。
至于包涵体在电镜下的晶体颗粒表现等等对我们纯化来说毫无意义，我相信做纯化工艺的人没有谁去看这个电镜，也不关心。
我们判断的依据只是SDS-PAGE，目的蛋白在破菌沉淀中，我们就认为是包涵体表达，但这是一个似是而非的结论。
看着没问题，实际上是有毛病的。
关键在于你用的是什么破菌缓冲液！有些蛋白在用缓冲液A破菌时是在破菌沉淀中，而用缓冲液B破菌时却在破菌上清中。
缓冲液A和B的差别可能只是pH上相差1-2个单位。
那么它是包涵体表达还是可溶上清表达呢？说这个问题主要在于有些战友往往非常在意他的目标蛋白是否包涵体表达。
甚至还有包涵体表达就用专门的包涵体蛋白纯化方法等等。
我们应该关心的是目标蛋白在什么缓冲体系下是可溶的，在什么缓冲体系下是不溶的！不要让包涵体这个概念给你误导。
三、关于表达量我们常常在发表的文章上看到，我这个工程菌的目标蛋白的表达量达到菌体总蛋白的30%、50%等等。
我要说都是文章的作者在忽悠。
不知道他们是如何定量的，用的最多的大概就是SDS-PAGE的扫描分析吧。
且不说一个SDS-PAGE不能表现出所有的菌体蛋白，电泳的染色方法、染色脱色强度、照片的曝光强度、扫描分析时的条带选择等等无不对这个百分比影响巨大。
在公司的QC部门做的对此应该最有体验，20%的条带要它变成30%又有何难？我的观点是对待表达量的描述不可定量，只能定性。
包涵体蛋白复性技术研究进展
件、Ｎ Ｒ Ａ聚合 酶 、 膜蛋 白 ｏ Ｃ、ｍｐ 外 ｍｐ ｏ Ｆ和 ｏ Ａ等 ， ｍｐ 环状 或缺 口的质 粒 Ｄ Ａ， Ｎ 以及 脂 多 糖 等 ， 溶 于 变 只 性剂 如尿 素 、 酸胍 等 。包涵 体形 成 的原 因有很 多 ， 盐 有 时甚 至是多 种 因素 的协 同作 用 。 主要 原 因是 重组
・
８ ・ ４
微生物学免疫学进展
２ １ 年第 ４ 卷第 ２ ０２ ０ 期
Ｐｏ ｉ Ｍ ｃ ｂｏ Ｉ ｍ ｎ ｌ ｐ． ０ ２ Ｖ １ ０ Ｎ ． ｒ ｉ ｏ ｉ ｕｏ ｇｎ ｒ ｌｍ Ａ ｒ ２ １ ， ｏ ４ ， ｏ２ ．
・
综
述 ・
包 涵体 蛋 白复性技术研究进展
包义风 综述 ； 应莲芳， 蒋琳 审校
白； 第三 ， 复性 ， 逐步去除变性剂， 使蛋白恢复正确折
叠 。前 两 步收率 相 对较 高 ， 三步 收率较 低 ， 第 不正 确 的折叠 蛋 白构 型是 主要 的 限制 因素 。 迄今 为止 ， 还没 有发 现通 用 的蛋 白复性 方法 ， 包
的速 度 、 二硫键 的错 误配 对 、 白质序 列本 身都 可能 蛋 导致 包涵 体 的形成 。 从基 因工 程 菌 中收 获包 涵体 ， 要 通 过 高 压匀 需 浆， 超声 波 ， 溶 等方 法 来 破 碎 菌 体 ， 离 心 除 去可 酶 再 溶性 蛋 白获得 粗制 包 涵 体 ， 种 粗 制 包 涵 体含 有 大 这
包涵体蛋白质的复性研究进展
后基因组时代对基因结构与功能研究的需要 使得基因 的重组表达技术受到广泛的关注 [ 1] 。以大肠杆菌 为宿主菌 的原核表达系统因具有遗 传背 景清楚 、 易 于操 作和 成本低 廉等优点而被广泛应用于基因表达产物的结构与 功能研究 中。现已成 功实现重组蛋 白质 在大肠 杆菌 中的 高表达 , 然 而 , 绝大部分高表达的重组蛋白质往往聚 集成不溶的、 无活 性的包涵体形式 , 极大 地影响 到后 续的结 构分 析和 活性研 究工作 , 开展对这些包 涵体的 复性 工作已 成为 一个 重要的 研究方向。 迄今为止 , 还没有 普遍适 用于 所有重 组蛋 白质 的复性 方案 , 包涵体蛋白质的 复性已 成为 制约重 组蛋 白质 生产的 关键因素之一。近年来 , 随着 对蛋 白质折 叠机 理的 深入研 究 , 一系列的复性方法 已被应 用于 包涵体 蛋白 质的 复性过 程 , 多种蛋白质的包涵体 复性数 据库 Refold 也在不 断的完 善中 , 其 中已收录 了近 500 种蛋白 的 25 种复 性方法 [ 2] , 建 立该库的目标是从中寻找 包涵 体复性 的共 性 , 为表 达纯化 新的蛋白质提供参考。本文主要就目前效率较高 的几种复 性方法进行了探讨。 2 1 1. 1 包涵体蛋白质的复性策略 将色 谱技术应用于蛋白质的复性是最近研究 较多并成 包涵体蛋白质的复性机制 由于包涵体溶解过程 中高 级结构 被破 坏 , 不具 备生物 学活性 , 因此有必要 进行 重组蛋 白的 复性。复 性过 程是变 性蛋白的重折叠过程 , 一般通 过降 低包涵 体变 性液 中的变 性剂含量引发。蛋白质的 重折 叠不是 一个 单一 的反应 , 需 经过一系列的折叠中间体 , 最后形成蛋白质 的天然构象 ( 图 1
包涵 体。包涵
体中 富含表达的重组蛋白质 , 它们经分离、 洗涤、 变性溶解以及复性 等过程才能得到具有生物活性的 蛋白质。近 年来 , 随着对包涵体体外复性机制的深入研究 , 从包涵体中 复性重组蛋 白质已 经有了 很多的策 略和方 法。文章 就有关工作的进展进行了综述。 关键词 包涵体 ; 折叠 ; 蛋白复性 文献标识码 : A 文章编号 : 1005 8915( 2007) 04 0306 04 中图分类号 : Q 7
包涵体蛋白的纯化及复性讨论专贴
包涵体蛋白的纯化及复性讨论专贴！zbbnet wrote:最近实验遇到了大麻烦，说出来大伙帮忙想想法。
实验所用菌株为BL21，载体pMAL-p2X，与MBP融合表达，目的蛋白有三对二硫键。
最初的设计思想是想通过MBP的信号肽实现可分泌表达，但实验发现主要是包涵体表达。
菌体超声破碎后12000rpm离心，所获得的沉淀不能很好的贴在离心管底，而是处于部分溶解状态，对沉淀再作如下处理：1、2M尿素洗涤，pH8.5，12000rpm离心，获得的上清不是澄清透明而是略显混浊，这次的沉淀能够牢固的贴在管底。
2、4M尿素洗涤，pH9.0，12000rpm离心，获得的上清不是澄清透明而是略显混浊，这次的沉淀为半溶状态的冻状物。
3、8M尿素溶解上述2中的沉淀，几乎不见不溶的颗粒，但溶液还是略显混浊。
上述三溶液取样电泳，均见较多的目的蛋白。
对3中的溶液取样调pH至12溶液依然混浊。
0.22um过滤，无法去除混浊物。
考虑到混浊物是多聚体，样品中加入1％SDS和0.2％β-Me，都无法改善。
做上述处理，主要考虑到混浊物是目的蛋白，因为目的蛋白设计了6HIS但不能成功的结合Ni柱。
主要想请教这样几个问题：1、有没有那位战友也碰上我上述的问题，这种问题是如何解决的？2、我所描述的包涵体的状态说明了什么问题？3、对与蛋白溶液混浊有什么好的处理方法？暂不讨论分泌表达的问题。
回答：1. 你的情况很正常，根据三次沉淀处理情况，应该可以肯定你的蛋白在8MUrea中是完全可以裂解的。
并且该蛋白如若作复性应该可溶性较佳。
但根据我个人的经验。
如果MBP融合蛋白还是以包含体表达的话是很没有意思的，建议作单独表达，除非单独表达不行。
否则即使完全复性，目的蛋白活性也大打折扣。
另可优化表达条件，有可能可容表达的，不要放弃，你的破菌上清也可以跑胶看看有没有目的蛋白。
2. 说明蛋白蔬水性不强。
3。
有些蛋白裂解后有浑浊非常正常，尤其是MBP融合的，即使做到可容也会有白乎乎浑浊的现象，只要不影响使用就行，没必要在意。
包涵体蛋白的复性研究进展
基金项目 作者简介 收稿日期
中国热带农业科学院中央级公益性科研院所基本科研业务 费专项资金资助。 夏启玉（１９８３－ ），女，湖北浠水人，硕士研究生，研究方向：植 物基因工程。＊ 通讯作者，Ｅ!ｍａｉｌ：ｚｈａｎｇ＿ｃｓ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ。 ２００８! ０３!１７
（８５ ℃）溶解抗真菌重组肽的包涵体［１］。高 ｐＨ 值（≥１２）结合 低浓度的变性剂 （如 ２０％～４０％异丙基或 ｎ!丙基乙醇溶液） 用于溶解生长激素包涵体非常有效［２］。由于蛋白间二硫键的 存在，在增溶时一般要使用还原剂。还原剂的使用浓度一般 为 ５０～１００ ｍｍｏｌ／Ｌ ２!βＭＥ 或 ＤＴＴ。 ３ 包涵体的复性
基因工程技术的飞速发展为大规模生产目标蛋白质提 供了可能，大肠杆菌因其易于操作、遗传背景清楚、发酵成 本低和蛋白表达水平高等优点，成为生产重组蛋白的首选 表达系统。外源基因在大肠杆菌中的高表达常常导致包涵 体的形成，包涵体易于分离纯化，并能避免蛋白酶对外源蛋 白的降解，但包涵体不溶且无生物学活性。因此，如何高效 地复性包涵体蛋白是基因工程技术面临的一个难题。笔者 对包涵体蛋白的复性研究进展作一综述，旨在为促进基因 工程技术的发展提供理论依据。 １ 包涵体简介
较好效果［１６］。Ａｌｔａｍｉｒａｎｏ 等将 ＧｒｏＥＬ（抑制蛋白质聚集）、ＤｓｂＡ （帮助二硫键的交换）和脯氨酸异构酶固定在琼脂糖上，成功 用于变性的蝎毒素 Ｃｎ５ 的复性［１７］。
