循环肿瘤细胞基本生物学行为及检测技术_马富玲

1869年，澳大利亚医生Ashworth ［1］初次提出循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs ）的概念。CTCs 作为一种“液体活检”标本在肿瘤的临床意义

已被明确证实［2，3］

。随着研究不断深入，CTCs 的许

多特征如上皮间质转化、异质性及循环肿瘤干细胞等被发现。本文就CTCs 的基本生物学行为、检测技术进行阐述。1

循环肿瘤细胞基本生物学行为

细胞自原发灶脱落进入外周血循环系统并在远处组织、器官增殖形成转移灶，这部分进入循环系统的细胞即称之为循环肿瘤细胞CTCs ［4］。由于检测技术的限制，过去尚不能检测到或只能通过有创性检查手段才可检出，因此CTCs 一直未引起重视［5］。随着检测技术的不断发展，对其转移机制的研究也不断深入。临床上许多患者发现肿瘤时已属晚期，严重影响了患者的预后；另有一部分患者

虽属早期，但在原发灶切除后不久却出现了转移和复发，这些都与CTCs 密切相关。

浸润、转移和复发是恶性肿瘤发展的标志，其机制非常复杂。整合蛋白和钙粘连蛋白在生理条件下将上皮细胞与上皮细胞及细胞外基质紧密相连，因此上皮细胞之间连接十分稳定。然而，间叶组织间由于缺乏上述紧密连接而不稳定。在肿瘤细胞进入脉管系统之前，肿瘤细胞之间失去正常条件下细胞间的紧密连接，而表现出更多间叶组织细胞的特征即上皮-间叶转化（epithelial mesenchymal

transition，EMT ）

［6］

。CTCs 同时表达上皮和间叶两种组织标记物：在细胞解离过程中，CTCs 下调上皮组织特定标志物如细胞角蛋白和上皮细胞粘附分子，同时上调间叶组织标记物如波形蛋白的表达，这有利于细胞逃离原发灶进入血液循环［7］。EMT 这一特性对现存的一些CTCs 的检测方法有着重要的影响。例如针对上皮细胞表面标记物的检测方法就无法检测到发生

［收稿日期］2016-05-05；［修回日期］2016-07-15

［作者简介］马富玲，博士，主要研究循环肿瘤细胞筛查、临床意义。

循环肿瘤细胞基本生物学行为及检测技术

马富玲（天津医科大学第二医院，天津

300211）

摘要：循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)是脉管中的肿瘤细胞，被认为是肿瘤血液转移的关键步骤之一。循环肿瘤细胞的检测对于肿瘤的诊断、治疗和预后判定都具有非常重要的意义，因其稀缺性及异质性其检测方法一直是肿瘤研究的热点。本文从CTCs 生物学行为、检测方法方面综述了CTCs 临床应用的最新研究进展。关键词：循环肿瘤细胞；生物学行为；检测；临床意义【文章编号】2095-3720（2016）09-0764-05

【中图分类号】R73

【文献标志码】B

Basic biological behaviors and detection technology of circulating tumor cells

MA Fu-ling (Tianjin Medical University Second Hospital,Tianjin 300211,China)

Abstract:Circulating tumor cells (CTCs)are the tumor cells in vessel,and considered as the key step in tumor blood metastasis.Detection of CTCs in cancer patients plays very important roles in diagnosis,treatment and prognosis.The heterogeneity and scarcity of CTCs make it very difficult in detection.In this paper,we reviewed the latest research progress in basic and clinical applications of CTCs.

Key words:Biological behaviour；Detection；Clinical significance;Circulating tumor cell

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综述

DOI:10.16548/j.2095-3720.2016.09.023

2016年9月Journal of Logistics University of PAP（Medical Sciences）Sep.2016

EMT转化的CTCs，未检出率可达38%～40%，然而该部分“隐蔽细胞”且更易形成转移灶，并且与疾病预后息息相关［8］。Aktas采用逆转录PCR发现在转移性乳腺癌患者CTCs表面EMT相关标志分子如Twist1、蛋白激酶B、磷脂酰肌醇-3激酶α均有不同程度表达［9］。Rossi E通过动物实验首次证明Ep-CAM（epithelial cell adhesion molecule）高表达的CTCs更具侵袭性［3］。

