一代至四代测序技术详细讲解
基因测序——精准医学发展基础
“基因测序”——精准医学发展基础高雅16300680187目录：技术名称：基因测序技术原理：P1-P4技术应用：P4-P5技术优缺点：P6一、技术原理：基因测序是一种新型基因检测技术，主要是从血液或唾液中分析测定基因的全序列，从而预测罹患多种疾病的可能性。
随着精准医疗的逐步深入，基因测序已能提供患者的个体差异信息，为肿瘤的治疗提供相关指导。
（图一:测序技术的发展历程）（图二、三：基因测序提供医疗信息）1.第一代测序：第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法，或者是1976-1977年由马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解）。
Sanger法核心原理是：由于ddNTP 的2’和3’都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP（分为：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列（图四、五：Sanger法测序）2.第二代测序：Illumina/Solexa Genome Analyzer测序的基本原理是边合成边测序。
在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。
（图六、七：Illumina/Solexa Genome Analyzer测序）3.第三代测序：1.新型纳米孔测序法（nanopore sequencing）是采用电泳技术，借助电泳驱动单个分子逐一通过纳米孔来实现测序的。
由于纳米孔的直径非常细小，仅允许单个核酸聚合物通过，而ATCG单个碱基的带电性质不一样，通过电信号的差异就能检测出通过的碱基类别，从而实现测序。
一二三四代测序技术原理详解
一二三四代测序技术原理详解一、第一代测序技术原理第一代测序技术最早出现于1977年，是由Sanger等人发明的，并被称为“链终止法”。
其原理是通过DNA聚合酶将输入的DNA序列再生产出一条互补链，同时在每个位点上加入一种特殊的荧光标记的二进制核苷酸，然后将这些被标记的DNA片段分开进行电泳，根据电泳结果可以得到DNA的序列。
第一代测序技术的核心原理是首先将待测序列分成多个片段，然后利用DNA聚合酶在每个片段的3'末端加入一种荧光标记的二进制核苷酸。
这种核苷酸的特殊之处在于，它们只能和待测序列的碱基互补配对，并且在加入过程中会停止DNA链的生长。
随后，将加入了荧光标记的DNA片段进行分离和电泳。
由于不同长度的DNA片段在电场下移动的速度不同，所以通过观察不同片段的移动位置，可以推断出每个片段的碱基序列。
二、第二代测序技术原理第二代测序技术的原理是通过对待测DNA片段进行多轮的扩增和测序，最后将所有结果进行比对和组装，得到完整的DNA序列。
第二代测序技术的核心原理是将待测DNA样本分成许多小片段，然后将每个片段进行扩增，所得到的扩增产物再次进行扩增，并且在扩增过程中引入一种荧光标记的二进制核苷酸。
在每个扩增步骤之后，需要将扩增产物进行分离，例如利用固相法将扩增产物固定在芯片上。
然后，对每个扩增产物进行毛细管电泳或基于光信号的测量，以确定每个扩增产物对应的碱基序列。
最后，通过将所有碱基序列进行比对和组装，可以得到待测DNA的完整序列。
第二代测序技术相较于第一代测序技术具有更高的通量和更低的成本，可以同时进行大规模的测序，因此被广泛应用于基因组学和生物医学研究。
三、第三代测序技术原理第三代测序技术是在第二代测序技术的基础上发展而来的，其主要原理是通过直接测量DNA或RNA单分子的序列来进行测序，无需进行扩增和分离过程。
第三代测序技术的核心原理是通过探测DNA或RNA单分子在固定的平面上的位置变化，来确定每个单分子的碱基序列。
一代测序二代测序以及三代测序的优缺点及应用对比
一代测序二代测序以及三代测序的优缺点及应用对比一代测序（Sanger测序）是最早的测序技术，使用DNA聚合酶扩增特定区域的DNA片段，并通过合成带有不同碱基的荧光标记引物进行测序。
一代测序的优点是高可靠性和准确性，能够得到较长的读长，适用于小规模的基因组测序和位点测序。
不过，一代测序存在的缺点是昂贵、耗时且无法进行高通量测序，适用于较小规模的实验。
二代测序（高通量测序）是目前最为常用的测序技术，如Illumina和Ion Torrent等商业平台。
二代测序基于串联的扩增反应，DNA模板被分成数百万小片段，每个片段通过扩增、聚合和测序步骤进行处理。