（３）脂质体亲和层析。脂质体可以识别蛋白质折叠的中 间体，如同分子伴侣抑制蛋白质聚集体的形成［１８］。因此，可 以将脂质体作为配体共价结合到层析介质上，固定化脂质 体的层析可以提高蛋白质折叠收率，并能部分纯化蛋白质［１９］； 脂双层膜可以根据蛋白质分子表面的不同疏水性能，选择 性地结合不同的蛋白质。在蛋白复性过程中，脂质体层析柱 能够键合蛋白折叠中间体，抑制其发生分子间的聚集反应， 从而提高活性产量。Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ 用固定化脂质体层析柱对碳 酸酐酶、溶菌酶和核糖核酸酶 Ａ 的复性进行了研究，取得 了较好的效果［２０］。 ３．２．５ 扩张床吸附复性（ＥＢＡ）。英国剑桥大学的 Ｃｈａｓｅ 等发 展了能在床层膨松状态下实现平推流的扩张床吸附技术［２１］。 这种层析复性方法具有处理量大、蛋白质浓度高、可重复生 产以及降低操作步骤等优点。该技术是利用扩张床吸附层 析直接从细菌裂解变性液中捕获并复性目标蛋白。其过程 是将细菌破碎液直接加入高浓度的变性剂，然后上样到扩 张好的柱床上，在上样过程中，细胞碎片和不吸附的杂质流 穿掉，而变性蛋白被吸附在凝胶上，然后用含变性剂的缓冲 液清洗掉剩余杂质，再用不含变性剂的缓冲液洗掉变性剂， 将扩张床沉降后，用洗脱缓冲液将目标蛋白洗脱下来，通过 吸附、清洗和洗脱的过程，变性蛋白得以复性并获得初步纯 化。这种扩张床式的层析复性方法具有处理量大、蛋白质浓 度高、可重复生产以及降低操作步骤等优点。Ｃｈｏ 等利用该 技术将 ｒｈＧＨ!ＧＳＴ 和 ｒｈＩＦＮ!α!２ａ 直接从细菌破碎液中提取 出来并加以复性，获得比稀释复性高 ３ 倍的复性效率和纯 度［２２］。 ４ 复性过程中的添加剂
包涵体蛋白的提取与纯化
包涵体蛋白的提取与纯化摘要：随着基因重组技术的发展及越来越多的功能基因被发现和克隆, 蛋白质异源表达已被广泛应用。
大肠杆菌因遗传背景清楚、成本低、操作简单, 且能高效表达外源基因等特点, 是基础研究、临床应用及工业生产蛋白和多肽的首选表达系统。
然而, 重组蛋白在大肠杆菌中表达经常形成无活性的不溶性聚集物即包涵体。
包涵体的形成有一定的优势, 如具有高蛋白密度、易分离、易于毒性蛋白和宿主细胞致死蛋白表达等特点[1~ 3] 。
因此, 如何将包涵体蛋白转变为具有活性的可溶蛋白是备受关注的问题。
从包涵体中获得天然活性的重组蛋白一般包括三个步骤: 包涵体的分离和洗涤、包涵体的溶解、包涵体蛋白的复性。
本文综述了近年来包涵体蛋白分离纯化和色谱法复性技术研究进展,期望包涵体蛋白体外折叠这一难题早日解决。
正文：1．包涵体的形成重组蛋白不论在原核细胞还是真核细胞中表达时，都可形成包涵体[4]。
通常所说的包涵体是指重组蛋白在大肠杆菌中高效表达时形成的无活性蛋白聚集体，一般含有50%以上重组蛋白，其余为核糖体组分、RNA聚合酶，外膜蛋白等杂蛋白，以及质粒DNA、RNA片断、脂质、肽聚糖、脂多糖等成分[5，6]。
由于包涵体在相差显微镜下为黑色斑点，所以也称为折射体(Refractilebody)[7]。
包涵体形成的原因主要有以下几点:蛋白合成速度太快，以致于没有足够的时间进行折叠。
蛋白折叠的动力学模型表明:蛋白质天然构象形成的速率取决于肽链的合成速率、折叠速率和聚集速率几个因素。
中间体正确折叠是分子内的一级反应，而中间体的聚集是发生在分子间的二级或高级反应，因此，折叠中间体的浓度对聚集反应影响非常大[8]；¦重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺少真核生物的翻译后修饰系统(如糖基化等)，致使中间体大量积累，容易形成包涵体[9]；培养条件不佳和重组蛋白所处的环境也可导致包涵体形成，如发酵温度高，胞内pH接近蛋白的等电点等[10]；¨二硫键在蛋白折叠中有重要作用，而大肠杆菌胞内的还原环境不利于二硫键的形成[2]；©包涵体不溶可能由于分子间无活性的B-片层含量高于天然结构或盐沉淀蛋白[11]。
包涵体蛋白的纯化和复性
包涵体蛋白的纯化和复性包涵体蛋白的纯化和复性1．菌体的收集和破碎用50 ml离心管分别收集诱导表达后的培养物，8000 rpm 4℃离心10 min。
沉淀用适量的超声破菌缓冲液重悬。
【备注】超声破菌缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl pH8.0、0.5 mol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、1 mg/mL溶菌酶）重悬后的菌液于冰浴中进行超声波破碎，其条件为：功率为300W，占空比50%，每个循环30 s，总时间20 min。
破碎后的匀浆，4℃、 12000 rpm离心15 min。
分别取上清液和沉淀进行12% SDS-PAGE分析，确定目的蛋白是否以包涵体的形式表达。
2．包涵体的处理洗涤：沉淀用适量的包涵体洗涤缓冲液重悬后，搅拌洗涤20~30 min，于4℃，12000 rpm离心15 min，弃去上清液。
重复一次。
再用适量的50 mmol/L Tris pH8.0溶液洗涤一遍（以去除残留的EDTA），于4℃ 12000 rpm离心15 min，弃去上清液。
【备注】包涵体洗涤缓冲液（20 mmol/L Tris－HCl pH 8.0，0.5 mol/L NaCl，2 mol/L尿素，2％ Triton）2％Triton X-100溶液：量取2mlTriton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)液，加M缓冲液98ml即可。
溶解：沉淀用适量的包涵体溶解缓冲液重悬，室温搅拌5-6小时或过夜。
12000 rpm 4℃离心15 min，收集上清液。
【备注】包涵体溶解缓冲液（20 mmol/L Tris－HCl pH 8.0，0.5 mol/L NaCl，8 mol/L尿素，0.2 mmol/L DTT或100 mmol/L β-巯基乙醇，2％Triton）3．目的蛋白的纯化亲和层析基于目的蛋白与固相化的配基特异结合而滞留，其他杂蛋白会流过柱子。
谷胱甘肽S-转移酶（GST）是最常用的亲和层析纯化标签之一，带有此标签的重组蛋白可用交联谷胱甘肽的层析介质纯化，但本方法有以下缺点：首先，蛋白上的GST必须能合适的折叠，形成与谷胱甘肽结合的空间结构才能用此方法纯化；其次，GST标签多达220个氨基酸，如此大的标签可能会影响表达蛋白的可溶性，使形成包涵体，这会破坏蛋白的天然结构，难于进行结构分析，有时即便纯化后再酶切去除GST标签也不一定能解决问题。
[原创]工程菌生产的蛋白包涵体的复性与纯化-秦
![[原创]工程菌生产的蛋白包涵体的复性与纯化-秦](https://img.taocdn.com/s3/m/b6184610ef06eff9aef8941ea76e58fafbb04554.png)
[原创]工程菌生产的蛋白包涵体的复性与纯化-秦第八章工程菌生产的蛋白包涵体的复性与纯化分子生物学的发展使蛋白质的表达和生产进入到一个新的时代。
大肠杆菌由于遗传背景清晰，容易培养，可以大规模发酵，以及大量可供选择利用的克隆和高效表达载体而成为目前人们克隆和表达外源基因的首选菌株。
但是，在实际操作中重组蛋白质在大肠杆菌中的高水平表达往往导致蛋白质聚集形成不溶性的包涵体。
包涵体的形成虽有不少优点，如可溶性形式存在的外源蛋白在细胞内容易受到蛋白酶的攻击，而包涵体形式存在的外源蛋白则不易被蛋白酶降解;包涵体的形成降低了细胞内外源蛋白的浓度，有利于表达量的提高;包涵体中杂蛋白含量较低，且只需要简单的低速离心就可以与可溶性蛋白分离，有利于分离纯化;包涵体对机械搅拌和超声破碎不敏感，易于破壁，并与细胞膜碎片分离等。
但是，无活性的包涵体蛋白质需经过复性使其折叠成为具有天然构象和生物活性的蛋白质，这通常是一件很困难的事情，而且不同的蛋白质其复性方法也各不相同，因此基因重组蛋白质的复性一直是生物工程下游纯化技术的研究热点之一。
现有的生物技术研究和产业化过程表明，重组蛋白包涵体的变性及复性是重组蛋白类药物生产中最为关键的技术之一，是基因工程产品商业化的瓶颈，也是一个世界性难题。
第一节包涵体形成的原因,(什么是包涵体所谓包涵体是指由于表达部位低电势及外源蛋白质分子的特殊结构(如Cys含量高)，如低电荷，无糖基化等，使得重组蛋白质与核酸，周围杂蛋白质(如核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白质ompC、ompF和ompA等)，以及脂体、脂多糖等形成的聚合体(图8-1)。
包涵体一般大小为0.1~3.0 μm，具有很高的密度(约1.3 mg/ml)，无定形，呈非水溶性，只溶于尿素、盐酸胍等变性剂。
包涵体中重组蛋白质一般占包涵体总成分的50%以上，它们没有生物学活性，因为蛋白质分子没有形成正确的构象。
有报道表明成熟的分子相比包涵体内蛋白质含有更多的β结构而较少的,结构，也有报道表明包涵体中的肽链已获得与天然蛋白质分子非常接近的空间构象。
大肠杆菌表达的包涵体的纯化与复性研究
【实验技术】大肠杆菌表达的vMIP2Ⅱ包涵体的纯化与复性研究张少恩 孙晗笑 张光 杨清玲 沙文琼 刘俊云 龚莉桂【摘要】 目的 纯化、复性大肠杆菌表达的vMIP2Ⅱ包涵体蛋白。
方法 用8m olΠL尿素缓冲液变性溶解vMIP2Ⅱ包涵体,然后加入十二烷基磺酸钠(S DS)进一步促溶,利用金属亲和层析和分子筛层析纯化,再利用柱层析去除S DS,纯化后透析复性;通过荧光和单核淋巴细胞趋化抑制实验检测复性蛋白的结构和抑制单核淋巴细胞趋化的活性。
结果 重组vMIP2Ⅱ纯化和复性后,仍具有完整的高级结构和抑制单核细胞趋化的活性。
结论 已获得了重组vMIP2Ⅱ活性蛋白,为进一步研究应用奠定基础。