对于经血行转移形成的转移瘤，CTCs在诱导转移瘤形成的过程中扮演了重要角色。CTCs形成转移灶需经历3个步骤：粘附、穿壁和定植。肿瘤细胞进入循环系统后由于肿瘤细胞自身因素（缺乏变形能力不能顺利通过血管，或缺乏形成癌栓能力、宿主的免疫识别及机械损伤），绝大多数在极短时间内死亡，只有极少数细胞可存活下来，它们逃脱免疫机制不断增殖，并最终发展为转移灶［11］。目前不仅在晚期肿瘤患者的外周血中能发现CTCs，某些肿瘤比如早期乳腺癌，早期肺癌、隐匿期肿瘤患者的外周血中也能发现CTCs，这种现象说明在现有检查方法发现肿瘤之前就有CTCs进入血液，因此对于这部分患者应高度重视。

与原发肿瘤及转移灶内肿瘤细胞一样，CTCs具有明显异型性，包括细胞体积增大、核浆比例失调且染色质呈细颗粒状或斑点状、增殖活力强、癌基因及特异标志物高表达等。Meng等研究发现，CTCs 的核浆比例明显高于正常血白细胞（0.8±0.1vs 0.55±0.05，P<0.001），CTCs的直径（29.8±6.5）μm 较原发肿瘤（32.0±5.8）μm或转移灶（33.9±8.3）

μm中的肿瘤细胞小，但远较白细胞大很多，提示肿瘤负荷和治疗状况影响CTCs［12］。为了探究存活下来CTCs的增殖活性，El-Naggar AK等使用流式细胞术对肾癌患者研究分析，证明进入外周血CTCs大多处于凋亡状态，仅有少数处于高增殖状态并形成转移灶，存活下来的肿瘤细胞具有高度增殖潜能［13］。Kallergi等对转移性乳腺癌患者血标本检测后发现，CTCs可表达血管内皮生长因子、缺氧诱导因子1α和粘着斑激酶等多种关键成分，参与肿瘤血管生成［14］。在转移灶形成过程中，新生血管不仅能为细胞提供营养，而且内皮细胞还可分泌多种生长因子促进肿瘤生长。

一般来说，原发灶对人体危害程度并不高，但转移瘤却可影响人体主要器官功能导致患者死亡，因此，在原位癌治疗后，对转移癌也不能忽视。研究发现原发和转移性前列腺癌患者5年平均生存率分布为100%和28%［14，15］。既往研究认为外周血中呈现CD45-/Ep CAM+/CK+的细胞即CTCs，与肿瘤患者预后密切相关。但事实上，少数具备肿瘤干细胞潜能形亚群的细胞（circulating tumor stem cell，CTSC）在微环境适宜时可能才是最终形成转移灶的根本所在，因此CTSC的检测更具有临床意义。Reube等发现约60%的CTCs表达与干细胞相关基因NOTCH1［16］。Theodoropoulos等发现在乳腺癌患者外周血CTCs中也存在另一部分CD44+/CD24-低表达的CTSC，提示CTSC也存在异质性［17］。张秀珍等认为CTSC标记物CD44、CD133连合CD45、Ep-CAM可作为CTSC的检测指标，对患者的预后判断疗效监测具有重要意义［18］。

2循环肿瘤细胞的分离和鉴定

近年来伴随现代生物学技术的不断进步，免疫磁珠、多色荧光标记和生物细胞分选芯片等细胞分选技术己经能够准确、快速的分离外周血中的肿瘤细胞。CTCs检测一般包括细胞富集和细胞鉴定，二者均较复杂且技术要求相对较高。

2.1循环肿瘤细胞富集技术

密度梯度离心法根据各种细胞的密度不同，用1.077g/ml的密度梯度把单核细胞和肿瘤细胞从其它血细胞中分离出来。OncoQuick系统使分离出的肿瘤细胞更加纯化，提高了CTCs的检出率。该方法优点是基于细胞物理学特性的富集技术为下一步的形态学、细胞学及分子生物学研究提供了条件，对人员操作水平要求不高且经济实用，局限性在于多次离心可造成CTCs的破坏和丢失［19］。Pachmann K比较了密度梯度离心法和红细胞裂解液这两种方法富集肿瘤细胞的效率，其敏感度相对不足且依赖于细胞的特性、离心时间、温度等多种因素［20］。

膜滤过技术（Isolation by Size of Epithelial Tu-mor cells，ISET）依据肿瘤细胞与白细胞大小的不同，用直径8μm孔径的聚碳酸酯膜将二者分离，直径大于8μm的肿瘤细胞留于膜的表面。此方法可达到从每毫升全血中检测到1个CTCs的敏感性，且能够检测到CTCs微栓子。该方法具有敏感性高、破坏性低等优势。分离到的CTCs具有活性，能较好保持CTCs遗传学、免疫化学等特性；其局限性在于由于细胞异质性，CTCs大小并不完全一致，不能检出