循环肿瘤细胞基本生物学行为及检测技术_马富玲

1869年，澳大利亚医生Ashworth ［1］初次提出循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs ）的概念。

CTCs 作为一种“液体活检”标本在肿瘤的临床意义
已被明确证实［2，3］。

随着研究不断深入，CTCs 的许
多特征如上皮间质转化、异质性及循环肿瘤干细胞等被发现。

本文就CTCs 的基本生物学行为、检测技术进行阐述。

1
循环肿瘤细胞基本生物学行为
细胞自原发灶脱落进入外周血循环系统并在远处组织、器官增殖形成转移灶，这部分进入循环系统的细胞即称之为循环肿瘤细胞CTCs ［4］。

由于检测技术的限制，过去尚不能检测到或只能通过有创性检查手段才可检出，因此CTCs 一直未引起重视［5］。

随着检测技术的不断发展，对其转移机制的研究也不断深入。

临床上许多患者发现肿瘤时已属晚期，严重影响了患者的预后；另有一部分患者
虽属早期，但在原发灶切除后不久却出现了转移和复发，这些都与CTCs 密切相关。

浸润、转移和复发是恶性肿瘤发展的标志，其机制非常复杂。

整合蛋白和钙粘连蛋白在生理条件下将上皮细胞与上皮细胞及细胞外基质紧密相连，因此上皮细胞之间连接十分稳定。

然而，间叶组织间由于缺乏上述紧密连接而不稳定。

在肿瘤细胞进入脉管系统之前，肿瘤细胞之间失去正常条件下细胞间的紧密连接，而表现出更多间叶组织细胞的特征即上皮-间叶转化（epithelial mesenchymal
transition，EMT ）
［6］。

CTCs 同时表达上皮和间叶两种组织标记物：在细胞解离过程中，CTCs 下调上皮组织特定标志物如细胞角蛋白和上皮细胞粘附分子，同时上调间叶组织标记物如波形蛋白的表达，这有利于细胞逃离原发灶进入血液循环［7］。

EMT 这一特性对现存的一些CTCs 的检测方法有着重要的影响。

例如针对上皮细胞表面标记物的检测方法就无法检测到发生
［收稿日期］2016-05-05；［修回日期］2016-07-15
［作者简介］马富玲，博士，主要研究循环肿瘤细胞筛查、临床意义。

循环肿瘤细胞基本生物学行为及检测技术
马富玲（天津医科大学第二医院，天津
300211）
摘要：循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)是脉管中的肿瘤细胞，被认为是肿瘤血液转移的关键步骤之一。

循环肿瘤细胞的检测对于肿瘤的诊断、治疗和预后判定都具有非常重要的意义，因其稀缺性及异质性其检测方法一直是肿瘤研究的热点。

本文从CTCs 生物学行为、检测方法方面综述了CTCs 临床应用的最新研究进展。

关键词：循环肿瘤细胞；生物学行为；检测；临床意义【文章编号】2095-3720（2016）09-0764-05
【中图分类号】R73
【文献标志码】B
Basic biological behaviors and detection technology of circulating tumor cells
MA Fu-ling (Tianjin Medical University Second Hospital,Tianjin 300211,China)
Abstract:Circulating tumor cells (CTCs)are the tumor cells in vessel,and considered as the key step in tumor blood metastasis.Detection of CTCs in cancer patients plays very important roles in diagnosis,treatment and prognosis.The heterogeneity and scarcity of CTCs make it very difficult in detection.In this paper,we reviewed the latest research progress in basic and clinical applications of CTCs.
Key words:Biological behaviour；Detection；Clinical significance;Circulating tumor cell
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综述
DOI:10.16548/j.2095-3720.2016.09.023
2016年9月Journal of Logistics University of PAP（Medical Sciences）Sep.2016
EMT转化的CTCs，未检出率可达38%～40%，然而该部分“隐蔽细胞”且更易形成转移灶，并且与疾病预后息息相关［8］。