【关键词】 vMIP2Ⅱ包涵体;十二烷基磺酸钠;环氧糊精Purification and R enaturation of vMIP2ⅡI nclusion Body Expressed in E.coliZH ANG Shao2en,S UN Han2xiao,ZH ANG G uang,et al(Institute for G enomic Medicine,Jinan Univer sity,Guangzhou 510632,China)【Abstract】 Objective T o purify and re2naturalize the vMIP2Ⅱinclusion body protein expressed in E.coli.Methods The vMIP2Ⅱinclusion body expressed in E.coli was diss olved with8m olΠL urea,then further diss olved with S DS and purified by metal affinity chroma2 tography and m olecular sieve chromatography.Revm ove the S DS bound to protein m olecules by affinity column chromatography and re2naturalize the vMIP2Ⅱinclusion body by dialysis.Examine the structure of renaturalized protein by fluorometric assay and determine its activity by che2 m otaxis2inhibiting test of m ononuclear lymphocytes.R esults The recombinant vMIP2Ⅱwith intact higher2order structure was purified,re2natu2 ralized,and showed activity in inhibiting the chem otaxis of m ononuclear lymphocyte.Conclusion The recombinant vMIP2Ⅱprotein with activ2 ity was obtained.It laid a foundation of further application of the protein.【K ey w ords】 vMIP2Ⅱinclusion body;S DS;Cyclodextrins 病毒巨噬细胞炎症蛋白Ⅱ(Virus macrophage in2 flammation protein2Ⅱ,vMIP2Ⅱ)是由人疱疹病毒8编码的蛋白,全基因编码95个氨基酸,成熟蛋白为74个氨基酸,与人的MIP同源性高达41%,其中8种非极性氨基酸占40%,具有较强的疏水性[1]。
蛋白质的排阻色谱复性的新进展
蛋白质的排阻色谱复性的新进展3王超展 耿信笃33(西北大学现代分离科学研究所现代分离科学陕西省重点实验室 西安 710069)摘要 外源蛋白在大肠杆菌中高效表达时,常常形成不溶的、无活性的包涵体,包涵体蛋白的复性是重组蛋白生产过程中的一个技术难题。
排阻色谱(size exclusion chromatography ,SEC )用于蛋白复性是一种较新的、适用于任何一种蛋白的方法,与常用的稀释复性法相比,它能在高的起始蛋白浓度下对蛋白进行复性,活性回收率较高,同时又能使目标蛋白得到一定程度的纯化。
对使用SEC 复性的进展进行了评述,其内容包括SEC 复性的原理及其复性过程中的影响因素,并对其未来发展进行了展望。
关键词 包涵体 重组蛋白 蛋白折叠 复性 排阻色谱收稿日期:2004202224 修回日期:20042052113国家自然科学基金资助项目(20175016).33通讯作者,电子信箱:xdgeng @. 重组蛋白在大肠杆菌中的高水平表达经常导致蛋白聚集而形成不溶的、无活性的包涵体。
为此,欲获得天然活性态的目标产物,必须对经过脲或盐酸胍等变性剂溶解后的变性蛋白进行复性。
目前,稀释法是应用最为广泛的复性方法,然而其复性效率很低,一般为5%～20%。
色谱法复性是近年来发展较快的一种蛋白复性方法,具有抑制聚集,活性回收率高,可以在较高蛋白浓度下复性,并且同时可以使蛋白质得到纯化的优点[1,2]。
SEC 由于容易操作和放大,且适用于各种变性蛋白的复性,是目前研究最多的一种色谱复性方法之一[3]。
1992年,G eng 等[4]用排阻色谱(SEC ,在用软基质为固定相时,又称其为凝胶渗透色谱,或简称凝胶色谱,G PC )对溶菌酶(Lys )、核糖核酸酶(RNase )和牛血清白蛋白(BS A )进行了复性并同时进行了分离,虽然当时并不认为SEC 的复性效果会比疏水色谱法(HIC )好,但这是首次对用SEC 法复性蛋白进行报道。
包涵体蛋白3种纯化方法的比较
包涵体蛋白3种纯化方法的比较目的比较3种纯化方法对表达的肠道病毒71型（EV71）VP1区包涵体蛋白的纯化效果。
方法分别用差速离心法、固定化金属离子亲和层析（IMAC）及不同浓度饱和硫酸氨沉淀法3种包涵体蛋白纯化法对原核表达EV71 VP1包涵体蛋白进行纯化，蛋白垂直（SDS-PAGE）电泳检测蛋白纯化效果。
结果差速离心法可以进行大批量表达蛋白纯化，纯化效果较好，但存在蛋白损失较多，且纯化蛋白不能反复冻融的问题。
IMAC柱纯化获得的蛋白纯度较高，且蛋白性状稳定，但仍存在纯化蛋白量较少的问题。
饱和硫酸氨沉淀纯化法无法获得纯度较高的包涵体蛋白。
结论差速离心法可用于大批量蛋白纯化，纯化蛋白应避免反复冻融，可小量分装冻存后备用。
IMAC柱纯化可获得纯度较高且性状相对稳定的纯化蛋白，其在相应抗体检测方法学的建立及疫苗制备方面均有广泛用途。
饱和硫酸氨法只适用于表达蛋白的初步浓缩纯化。
[Abstract] Objective To compare the expressed inclusion body protein of EV71 VP1 with three purification methods. Methods The expressed EV71 VP1 inclusion body protein was purified by differential centrifugation，IMAC column purification and ammonium sulfate precipitation. SDS-PAGE experiments determinate the purity effects. Results Expressed inclusion body purification in large quantities could been undertaken by differential centrifugation and the purification effect was better but with a lot of protein loss and the purified protein could not be repeatedly frozen and thawed. The purification effect of IMAC was good and stable，but less purified protein was purified. High purity of inclusion body protein wasn’t obtained by ammonium sulfate precipitation. Conclusion Differential centrifugation is applicable in large quantities of protein purification，but avoid repeatedly freezing and thawing. The protein purification of IMAC can be used to establish corresponding antibody detection methods. The ammonium sulfate precipitation is only applicable for the preliminary purification of the expressed proteins.[Key words] Inclusion body protein；Protein purification；SDS-PAGE electrophoresis包涵体是外源基因在细胞中表达量过高形成的一种膜包裹的高密度、不溶性蛋白颗粒。
包涵体蛋白体外复性的研究进展
17卷6期2001年11月生 物 工 程 学 报Chinese Journal o f Biotechnology V ol.17 N o.6N ovember 2001收稿日期:2001204213,修回日期:2001207220。
基金项目:国家863项目(8632102209204201)资助。
3通讯作者。
T el :86210264889350;Fax :86210264857285;E 2mail :hlhuang @ 包涵体蛋白体外复性的研究进展方 敏 黄华 3(中国科学院遗传研究所,北京100101)摘 要 外源基因在大肠杆菌中高水平表达时,通常会形成无活性的蛋白聚集体即包涵体。