二代测序具有高通量、较低的成本和快速的测序速度等优点，能够同时测序多个样本。
缺点是读长比较短，通常为几百个碱基对。
二代测序主要应用于全基因组测序、转录组测序、表观基因组测序等大规模测序项目。
三代测序（单分子测序）是较新的测序技术，如PacBio和Oxford Nanopore等商业平台。
三代测序通过直接测量单个DNA分子的顺序来进行测序，不需要扩增反应。
三代测序的优点是具有极长的读长，可以达到几十万个碱基对，能够测序重复序列和大的结构变异。
缺点是较高的错误率和较低的测序准确性。
三代测序主要应用于长读长测序、基因组组装和变异检测等需要长reads的研究。
总结起来，一代测序适用于小规模的实验，提供高质量的数据，但成本昂贵和耗时。
二代测序适用于大规模的测序项目，具有快速、高通量和较低的成本等优点，但读长较短。
三代测序适用于长读长测序和大结构变异的分析，但错误率较高。
根据研究需求选择合适的测序技术，或者结合多种技术来获得更全面的基因组信息。
第一代测序技术原理
第一代测序技术原理第一代测序技术是指Sanger测序法，是20世纪70年代末期至80年代初期发展起来的一种测序技术。
它的原理是通过DNA聚合酶在DNA模板上合成一条新的DNA链，这条新链与模板DNA链互补配对，但在其合成过程中，加入了一种特殊的二进制核苷酸，即二进制脱氧核苷酸三磷酸酯，当新链中遇到这种特殊的核苷酸时，DNA聚合酶会停止合成。
通过测定这些停止的位置，就可以确定DNA序列。
Sanger测序法的原理可以简单概括为四个步骤，首先，将要测序的DNA片段进行复制，得到多个相同的DNA片段。
然后，在DNA复制的过程中，加入一种特殊的二进制脱氧核苷酸三磷酸酯，这种核苷酸会随机地停止DNA链的合成。
接着，将停止合成的DNA片段进行分离，通过凝胶电泳等方法，可以将不同长度的DNA片段分开。
最后，通过X射线或荧光染料等方法，可以测定每个DNA片段的长度，从而确定DNA序列。
Sanger测序法的原理虽然简单，但是在实际操作中需要严格控制各种条件，才能得到准确的测序结果。
首先，需要保证DNA片段的纯度和完整性，避免在复制过程中出现断链或者杂质。
其次，需要控制好二进制脱氧核苷酸三磷酸酯的加入浓度，以及DNA聚合酶的活性，避免过多或过少的停止合成。
最后，在分离和测定DNA片段的过程中，也需要精确地控制各种条件，以确保准确的测序结果。
尽管第一代测序技术已经被新一代测序技术所取代，但是Sanger测序法作为第一代测序技术的代表，仍然具有重要的意义。
它的原理和方法为后续测序技术的发展奠定了基础，同时也在一些特定的应用场景中仍然具有一定的优势。
因此，了解第一代测序技术的原理，对于理解整个测序技术的发展历程和原理具有重要的意义。
总的来说，第一代测序技术即Sanger测序法的原理是通过DNA聚合酶在DNA模板上合成一条新的DNA链，加入特殊的二进制脱氧核苷酸三磷酸酯，当新链中遇到这种特殊的核苷酸时，DNA聚合酶会停止合成，通过测定这些停止的位置，就可以确定DNA序列。
人类基因组测序方法
人类基因组测序方法人类基因组测序是指对人类基因组DNA序列进行测定和解析的过程。
基因组测序技术的发展对于理解人类遗传信息的构成和功能起到了重大的推动作用，也促进了人类遗传病、肿瘤基因变异等研究的进展。
随着测序技术的不断发展，人类基因组测序正在变得更快、更准确和更经济高效。
第一代测序方法：第一代测序方法是指利用经典的链终止法或链延伸法对DNA序列进行测定。
这些方法包括了最早的Sanger测序方法和Maxam-Gilbert测序方法。
这些方法的特点是比较耗时、费用高昂，同时测序的通量有限，通常一次只能测定一小段DNA序列。
虽然第一代测序方法已经被后来的测序技术所取代，但它们的准确性非常高，仍然被广泛应用于一些特定的实验室研究。
第二代测序方法：第二代测序方法因其较高的测序通量和较低的成本而受到广泛关注和应用。
这些方法的共同特点是将DNA样本分解成许多小片段，同时在固相杂交或PCR扩增的基础上进行测序。
其中最常用的第二代测序方法包括Illumina测序、Ion Torrent测序、454测序等。
这些方法的基本步骤相似，包括DNA样本的制备、DNA片段的准备、测序反应的进行和序列数据的分析。
这些方法的共同优势是测序的速度快、成本低，并能够同时测定大量的DNA片段。
因此，第二代测序方法广泛应用于大规模基因组测序项目、筛查遗传病等领域。
此外，近年来还出现了一些新兴的第三代测序技术。
这些新技术的特点是无需PCR扩增、能够直接测定单个DNA分子的序列信息，并且测序速度和通量更高。
目前常见的第三代测序技术包括单分子测序、纳米孔测序和单分子实时测序等。