Aktas采用逆转录PCR发现在转移性乳腺癌患者CTCs表面EMT相关标志分子如Twist1、蛋白激酶B、磷脂酰肌醇-3激酶α均有不同程度表达［9］。

Rossi E通过动物实验首次证明Ep-CAM（epithelial cell adhesion molecule）高表达的CTCs更具侵袭性［3］。

对于经血行转移形成的转移瘤，CTCs在诱导转移瘤形成的过程中扮演了重要角色。

CTCs形成转移灶需经历3个步骤：粘附、穿壁和定植。

肿瘤细胞进入循环系统后由于肿瘤细胞自身因素（缺乏变形能力不能顺利通过血管，或缺乏形成癌栓能力、宿主的免疫识别及机械损伤），绝大多数在极短时间内死亡，只有极少数细胞可存活下来，它们逃脱免疫机制不断增殖，并最终发展为转移灶［11］。

目前不仅在晚期肿瘤患者的外周血中能发现CTCs，某些肿瘤比如早期乳腺癌，早期肺癌、隐匿期肿瘤患者的外周血中也能发现CTCs，这种现象说明在现有检查方法发现肿瘤之前就有CTCs进入血液，因此对于这部分患者应高度重视。

与原发肿瘤及转移灶内肿瘤细胞一样，CTCs具有明显异型性，包括细胞体积增大、核浆比例失调且染色质呈细颗粒状或斑点状、增殖活力强、癌基因及特异标志物高表达等。

Meng等研究发现，CTCs 的核浆比例明显高于正常血白细胞（0.8±0.1vs 0.55±0.05，P<0.001），CTCs的直径（29.8±6.5）μm 较原发肿瘤（32.0±5.8）μm或转移灶（33.9±8.3）
μm中的肿瘤细胞小，但远较白细胞大很多，提示肿瘤负荷和治疗状况影响CTCs［12］。

为了探究存活下来CTCs的增殖活性，El-Naggar AK等使用流式细胞术对肾癌患者研究分析，证明进入外周血CTCs大多处于凋亡状态，仅有少数处于高增殖状态并形成转移灶，存活下来的肿瘤细胞具有高度增殖潜能［13］。

Kallergi等对转移性乳腺癌患者血标本检测后发现，CTCs可表达血管内皮生长因子、缺氧诱导因子1α和粘着斑激酶等多种关键成分，参与肿瘤血管生成［14］。

在转移灶形成过程中，新生血管不仅能为细胞提供营养，而且内皮细胞还可分泌多种生长因子促进肿瘤生长。

一般来说，原发灶对人体危害程度并不高，但转移瘤却可影响人体主要器官功能导致患者死亡，因此，在原位癌治疗后，对转移癌也不能忽视。

研究发现原发和转移性前列腺癌患者5年平均生存率分布为100%和28%［14，15］。

既往研究认为外周血中呈现CD45-/Ep CAM+/CK+的细胞即CTCs，与肿瘤患者预后密切相关。

但事实上，少数具备肿瘤干细胞潜能形亚群的细胞（circulating tumor stem cell，CTSC）在微环境适宜时可能才是最终形成转移灶的根本所在，因此CTSC的检测更具有临床意义。

Reube等发现约60%的CTCs表达与干细胞相关基因NOTCH1［16］。

Theodoropoulos等发现在乳腺癌患者外周血CTCs中也存在另一部分CD44+/CD24-低表达的CTSC，提示CTSC也存在异质性［17］。

张秀珍等认为CTSC标记物CD44、CD133连合CD45、Ep-CAM可作为CTSC的检测指标，对患者的预后判断疗效监测具有重要意义［18］。

2循环肿瘤细胞的分离和鉴定
近年来伴随现代生物学技术的不断进步，免疫磁珠、多色荧光标记和生物细胞分选芯片等细胞分选技术己经能够准确、快速的分离外周血中的肿瘤细胞。