包涵体富含表达的重组蛋白,经分离、变性溶解后须再经过一个合适的复性过程实现变性蛋白的重折叠,才能够得到生物活性蛋白。
近年来,发展了许多特异的策略和方法来从包涵体中复性重组蛋白。
最近的进展包括固定化复性以及用一些低分子量的添加剂等来减少复性过程中蛋白质的聚集,提高活性蛋白的产率。
关键词 重组蛋白,包涵体,重折叠,复性,二硫键形成中图分类号 Q51 文献标识码 C 文章编号100023061(2001)0620608205 DNA 重组技术的发展使得蛋白质的生产进入了一个新时代。
大肠杆菌表达体系因其具有低廉性、高效性和稳定性等优点在科研生产中被广泛应用。
然而,重组蛋白在大肠杆菌中的高水平表达经常导致蛋白聚集而形成不溶的、无活性的包涵体。
因此,自从应用大肠杆菌体系表达基因工程产品以来,人们就一直通过以下两个方向的研究以期望得到高活性、高产量的重组蛋白:(1)促进重组蛋白在大肠杆菌中的可溶表达:改变大肠杆菌的生长条件,或使重组蛋白与其它蛋白(如分子伴侣、折叠酶等)融合表达或共表达,或使重组蛋白分泌表达至细菌周质腔中等策略使重组蛋白在大肠杆菌中表达成可溶的生物活性形式。
(2)优化复性过程,将包涵体蛋白在体外复性得到生物活性蛋白。
包涵体蛋白复性的研究进展
包涵体蛋白复性的研究进展付明娟;林接玉(综述);谢捷明(审校)【摘要】Inclusion bodies are the inactive solid particles agglutinating by exogenous recombinant pro-tein in cells.After separation and washing to remove some pieces of membrane proteins or film,they can be dissolved by appropriate reagent,for example the buffer with high pH value and low concentration of urea, alcohol with different hydroxyl or denaturant containing small molecule .The renaturation efficiency traditional renaturation method such as dilution,dialysis is generally low.At present,we can improve refolding efficiency through high pressure, high throughput screening of zeolite and high-throughput screening combined with experimental design software.We wish to find an efficient renaturation method suitable for all recombinant proteins,so as to realize large-scale production of recombinant proteins which are difficult to obtain .%包涵体是指外源重组蛋白在细胞内凝集的无活性的固体颗粒。
包涵体蛋白的变复性研究
包涵体蛋白的变复性研究高永贵 关怡新 姚善泾(浙江大学化学工程与生物工程学系,浙江杭州 310027)摘 要:针对基因工程蛋白在 E.coli中表达多为无活性包涵体的特点,介绍了包涵体洗涤和去折叠的方法、蛋白质体外折叠的过程和机理、体外复性技术以及复性蛋白的检测,着重讨论了最近发展起来的蛋白质复性新技术.关 键 词:包涵体,去折叠,蛋白质复性中图分类号: 文献标识码:A 文章编号:1001-7119(2003)01-0010-06R efolding of G enetic E ngineering Protein Expressed as I nclusion BodiesG AO Yong-gui,GUAN Yi-xin,YAO Shan-jing(Depart.of Chem.and Biochem.Eng.,Zhejiang Univ.,Hangzhou310027China)Abstract:The genes,of interest are often expressed as inactive inclusion bodies in Escherichia coli,s o the methods for resus2 pending and un folding inclusion bodies,the pathway and technique of protein refolding in vitro and the determination of renatured protein was overviewed.Especially,the new technique of protein refolding recently developed was emphasized.K ey w ords:inclusion body;un folding;protein renaturation 随着基因工程技术的迅猛发展,人们越来越多地通过蛋白质的异源表达为临床和工业生产提供一些蛋白质多肽产品.迄今为止, E.coli以其易于操作、遗传背景清楚、发酵成本低和蛋白表达水平高等优点,依然是生产重组蛋白的首选表达系统,尤其适合表达不经过蛋白质翻译后修饰(如糖基化)就具有生物活性的基因工程蛋白.但是在 E. coli中表达的蛋白常常以包涵体的形式沉积于细胞内,表现为无活性的不溶性聚集物,如何高效地复性包涵体蛋白经常是基因工程技术面临的一个难题.随着人类基因组计划的完成和后基因组计划的实施,人们将会更多地面临这一问题的挑战.因此,本文将着重介绍包涵体蛋白的变复性技术及其最新研究动态,期望能有助于促进这一研究的深入和问题的早日解决.1 基因工程蛋白在 E.coli中的表达革兰氏阴性菌 E.coli被内膜(又称质膜)和外膜分隔成胞内、周质和胞外三个腔室,相应地在E.coli中表达的异源重组蛋白可定位于胞内、周质空间或胞外培养基中[1].有限的周质空间使得产物的表达量仅为0.3%～4%,同时产物容易发生二硫键错配,因此除了作为抗体基因表达的首选策略外,至今以周质分泌途径生产重组蛋白达到工业化规模的应用很少[2].细菌素释放蛋白(Bacterioncin release protein,BRP)系统和α-溶血素(Haem olysin A,HlyA)系统是目前两种主要使外源蛋白分泌到培养基的表达系统,但是前一系统的缺陷是BRP的诱导表达可能会影响工程菌的生长;后者的缺陷则在于融合蛋白C端的HlyA信号序列有时会干扰融 第19卷第1期2003年1月 科技通报BU LLETI N OF SCIE NCE AND TECH NO LOGYV ol.19 N o.1 Jan.2003收稿日期:2001-10-15;修订日期:2002-04-29基金项目:教育部留学回国科研启动基金及浙江省自然科学基金(201099)资助项目作者简介:高永贵,男,1971年生,湖北黄岗人,生物化学工程博士.合蛋白的生物活性,因此迄今只有少数重组蛋白可成功地利用 E.coli进行分泌表达[3].在胞内直接表达蛋白则是研究最早、采用最多的表达策略,目前已经积累了许多成功的经验.采用较强的启动子(如λP L、T7或串联启动子),外源基因可在胞内获得高效表达,一般占细菌总蛋白的10%～50%.胞内表达的最大问题是产物形成不溶性的包涵体,虽然这可为后续的分离纯化带来方便,但包涵体必须经过体外复性才有可能获得生物活性[1].2 包涵体的去折叠的,任何影响中间体稳定的因素(如pH值、离子强度、温度等)都可导致包涵体的形成.鉴于包涵体蛋白无活性及复性困难的缺点,在表达外源基因的同时,人们试图采用共表达分子伴侣或折叠酶以及调[1],但效果并不理想,因此面临的挑战是既能利用包涵体蛋白的高表达,又能对其进行很好地复性.为了成功地对包涵体蛋白复性,应先对包涵体进行分离纯化及去折叠(即变性溶解),然后采用合适的复性方法促进变性蛋白再折叠进而恢复活性.2.1 包涵体的分离纯化常用高压匀化或机械、化学和酶相结合的方法破碎含包涵体的宿主菌细胞,再将破碎液通过低速离心或过滤除去可溶蛋白后获得包涵体.包涵体中除了目的蛋白外还含有脂类、脂多糖、核酸和杂蛋白等其它成分,而这些成分会影响包涵体蛋白的复性,故去折叠前应洗涤包涵体,以去除杂质.常用E DT A、低浓度的变性剂(尿素、盐酸胍)、弱去污剂Trion X-100、脱氧胆酸等洗涤包涵体,洗涤后包涵体的主要成分为聚合态的目的蛋白[4].2.2 包涵体的去折叠极端pH值、高温、去污剂、高浓度的无机盐或有机溶剂均可用于溶解包涵体.从已发表的文献看,绝大多数是采用6m ol/L盐酸胍或8m ol/L脲并结合还原剂来溶解包涵体.但是高浓度的变性剂可能会严重破坏蛋白质的二级结构,产生不可逆变性,导致无法复性.因此,包涵体溶解时不仅要采用尽可能低的变性剂浓度,还要注重其它包涵体溶解方法的研究.极端pH和变温就被用来溶解包涵体,以替代高浓度的变性剂.G avit et al.采用低pH(≤2.6)和高温(85℃)溶解抗真菌重组肽的包涵体[5].