实验四 蛋白酶活力的测定

浴准确保 温10分钟
40℃水浴保温10 分钟，过滤得滤 液
2、蛋白酶活力的测定

按下表操作，然后测定滤液中的酪氨酸含量。
酶液 （ml） 1 1 酪蛋白 （ml） 2 ---三氯 醋酸 （ml） ---3 三氯 醋酸 （ml） 3 -----酪蛋白 （ml） ------2 40℃水浴保温 10分钟，过滤 得滤液。
胰酶活力定义： 40 ℃ ， pH7.5 ，反应10min，每分 钟水解酪蛋白产生酪氨酸 1 微克为一个酶活力单位。 计算：1g 蛋白酶所具备的总活力单位为： ( A 样 - A 对)× K × V/t × N A 样 ：样品液光吸收值； A 对 ：对照液光吸收值； K ：标准曲线上A680nm为 1 时的酪氨酸微克数； t ：酶促反应的时间（min），本实验 t =10min ； V ：酶促反应管的总体积（ml数），本实验 V =6 ； N ：本次实验酶液的稀释倍数:6000

五、思考题




酶的试验为何设对照又要设空白? 稀释的酶溶液是否可长期使用？说明原因。 计算公式中的v=6该如何理解 本实验用什么方法终止酶促反应?还有其他方法 可以终止反应吗? 如何保证本实验测定数据的准确性？ 胰蛋白酶的比活力如何计算？

六、值日


请将实验废水倒入废水缸，将试管清洗干净，不要留下 蓝色痕迹. 值日第11+12组.
管号
1 ′ 号 (样品)
2 ′号 (对照)

40℃水 浴准确 保温10 分钟

滤液各取1ml，进行显色反应(加Na2CO35ml+Folin-酚试剂 1ml，40 C保温15min) 以标准曲线中的1号管调0，测定A 样 (样品液A680nm值)和A 对 (对照液A680nm值)；
3. 酶活力计算
四、实验操作
1、酪氨酸标准曲线的制作
管号 1 2 3
以酪氨酸的浓度（μg/ml）为 横坐标， A680nm为纵坐标，作 出标准曲线。
4 5 6 样品、对 照滤液 （各2支 试管） 每支管加 1ml
100g/ml Tyr (ml)
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
水（ml)
稀释后Tyr浓度（μg/ml） Na2CO3 (ml) Folin-酚试剂 (ml)
实验四 蛋白酶活力的测定
(先打开水浴锅，温度设置成40C) 一、实验目的 二、实验原理 三、器材仪器和主要试剂 四、实验操作 五、思考题 六、值日

一、实验目的

掌握定量测定蛋白酶活性的方法，了解本实验的酶、底 物和生成物的相关性，以及本反应的环境条件。 进一步理解酶活力和比活力的概念 巩固比色法测定物质含量的基础，掌握分光光度计使用 方法，学习绘制标准曲线的方法
4. 蛋白酶活力单位定义：在40C，pH7.5的条件下，反应10min，以每min水 解酪蛋白产生1 g酪氨酸为1U。
三、器材仪器和主要试剂



可见光分光光度计 水浴锅 Folin –酚试剂 0.5% 酪蛋白 100 g/ml Tyr 溶液 三氯醋酸 Na2CO3 胰蛋白酶
1.0
0 5 1
0.8
20 5 1
0.6
40 5 1
0.4
60 5 1
0.2
80 5 1
0
100 5 1 5 1 A样、A对 照
迅速混合，于40℃放置15分钟 A680nm 管号 样品管 对照管 酶液（ml） 1 1 调0 酪蛋白 （ml） 2 ---三氯 醋酸（ml） 40℃水 ---3 三氯 酪蛋白 醋酸（ml） （ml） 3 -----------2

ຫໍສະໝຸດ Baidu
二、实验原理
1．胰蛋白酶是一种水解酶，将酪蛋白水解成酪氨酸等物质。 2．所生成的酪氨酸能与酚试剂反应成蓝色物质。酚试剂又名Folin试剂，是磷钨 酸和磷钼酸的混合物，在碱性条件下极不稳定，可被酚类化合物还原产生蓝 色（钼蓝和钨蓝的混合物，680nm）。 3．用分光光度计可以定量比较颜色深浅，测定酪氨酸生成量，根据生成物的含 量可以计算胰蛋白酶的活力。胰蛋白酶活力越高，生成的酪氨酸越多。