CTCs检测一般包括细胞富集和细胞鉴定，二者均较复杂且技术要求相对较高。

2.1循环肿瘤细胞富集技术
密度梯度离心法根据各种细胞的密度不同，用1.077g/ml的密度梯度把单核细胞和肿瘤细胞从其它血细胞中分离出来。

OncoQuick系统使分离出的肿瘤细胞更加纯化，提高了CTCs的检出率。

该方法优点是基于细胞物理学特性的富集技术为下一步的形态学、细胞学及分子生物学研究提供了条件，对人员操作水平要求不高且经济实用，局限性在于多次离心可造成CTCs的破坏和丢失［19］。

Pachmann K比较了密度梯度离心法和红细胞裂解液这两种方法富集肿瘤细胞的效率，其敏感度相对不足且依赖于细胞的特性、离心时间、温度等多种因素［20］。

膜滤过技术（Isolation by Size of Epithelial Tu-mor cells，ISET）依据肿瘤细胞与白细胞大小的不同，用直径8μm孔径的聚碳酸酯膜将二者分离，直径大于8μm的肿瘤细胞留于膜的表面。

此方法可达到从每毫升全血中检测到1个CTCs的敏感性，且能够检测到CTCs微栓子。

该方法具有敏感性高、破坏性低等优势。

分离到的CTCs具有活性，能较好保持CTCs遗传学、免疫化学等特性；其局限性在于由于细胞异质性，CTCs大小并不完全一致，不能检出
体积小的肿瘤细胞，不能富集所有CTCs。

免疫磁珠分选法（magnetic activated cell sorting，MACS）将肿瘤细胞与其他细胞分离是利用包被了抗体的磁珠结合分离细胞上的蛋白质抗原，形成抗原--抗体-磁珠免疫复合物，在磁力作用下发生移动而实现的。

MACS分为正选法和负选法：正选法即分离得到的就是目的细胞；负选法即富集不需要细胞，剩下的就是目的细胞。

二者富集效率不同：正选法可对CTCs进行103~1.5×l05倍的富集［21］；负选法只进行3~4倍的富集，二者结合可提高检测的敏感度。

该法具有特异性高、富集效率高并可计数等优点，不足之处在于可能导致部分尤其是高侵袭性CTCs如经历EMT转化细胞的丢失［22］；价格比较昂贵、技术要求较高且缺乏特异性标志物。

2.2循环肿瘤细胞检测技术
免疫细胞化学法（Immunocytochemistry，ICC）的基本原理是通过不同的显色剂对抗体进行标记，在细胞原位利用抗原与抗体的特异性使二者相结合，再进行定位、定性及定量检测。

ICC结果易受实验条件、抗体质量等干扰产生假阳性以及需要待检测肿瘤细胞抗原表达较丰度。

其优点在于肿瘤细胞完整，可进行后续形态学或核酸分析，但对于不表达特异性上皮标志物的肿瘤限制了其应用［23］。

流式细胞术（flow cytometry，FCM）基本原理是将嵌有荧光物的抗体与细胞标记物结合，用流式细胞仪对悬液中的细胞或亚细胞结构进行快速分选的新型技术，特点是检测速度快，能够计数细胞数并可同时进行多参数测量。

缺点是在很大程度上检测结果依赖于样本体积，且无法对细胞进行形态学分析。

激光扫描计数仪是一种新型流式细胞仪，发挥FCM优势的同时兼具图像分析功能，已成为新一代强有力的研究工具。

建立了ISET联合LSC检测模型并应用于乳腺癌患者，CTCs平均检出数为3.76个／7.5ml，临床分期与CTCs检出数、检出率有一定相关性，证明ISET联合LSC检测CTCs敏感性、特异性高［24］。

聚合酶链反应（po1ymeraseehainreaetio，PCR）的原理是特异性扩增出肿瘤细胞中异常DNA的依赖DNA聚合酶的酶促反应，需要引物、模板DNA和四种脱氧核糖核苷酸。