高pH (≥12)结合低浓度的变性剂(如20%～40%异丙基或n-丙基乙醇溶液)用于溶解生长激素包涵体非常有效[6].去污剂用于蛋白质去折叠,其优点是蛋白质去折叠后即具生物活性.采用此方法洗涤包涵体时,应尽可能除去与膜结合的蛋白酶,避免包涵体溶解后即被降解;另外去污剂会干扰蛋白质下游层析过程,因此层析前必须除去复性混合物中的去污剂[4].当蛋白表达量很高时,包涵体的在位溶解质复性的收率下降[8].这些方法的选择与体系和基因工程蛋白的性质有关,虽然有许多方法可用来溶解包涵体,但不同溶解方法将极大地影响后续的复性和整个加工过程的成本,所以对具体的包涵体蛋白,进行去折叠过程的方法学研究仍具有实用价值.3 蛋白质体外折叠复性的过程 与机理 An finsen在研究RNase A时发现一种蛋白质的结构、稳定性和功能的全部信息均来源于其氨基酸组成和排列,多肽链的折叠是一个自发的过程,主要取决于给定氨基酸的序列[7].这一规律被称作生物体内的第二遗传密码.虽然第二遗传密码如何控制蛋白质高级结构形成的机制至今仍不明了,但已经清楚的是变性蛋白质的再折叠同时受热力学和动力学控制,三级结构形成的动力来自去折叠蛋白质暴露在外的疏水基团逐步被包埋而引起的自由能变化.常用图1所示的模型来描述蛋白质折叠的过程[8].在折叠起始阶段,去折叠蛋白质(U)的疏水性氨基酸暴露在分子表面,产生大量非极性基团,热力学的驱动力使它们聚集在一起形成幼稚的二级结构(I1…I i为中间态),幼稚的二级结构很不稳定,与U之间存在着平衡.在中间态I i向天然状态(N)转变过程中,存在更加有序、结构致密、几乎与天然态相似的熔球态(M olten globule,I n),I n与N之间存在着较大的自由能屏障,两者的转化是整个折 第1期高永贵等.包涵体蛋白的变复性研究11 叠途径的限速步骤.中间体正确折叠是分子内的一级反应,而中间体的聚集则是发生在分子间的二级或高级反应,中间体的浓度对聚集反应影响大,必须控制中间体的浓度以有利于反应向正确折叠的方向进行.变性蛋白质的空间结构被破坏,疏水侧链外露,而复性后的蛋白质具有致密的空间结构,疏水基团包埋使得蛋白质疏水性逐渐减小而亲水性增强,因此这一特性的变化对进行蛋白质复性方法学探究、建立监测蛋白质复性动态过程和复性蛋白质的定量分析大有裨益.图1 蛋白质再析叠的动态模型Fig.1K inetic m odel of protein refolding4 去折叠包涵体蛋白的体外 复性方法 包涵体蛋白的体外复性是基因工程蛋白生产过程中最关键和最困难的一步,已成为产业化的瓶颈之一.蛋白质体外复性的一般策略就是考虑影响复性收率的各种因素(如蛋白质浓度、温度、pH 值、适宜的氧化—还原体系等)和应用实际,尽量抑制蛋白质的聚集而促进折叠中间体向天然态的方向折叠.在实验室少量蛋白需要复性时,一般采用传统的稀释和透析复性,复性时蛋白质初浓度为10～100μg/m L 或更低,但工业上采用此复性方法需要很多的容器及大量的复性缓冲液,同时复性蛋白回收困难,因此,笔者着重探讨最近发展起来的包涵体复性技术,以促进这一问题的早日解决.4.1 分子伴侣介导的复性法分子伴侣(M olecular Chaperone )是抑制伸展肽链及部分折叠肽链的聚集、协助蛋白质折叠复性的一类蛋白,目前已经确认的分子伴侣主要为Hsp60、Hsp70以及Hsp90三个高度保守的家族.当变性蛋白进入分子伴侣中空环状的疏水空腔后,在空腔的“An finsen Cage ”分隔下可部分或完全避免蛋白分子间的聚集,使变性蛋白在疏水环境下进行“结合-释放-再结合”的循环直至恢复到天然构象状态,从而防止多肽链的错误折叠或聚集.分子伴侣与变性蛋白相互作用的特异性很低或不具特异性,这为体外分子伴侣介导的复性提供了更多的选择对象.剑桥大学Fersht et al.对分子伴侣介导的蛋白折叠复性的研究最为出色,他们不仅研究了分子伴侣G roE L 促进蛋白折叠的机理及高效复性的协同条件,如与G roES 配对使用、ATP 的需求,而且用E.coli 表达制备了起作用的Minichaperone(G roE L191-345片断),并建立了一套固定化的、可以循环使用的分子伴侣重折叠系统[9,10].该系统由固定在琼脂糖凝胶上的三部分组成,即能阻止蛋白聚合的Minichaperone (G roE L191-345)、能催化二硫键重排和形成的DsbA 以及起顺反异构作用的肽基脯氨酸异构酶(PPI ).用此系统对蝎毒Cn5进行复性,活性收率达87%,解决了蝎毒Cn5复性困难的问题.徐明波等利用PDI (二硫键异构酶)、PPI 和分子伴侣催化重组人I L -2和G M -CSF 包涵体的再折叠,也获得了较好的复性收率[11].天然分子伴侣来源有限,对那些价格相对低廉的蛋白质,人工分子伴侣的应用或许更具实际意义.David 和Samuel 研究发现采用小分子的去污剂和环糊精(β-C D )可引导蛋白质折叠,并把这些低分子量的助剂称为人工分子伴侣,其协助的蛋白质折叠过程为:先将高浓度的盐酸胍溶液快速稀释,去污剂捕获非天然状态的蛋白质形成蛋白质-去污剂复合物,从而阻止了蛋白质的凝聚,当加入环糊精使去污剂从蛋白质上剥离后,蛋白质就逐渐复性[12].最近,刘晓光等利用阳离子表面活性剂CT AB 和环糊精联合作用协助变性溶菌酶的复性[13],也取得较好的效果.分子伴侣的实用性取决于其稳定性、重复利用率及与复性蛋白分离的难易,固定化Minichaperone 技术及人工分子伴侣的应用是今后分子伴侣介导的复性方法的发展方向.4.2 反向微团复性法反向微团是由表面活性剂在有机溶剂中形成的水相液滴,微团中表面活性剂极性头部向内,疏水尾部向外.在含有增溶剂的水溶液中,将去折叠的蛋白引入到含有反向微团的溶液中时,蛋白将会插入到微团中,并与活性剂的极性头作用,逐渐进行复性.反向微团复性蛋白质的主要过程如图2所示,通过相转移使变性溶解的蛋白进入到反向微团中,然后交换缓冲液而逐渐降低反向微团中的变性剂浓度,同时加入氧化还原剂使变性蛋白的二硫键再氧化重排而获得天然构象,最后将复性蛋白从微团中抽提到水相溶液中.利用反向微团可使盐酸胍变性的RNase A 在24h 内获得100%的复性率[14],表明反向微团是一种很有前景的蛋白复性方法.要形成反向微团并促使变性蛋白进入微团内的条件苛刻,而微团内的微环境很难与蛋白质复性的最适 12 科 技 通 报19卷条件一致,因此该法的实际操作复杂,同时复性对象仅限极少数蛋白.图2 反向微团中的蛋白折叠技术更是日益备受关注.与传统的稀释法或透析法相比,层析折叠复性的优势在于:1)在进样后可很快脱除变性剂,操作效率高;2)层析固定相对变性蛋白的吸附可减少变性蛋白在脱除变性剂后形成聚集体,这不仅提高了蛋白质复性的活性收率,而且可提高蛋白质复性的初始浓度;3)在复性的同时可使目标蛋白与杂质分离,特别适合包涵体蛋白的复性;4)便于回收变性剂,以降低废水处理成本.目前,用于蛋白质复性的层析折叠复性法主要有凝胶G FC 基于蛋白质S tokes 半径的差异和凝胶排阻作用,通过“Bu fferExchange ”逐渐脱除变性剂而使蛋白质复性 操作简单,可对所有蛋白质进行复性,介质可多次使用,但易造成样品的过度稀释和引起柱堵塞,样品处理量较小,纯化效果稍差carbonic anhydrase E.coli integration host factor ,rhETS -1,RNase A Heterodimeric platelet -derived growth factor u -PA 171819HIC 基于蛋白质与介质的疏水性相互结合,实现蛋白质与极性变性剂的分离而促使蛋白质复性 复性与纯化的集成,同时可检测活性蛋白的量,但仅限部分蛋白的折叠分析,无工业应用实例,易造成柱堵塞rhIFN -γ,rhIFN -βRecombinant human G C -CSF2021IEC 蛋白质与介质间存在电荷作用力,梯度洗脱时脱除变性剂而逐步复性蛋白质 对蛋白质具有浓缩作用,柱容量高,但变性剂易在柱上保留而影响蛋白吸附,只限一些蛋白,介质较贵Papiloma virus HPVE7MS2fusion protein Recombinant human secretory leukocyte2223AFC 蛋白与配体的特异性亲和吸附,洗脱时使变性剂与蛋白分离,促使蛋白复性,固定化配体有金属、脂质体和分子伴侣 复性与纯化的集成,复性后蛋白浓度较高,但介质昂贵且寿命较短,仅限具H istine T ag 等少数蛋白rhPrion bovine carbonic anhydrase2425 蛋白质层析折叠复性是一种处于发展阶段的方法,不仅需要从理论方面对复性的机理进行深入研究,而且应该关注合成高性能(对蛋白质复性和分离效果好)价格比的层析介质的研究.无论如何,层析方法在蛋白质复性方面已发挥着越来越大的作用,尤其是操作简单的G FC 复性蛋白质技术,已被许多厂家大规模地应用于工业化生产.但液相层析技术用于蛋白质的复性,一个最为主要的问题就是复性过程中会产生蛋白质聚集体,这些聚集体沉聚在柱上造成堵塞,降低了分辨率,并引起柱压升高.谷振宇等人发展的一种脲梯度凝胶过滤复性蛋白质的新方法,即蛋白质在脲由高到低的无级变化浓度下逐渐复性,复性后再与脲等小分子变性剂分开,从而更好地避免蛋白质聚合[26],当然该法对操作和设备要求较高.笔者进行复性液中添加适量脲的凝胶复性溶菌酶的研究,结果表明,即使变性溶菌酶的初始浓度高达100mg/m L 也很少有蛋白质沉淀,同时采用等盐洗脱,操作简单.