RT-PCR技术是在之前技术基础上扩增逆转录的DNA片段，来间接证实肿瘤细胞的存在。

Kopreski采用RT-PCR法在黑色素瘤患者
的血浆中成功证实了酪氨酸酶mRNA的存在［25］。

之后又发明了实时定量、荧光定量逆转录多聚酶链反应等，具有多种优点，是目前检测CTCs最敏感的方法。

但此方法也存在一定局限性如选择合适的靶基因比较困难，样本污染易出现假阳性结果［26］，癌细胞的异质性亦可出现假阴性。

2.3富集技术与检测技术联合
目前检测CTCs大部分采用多种方法的联合，常见的有ISET+PCR、MACS+RT-PCR、MACS+ICC。

Pinzani P等［27］应用ISET+PCR技术检测41例黑色素瘤患者，结果20例患者酪氨酸酶mRNA增加，增加的程度可作为肿瘤细胞数目的一个间接指标。

Mo-hamed，SN等为了证实CTCs在结肠癌预后与诊断中的作用，首先采用ISET富集肿瘤细胞，然后对富集的肿瘤细胞行等位基因特异性PCR扩增，大大提高了外周血肿瘤细胞的检出率，证实二者有效结合可以提高CTCs的敏感性［28］。

Cell search系统是基于MACS+ICC组合，是目前国际上唯一认可的检测技术。

Cristofanilli等应用Cell Search技术对117例转移性乳腺癌患者进行研究（≧5个CTCs/7.5ml作为CTC升高的指标），结果治疗前CTCs升高的患者无进展生存期和总生存期较CTCs阴性的患者明显缩短［29］。

Khoia L等应用Cell Search系统探索了101例转移性黑色素瘤患者CTCs作为预后和药效生物标志物的准确性，多参数分析得出治疗期间CTCs持续
≥2的患者较CTCs<2的患者总生存期明显缩短（P= 0.015<0.05），认为治疗前后CTCs的变化可以作为患者预后的一个指标［30］。

Gou等联合应用MACS+RT-PCR技术对25例结肠癌患者进行了评价，采用CD45阳选和+Ber-EP4阴选富集CTCs，并以RT-PCR法进行CD20mRNA检测，平均阳性率为76%（19/25），在Dukes B，C，D的阳性率分别为25.0%（1/ 4）、83.3%（10/12）和88.9%（8/9），MACS可以达到在1ml血中检测到1个肿瘤细胞的敏感性［31］。

上述结果表明不同种类的方法的合理组合搭配可以提高肿瘤细胞检测的特异性和敏感性。

2.4其他
有报道将基于肽配体的癌细胞检测方法、CTCs 芯片、光导纤维阵列扫描技术、酶联免疫斑点实验，镭射扫描细胞计数器、寡核苷酸微阵列、比较基因组杂交技术等用于CTCs的检测。

Aggarwal报道了适合上皮组织的肽配体序列：QMARIPKRLARH，并
2016年9月Journal of Logistics University of PAP（Medical Sciences）Sep.2016
在不同细胞系中得到了证实，基本原理是CTCs的选择性与高亲和力的肽配体的结合，这种方法仅适用于具有肽配体的肿瘤类型［32］。

Nagrath等应用标记了EpCAM的CTCs芯片对接受标准化辅助治疗的肿瘤患者连续检测，发现CTCs数目随着治疗进程和疾病进展不断变化，说明CTCs芯片敏感性较高，可用于监测治疗效果和疾病进展［33］。

多种新技术可从单细胞水平了解CTCs基因表达特征，为恶性肿瘤临床分期、诊断、个体化治疗等提供了新的依据［34，35］。

3结论
肿瘤细胞进入血液循环是肿瘤转移第1步，因此将来有望将CTCs作为判断预后的关键性标志物。

通过分析CTCs基本生物学行为将有助于对肿瘤转移规律的正确认识、揭示很多微妙现象如肿瘤什么阶段转移、转移到什么器官，CTCs与CTSC的特征和表征的不同以及二者谁才是转移瘤真正的始动者等前沿问题，然而，在CTCs成为一种常规检查手段之前，尚有一些问题需要解决：如何全面阐述其分子特征；如何进一步提高外周血中CTCs的富集效率；如何鉴定那些具有高度转移潜能的CTCs，并分析其基因序列等。

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（责任编辑：董瓅瑾）。