还可采用连续上样操作进而提高功效.4.4 其它复性方法近年来折叠促进剂协助的复性方法也取得长足发展.我们把能够促进蛋白再折叠的化学物质统 第1期高永贵等.包涵体蛋白的变复性研究13 称为折叠促进剂,折叠促进剂的作用原理在于稳定复性蛋白质的天然结构、优先去除错误折叠蛋白质的稳定性、增加折叠复性中间体的溶解性等,进而抑制或减少了导致蛋白质无活性的聚集.应用于蛋白质复性并具有显著效果的折叠促进剂有表面活性剂[27]、聚乙二醇(PFG)[28,29]、L-精氨酸[30]、抗体等[31].折叠促进剂协助的复性也存在溶液稀释的过程,因此与传统的稀释复性一样具有活性蛋白浓度低、目标产物回收困难的缺点,尤其是表面活性剂可与蛋白质结合或形成胶束,很难去除.虽然如此,但聚乙二醇还是一种较有前景的折叠促进剂. PEG不仅能显著增加包涵体蛋白的复性效率,同时还是双水相的成相聚合物,因此利用双水相技术可以实现蛋白质复性与分离的耦合.此外,由于分子印迹技术提供了制备具有分子识别功能的模板聚合物,所以利用这一模板,在缓慢复性的同时可分离变性态和天然态的蛋白质,避免蛋白质聚集,而且还可采用亲和折叠过渡态的模板,起到类似酶的诱导协和作用而促进蛋白质的折叠.迄今为止,虽然分子印迹技术主要用于分离,但分子印迹介导蛋白质复性的诱人前景值得人们探索.5 复性蛋白质的检测研究蛋白质的复性,必须建立适当的检测方法,以鉴定复性蛋白质的生化、免疫学、物性以及蛋白变性态与天然态的区别,从而对复性方法进行评价和条件优化.主要有:1)凝胶电泳 其中最为常用的是还原和非还原的S DS-PAGE,适于鉴定产物的纯度及复性蛋白质的聚集状态;2)光谱学方法 主要有紫外光谱、荧光光谱和圆二色谱C D等,这些方法可用来研究蛋白质分子复性过程中构象的变化,特别用于鉴定折叠中间体和复性蛋白质的构象[12].3)色谱学方法 近几年人们利用蛋白质天然态和变性态色谱行为的差异来研究复性并用于复性蛋白质的检测如天然态、变性及复性蛋白质、折叠中间体等SEC上色谱保留体积的差异[15,18],反相高效液相色谱(RP-HP LC)检测活性和变性重组人粒细胞集落刺激因子包涵体蛋白的含量进而监测复性动态过程[32];4)粘度与浊度 蛋白质折叠状态不同,其溶解性存在一定差异,从而影响其粘度的变化,因此可通过测定溶液的浊度(常以600或400nm的光吸收值表示)来反映蛋白质聚集的快慢与程度;5)免疫学方法 利用酶联免疫、蛋白印迹法可以测定不同状态蛋白质的抗体-抗原结合力的差异,从而说明其空间构象状态;6)生物学活性及比活性测定 这是作为对最后的折叠状态评价的一个重要指标,一般是通过采用动物或细胞模型直接测定复性蛋白质所具有的生物学效应来表示.6 结束语随着越来越多的功能基因被发现和克隆,蛋白质异源表达将会越来越受到重视,如何使表达产物具有生物活性是决定该产物能否服务于人类健康和上游生物学家的努力是否有意义的根本条件,因此蛋白质体内外折叠机理的差异和体外高效复性技术必将倍受关注.参考文献:[1] 龙建银,王会信.外源基因在大肠杆菌中表达的研究进展[J].生物化学与生物物理进展,1997,24(2):126～131.[2] Wulfing C,Pluckthun A.Protein folding in the periplasm ofEscherichia coli.[J].M ol M icrobiol,1994,12(5):685～692.[3] Blight M A,H olland I B.Heterologus protein secretion and the ver2satile Escherichia coli haem olysin translocator[J].T rends in Biotech, 1994,12(11):450～455.[4] De Bernardez Clark E.Protein refolding for industrial process[J].Current Opinion in Biotechnology,2001,12:202～207.[5] G avit P,Better M.Production of antifungal recombinant peptides inE schericia coli[J].J Biotechnol,2000M,79:127～136.[6] Patra A K,Mukhopadhyay R,Muhhija R,et al.Optimization of in2clusion body s olubilization and renaturation of recombinant human growth horm one from Escherichia coli.[J].Protein Express Purif, 2000,18:182～192.[7] An finsen C B.Principles that g overn the folding of protein chains[J].Science,1973,181:223～230.[8] G oldberg M E,Rudolph R,Jaenicke R.A kinetic study of the com2petition between renaturation and aggregation during the refolding of denatured-reduced egg white lys ozyme[J].Biochemistry,1991,30: 2790～2797.[9] Ralph Z ahn,Ashley M B,Sarah P,et al.Chaperone activity andstructure of m onomeric polypeptide binding domains of G roE L[J].Proc Natl Acad Sci US A,1996,93:15024～15029.[10] M yriam M A,C onsuelo G,Lourival D P,et al.Oxidative refoldingchromatography:folding of the scorpion toxin Cn5[J].NatureBiotechnology,1999,17:187～191.[11] 徐明波,孟文华,马贤凯.PDI、PPI和分子伴侣催化重组人I L-2和G M-CSF的再折叠[J].中国科学B辑,1994,24:717～723.[12] R ozema D,G allman S H.Artificial chaperone-assisted refolding of 14 科 技 通 报19卷Denatured-reduced lys ozyme:m odulation of the com petition be2 tween renaturation and aggregation[J].Biochemistry,1996,35:15760～15771.[13] 刘晓光,董晓燕.分子伴侣与蛋白质复性的简介[J].化学工业与工程,2000,17(2):120～124.[14] Hagen A J,Hatton T A,W ang D I C.Protein refolding in reversemicelles[J].Biotech and Bioeng,1989,35:955～965.[15] Batas B,Chaudhuri J B.Protein refolding at high concentration us2ing size-exclusion chromatography[J].Biotech and Bioeng,1996,50:16～23.[16] Batas B,Chaudhuri J B.C onsideration of sam ple application and e2lution during size-exclusion chromatography-based protein refold2 ing[J].J Chromatography A,1999,864:229～236.[17] W emer M H.Refolding proteins by gel filtration chromatography[J].FE BS Lett,1994,345(2):125～130.[18] Müller C,Rinas U.Renaturation of heterodimeric platelet-derivedgrowth factor from inclusion bodies of recombinant Escherichia coliusing size-exclusion chromatography[J].J Chromatography A,1999,855:203～213.[19] Fahey E M,Chaudhuri J B.Refolding of low m olecular weighturokinase plasminogen activator by dilution and size exclusion chro2matography-a com parative study[J].Separation Science andT echnology,2000,35(11):1743～1760.[20] G eng X D,Chang X Q.H igh-performance hydrophobic interactionchromatography as a tool for protein refolding[J].J Chromatogra2 phy,1992,599:185～194.[21] Liu T,G eng X D.The separation efficiency of biopolymers withshort column in liquid chromatography[J].Chinese Chemical Let2ter,1999,10(3):219～212.[22] Suttnar J.Procedure for refolding and purification of recombinantfrom Escherichia coli inclusion bodies using a strong anion exchanger[J].J Chromatography B,1994,656(1):123～126.[23] Hamaker K H.Chromatography for rapid bu ffer exchange and refold2ing of secreatory leukocyte protease inhibitor[J].Biotech Prog,1996,12(2):184～189.[24] Z ahn R.Human prion proteins expressed in Escherichia coli and pu2rified by high affinity column refolding[J].FE BS letters,1997,417(3):400～404.[25] Y oshim oto M.Imm obilized lipos ome chromatography for studies ofprotein-membrane interactions and refolding of denatured bovinecarbonic anhydrase[J].J Chromatography B,1998,712:59～71.[26] 谷振宇,苏志国.蛋白质的层析折叠复性[J].化工学报,2000,51(S):325～329.[27] Z ardeneta G,H orowitz P M.Detergent,lipos ome and micelle-as2sisted protein refolding[J].Anal Biochem,1994,223:1～6. [28] Cheland J L,Builder S E,S wartz J R,et al.P olyethylene glycolenhanced protein refolding[J].Bio/T ech,1992,10:1013～1019.[29] 凌明圣,许祥裕,施凤霞,等.聚乙二醇增加重组人粒-单系集落刺激因子复性效率的研究[J].药物生物技术,1997,4(1):5～8.[30] K ohno T,Carmichael D F,S ommer A,et al.Refolding of recom2binant proteins[J].M ethods Enzym ol,1990,185:187～195. [31] Carls on J D,Y armush ML.Antibody assisted protein refolding[J].Bio/T ech,1992,10:86～91.[32] 钟 英.RP-HP LC监测重组人粒细胞集落刺激因子复性动态过程[J].中国药学杂志,1999,34(12):834～836.【上接第9页】参考文献:[1] Hayashi T.Research and development of micromechanisms[J].Ul2tras onic,2000,38(1):6～14.[2] K iy oshi I.A m obile micro-robot using centrifugal forces[A].IEEE/AS ME Int C on f on Advanced Intelligent M echantronics[C].Atlanta,US A,1999,736～741.[3] H irofumi M,T akashi Y,Isao S.Insect-m odel based microrobot[J].R obotics and Autonom ous Systems,1997,21(3):317～322.[4] Hayashi I,I watsuki N.M icro m oving robotics[A].IEEE MHS’98[C].日本名古屋,1998,41～50.[5] Y amaguchi T,K agawa Y,Hayashi I,et al.Screw principle micro2robot passing steps in a small pipe[A].IEEE MHS’99[C].Nag oy2 a,Japan,1999.149～152.[6] G uo S X,Fukuda T,Oguro K.Development of an artificial fish mi2crorobot[A].IEEE MHS’99[C].日本名古屋,1999,135～140.[7] Ikuta K,N okata M.T w o-lead-wire drive for multi-micro actua2tor[A].IEEE Int C on f on R obotics&Automation[C].Detroit, M ichigan,1999,2378～2384.[8] Ishiyama K,Arai K I.S piral-type micro-machine for medical ap2plications[A].IEEE MHS’2000[C].日本名古屋,2000,65～69.[9] Zhou Y S,He H N.S tudy on the locom otion speed of intestine robot[J].T ribology,1999,19(4):299～303(in Chinese).[10] Lkeuchl K,Y oshinaka K,Hashim oto S,et al.Locom otion of med2ical micro robot with spiral ribs using mucus[A].IEEE MHS’96[C].日本名古屋,1996,217～222.[11] Paolo D,M aria C C.A m obile microrobot actuated by a new elec2tromagnetic w obble microm otor[J].IEEE/AS ME T ran.on M echa2 tronics,1998,3(1):9～16.[12] Nishikawa H,Sasaya T,Shibata T,et al.In-pipe wireless microlocom otive system[A].IEEE MHS’99[C].Nag oya,Japan.1999,141～147.[13] Shibata T,Sasaya T,K awahara N.M icrowave energy supply systemfor in-pipe micromachine[A].IEEE MHS’98[C].日本名古屋,1998,237～242.[14] E llenby S B.Safety issues concerning medical robot[A].IEEC oll.on Safety and Reliability of C om plex R obotic System[C].London,UK,1994,3/1-3/4. 第1期高永贵等.包涵体蛋白的变复性研究15 。
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中国生物工程杂志 China B i otechnol ogy,2009,29(7):102～107包涵体蛋白的分离和色谱法体外复性纯化研究进展3王 增1 马会勤1 张 文1 陈尚武233(1中国农业大学农学与生物技术学院 北京 100193 2中国农业大学食品科学与营养工程学院 北京 100083)摘要 重组蛋白在大肠杆菌中表达多为无活性的包涵体形式,须经洗涤、溶解、复性后才能得到生物活性蛋白。
综述了近年来包涵体蛋白分离纯化和复性技术研究进展,重点讨论了色谱法复性技术的应用,包括尺寸排阻色谱、亲和色谱、离子交换色谱、疏水相互作用色谱、固定化脂质体色谱、扩张床吸附色谱的进展情况。
关键词 包涵体 纯化 色谱 复性中图分类号 Q816收稿日期:2008210220 修回日期:20092022193国家自然科学基金资助项目(30500347&30471212)33通讯作者,电子信箱:s wchen@cau .edu .cn 随着基因重组技术的发展及越来越多的功能基因被发现和克隆,蛋白质异源表达已被广泛应用。
大肠杆菌因遗传背景清楚、成本低、操作简单,且能高效表达外源基因等特点,是基础研究、临床应用及工业生产蛋白和多肽的首选表达系统。
然而,重组蛋白在大肠杆菌中表达经常形成无活性的不溶性聚集物即包涵体。
包涵体的形成有一定的优势,如具有高蛋白密度、易分离、易于毒性蛋白和宿主细胞致死蛋白表达等特点[1～3]。
因此,如何将包涵体蛋白转变为具有活性的可溶蛋白是备受关注的问题。
从包涵体中获得天然活性的重组蛋白一般包括三个步骤:包涵体的分离和洗涤、包涵体的溶解、包涵体蛋白的复性。
本文综述了近年来包涵体蛋白分离纯化和色谱法复性技术研究进展,期望包涵体蛋白体外折叠这一难题早日解决。
1 包涵体的形成和分离1.1 包涵体的形成 重组蛋白不论在原核细胞还是真核细胞中表达时,都可形成包涵体[4]。
通常所说的包涵体是指重组蛋白在大肠杆菌中高效表达时形成的无活性蛋白聚集体,一般含有50%以上重组蛋白,其余为核糖体组分、RNA 聚合酶,外膜蛋白等杂蛋白,以及质粒DNA 、RNA片断、脂质、肽聚糖、脂多糖等成分[5,6]。
由于包涵体在相差显微镜下为黑色斑点,所以也称为折射体(Refractile body )[7]。
包涵体形成的原因主要有以下几点:⑴蛋白合成速度太快,以致于没有足够的时间进行折叠。
蛋白折叠的动力学模型表明:蛋白质天然构象形成的速率取决于肽链的合成速率、折叠速率和聚集速率几个因素。
中间体正确折叠是分子内的一级反应,而中间体的聚集是发生在分子间的二级或高级反应,因此,折叠中间体的浓度对聚集反应影响非常大[8];⑵重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白,由于缺少真核生物的翻译后修饰系统(如糖基化等),致使中间体大量积累,容易形成包涵体[9];⑶培养条件不佳和重组蛋白所处的环境也可导致包涵体形成,如发酵温度高,胞内pH 接近蛋白的等电点等[10];⑷二硫键在蛋白折叠中有重要作用,而大肠杆菌胞内的还原环境不利于二硫键的形成[2];⑸包涵体不溶可能由于分子间无活性的β2片层含量高于天然结构或盐沉淀蛋白[11]。
包涵体蛋白虽然不具有天然结构、没有活性,但在基因工程中生产重组蛋白,包涵体的形成有一定优势,主要表现在:⑴重组蛋白高水平表达,有时候可达细胞总蛋白的30%[2];⑵包涵体密度高(约1.3mg/m l )[12],重组蛋白相对较纯,很容易与细胞成分分离,可减少后续纯化步骤;⑶包涵体结构致密,因而在一定程度上避免了大肠杆菌蛋白酶的降解;⑷易于毒性蛋白和膜蛋白表达[3,8];⑸包涵体的形成降低了重组蛋白在胞质中的浓度,有利于目的基因的进一步表达。
基于这些特点,重组蛋白的包涵体表达已在商业化生产中得到广2009,29(7)王 增等:包涵体蛋白的分离和色谱法体外复性纯化研究进展泛应用[9]。
1.2 包涵体的分离和洗涤 表达重组蛋白的宿主细胞通常在低温条件下用高压匀浆或超声进行破碎,或者用机械、化学与酶相结合的方法破碎。
破碎大肠杆菌有效的方法是溶菌酶(1mg/m l)结合超声波进行处理。
需要的注意的是控制超声功率和时间,超声不足不能完全释放重组蛋白,而超声时间太长或功率太大,会使蛋白炭化。
由于包涵体具有很高的密度,细胞破碎液通过低速离心(或者梯度低速离心)[13]、过滤[14]即可除去可溶性蛋白和部分细胞碎片,达到收集包涵体目的。
包涵体中除目的蛋白外,还有少量脂类、核酸、多糖和其它杂蛋白等,这些成分会影响目的蛋白的纯化和复性,因此在包涵体蛋白去折叠前应先洗涤包涵体。
常用EDT A、低浓度变性剂(如尿素、盐酸胍)、弱去污剂(如Triton X2100、辛烷基葡糖苷、脱氧胆酸盐)、还原剂(如二硫苏糖醇DTT、β2巯基乙醇)等[15,16]。
伴随着细胞破碎而释放的膜蛋白必须除去,例如大肠杆菌外膜蛋白OmpT(37kDa在8mol/L尿素中仍具有蛋白水解酶活性[17],如果洗涤不充分,则有可能在包涵体的溶解和复性过程中降解重组蛋白质,而且洗涤得到较纯的包涵体可简化后续色谱纯化的步骤。
因此包涵体的洗涤非常重要,不可忽视。
包涵体蛋白分离纯化步骤复杂繁多,为了避免繁琐的操作,Gu等[13]用凝胶过滤方法实现了对原核表达的ScFV52P包涵体蛋白的分离和洗涤。
也可采用原位溶解(in situ s olubilization)包涵体的处理方法,即用化学试剂或酶直接从发酵液里的细胞中溶解释放包涵体蛋白[18]。
将发酵液中的包涵体蛋白质原位溶解后,可以用超滤[19,20]、双水相萃取[21]等选择性萃取,或扩张床色谱[22,23]等选择性捕集,或在高电场下使目的蛋白吸附在磁性微球上[24]等方法,可以除去细胞碎片和宿主细胞蛋白,使得目的蛋白得到部分纯化。
但这种原位溶解的方式并不常见,它会使发酵液中的蛋白质和其他细胞内杂质都释放出来,不仅影响包涵体蛋白的后续纯化和复性,也对目的蛋白的表达水平提出了更高的要求[9]。
2 包涵体蛋白的溶解和去折叠 溶解包涵体目前最常用的方法是用变性剂如尿素(6～8mol/L)或盐酸胍(4～6mol/L)溶解,它们对蛋白质的氢键有较强的可逆性变性作用,可破坏蛋白质高级结构,或伸展肽链分子之间的相互作用,使其去折叠。
尿素具有不电离、成本低、可直接进行S DS2PAGE 检测以及溶解的包涵体蛋白可选用多种色谱法纯化等优点被广泛应用,但尿素容易析出,作用时间较长或温度较高时会对蛋白质进行共价修饰。
盐酸胍溶解包涵体能力较尿素强,作用快而不修饰蛋白,但成本高,酸性条件下易沉淀,还干扰离子交换色谱等。
一般来说,用低浓度变性剂溶解包涵体得到的可溶性蛋白纯度比高浓度变性剂溶解的高,是因为变性剂浓度高时胞质颗粒蛋白也被释放出来[9]。
包涵体溶解还可添加去污剂[23,25]、还原剂[15,26]、螯合剂[26]等,或在极端pH、高温条件下进行[18]。
各种去污剂如S DS,CT AB,T ween20,NP40, Triti onX2100,Sarkosyl(月桂酰2N2甲基氨基乙酸钠)等常被用来溶解包涵体是因为其作用比盐酸胍和尿素更温和,溶解的蛋白质具有更多的有序结构,可能已经具有生物活性,避免了复性中的错误折叠。
但是使用去污剂作为溶解剂可能会干扰后续纯化步骤[9]。
对于含有半胱氨酸的重组蛋白质,分离到的包涵体中常含有一些链间和链内非活性的二硫键,因此还原剂的使用非常重要。
常用的还原剂有DTT、DTE、GSH、β2巯基乙醇,还原剂可以过量,以保证半胱氨酸还原完全。
EDT A,EGT A等鳌合剂也被用来阻止金属离子催化的空气氧化反应,硫化物的形成或二硫化物混和物也可保护被还原的半胱氨酸[27]。
利用极端pH也可溶解包涵体。
Gavit等[18]将低pH(≤2.6)和高温(85℃)相结合,并通过在位溶解的方式溶解抗真菌重组多肽包涵体。
3 包涵体蛋白的色谱法体外折叠复性 用变性缓冲液将难溶的包涵体溶解后,可根据重组蛋白分子大小、等电点、疏水性、溶解度和与其他物质的亲和性等特征,选择合适的方法进行进一步纯化和体外折叠复性。
用于包涵体蛋白质复性的方法有稀释、透析、超滤、色谱、高压等。
近年来发展起来的色谱法已成为基因重组蛋白质复性的重要手段[28]。
用色谱法进行蛋白质复性可以有效地防止变性蛋白分子聚集,提高蛋白质的活性回收率。
更大的优势是实现了蛋白质在复性的同时得到纯化,打破了必须先纯化再复性的限制,这是其他方法无可比拟的。
用于蛋白质复性的液相色谱301中国生物工程杂志China B i otechnol ogy Vol.29No.72009法主要包括尺寸排阻色谱(size exclusion chromat ography,SEC)、亲和色谱(affinity chromat ography,AFC)、离子交换色谱(ion2exchange chromat ography,IEC)、疏水相互作用色谱(hydophobic interaction chr omatography,H I C)和扩张床吸附色谱(expanded bed adsor p ti on chromat ography,EBA)等。
3.1 尺寸排阻色谱(SEC) 自从利用SEC对蛋白复性的首次报道[29]以来, SEC已是目前研究最多的一种色谱复性方法之一。
SEC是根据蛋白分子的流体力学体积大小进行混合物分离的手段。
与天然活性蛋白相比,变性蛋白的动力学水合半径较大,只能进入凝胶颗粒间的空隙,而不能进入凝胶颗粒内部的孔,因此迁移速度快。
而变性剂由于动力学水合半径小,可进入凝胶颗粒内部的孔,迁移速度慢。
因此当变性蛋白质通过色谱柱时,变性剂浓度不断减小,最后和流动相达到平衡,从而促使蛋白开始折叠。
多肽链折叠成紧密的与天然结构相近的结构后,可以进入凝胶颗粒的孔中,迁移速度开始变慢。
当蛋白质复性完全时,其半径不再变化,因此最后被洗脱下来。
Gu等[30]在前人工作的基础上提出了一种改进的SEC复性方法,即采用脲梯度SEC复性法,线性降低变性剂浓度,从而避免了脲浓度太低引起的蛋白质分子聚集和脲浓度太高而难以复性。
这种脲梯度SEC对溶菌酶复性,浓度可高达16.9mg/m l。
与脲梯度相比,pH 和脲浓度双梯度SEC法对ScF V52P的复性率可提高约10%[13]。
L iu等[31]提出了伴侣溶剂塞SEC复性法,对溶菌酶在复性中聚集有很好的抑制效应。
新发展起来的连续基质辅助蛋白折叠[19]和模拟移动床色谱[32],可以用于连续模式的蛋白复性,可能对工业化生产有一定应用前景。
3.2 亲和色谱(AFC) 亲和色谱是基于固定相的配基与生物大分子之间生物亲和能力的不同来进行生物大分子相互间分离的方式。