这些技术的不断发展和成熟，将进一步推动人类基因组测序的应用和研究。
综上所述，人类基因组测序技术的发展经历了从第一代测序到第二代测序甚至第三代测序的演进过程。
不同的测序方法在测序通量、准确性、成本等方面存在一定的差异。
人类基因组测序技术的进步将为人类遗传学、药物研发、个体化医疗等领域的研究和应用提供更多的机会和挑战。
第四代基因测序技术——纳米孔测序技术
纳米孔测序技术原理
基本原理：
Nanopore测序是将人工合成的一种多聚物膜浸入离子溶液，多聚物膜上 布满了经穿膜孔的跨膜通道蛋白，即纳米孔蛋白也叫Reader蛋白。在膜 两侧施加不同电压产生电压差，DNA双链在马达蛋白的牵引下解螺旋通 过纳米孔蛋白，不同碱基通过时形成特征性离子电流变化信号，这被称 为Nanopore信号。
采用边合成边测序的方法，高通量为其特点。以Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa， Hiseq技术和ABI公司的Solid技术为标记的第二代测序技术大大降低测序成本，大幅提高了测 序速度和准确性，但阅读长度相对较短。
单分子测序为主要特征的第三代测序技术（也称为Next-generation sequencing）也还在研究当 中，测序过程无需进行PCR扩增。如Heloscope 单分子测序技术也是基于边合成边测序的思想， 但不需要PCR 扩增，所以更能反映样本的真实情况，通量也更高。 还有PacBio公司的SMRT 测序技术，SMRT 芯片为一种多ZMW 孔的厚度为100nm 的金属片，测序时将DNA 聚合酶、不 同荧光标记的dNTP、待测序列加入ZMW 孔的底部，然后进行合成反应。
第四代基因测序技术简介
——纳米孔测序技术（Nanopore sequencing)
小珮妮
基因测序技术发展历史
第一代测序技术： 第二代测序技术： 第三代测序技术：
第四代测序技术：
Sanger双脱氧链终止法，Gilbert化学裂解法等，操作复杂，自动化程度低，测序时间长且成 本高，不满足大规模基因测序要求。
一代至四代测序技术详细讲解
一、我们将如何应对海量的基因信息新一代测序技术带给人们大量遗传信息的同时，却成为限制其广泛应用的一个障碍。
1980年，英国生物化学家Frederick Sanger与美国生物化学家Walter Gilbert建立了DNA测序技术并获得诺贝尔化学奖，至今已有近三十年了。
在这三十年，DNA测序技术取得了令人瞩目的进展。
目前已进入市场的循环阵列测序平台采用的是与Sanger生物化学测序方法完全不同的原理。
在过去几年，应用极为广泛的毛细管电泳测序法采用的则是多线并行阵列格式，它运用尖端的荧光成像技术进行碱基识别。
上述各类新技术为生物学研究领域开辟了新的视角，也使实验研究达到一个新的水平。
学界对开发这类新技术的兴趣持续高涨，与此同时，人们却发现这些技术存在一定的不足——大量信息数据的产生限制了技术更加广泛的应用，并降低了其市场价值。
过去，研究人员使用Applied Biosystems（ABI）公司的3730XL毛细管电泳测序仪进行基因分析，每年至多能完成六千万碱基的测序量。
随着测序技术日新月异的发展，这种情况已经成为历史。
在2005年刚刚开始进行新一代测序技术开发时，Roche公司和454公司联合开发的焦磷酸测序仪的分析速度就已经达到了上述提及的ABI仪器速度的50倍之上。
也就是从那时起，因基因数据过多而产生的问题凸显了出来，而且这个问题随着其他制造商开发出更多更快的测序仪而愈加严重。
举个例子，ABI的新一代测序平台SOLiD（supported oligonucleotide ligation and detection）单次运行，便可以分析6Gb的碱基序列；而Roche/454测序仪单次运行可以将上述结果转换成12-15个千兆字节（gigabytes）的数据信息；Illumina Genome Analyzer（GAII）测序系统仅在两个小时的运行时间里，就得到10兆兆字节（terabytes）的信息。
第一代测序技术ppt课件
与传统测序法相比，循环芯片测序法具有操作更简易、 费用更低廉的优势，于是很快就获得了广泛的应用。
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虽然这些新一代测序仪以及芯片的实际制作过程似乎都和传统的测序 方法有很大的不同，而且各有特点，但实际上它们背后的原理和技术 都是非常相似甚至是相同的（图1b）。新一代测序法首先也是将基因 组DNA随机切割成小片段DNA分子，然后在体随后可以通过原位 polony（in situ polony，小词典1）、微乳液PCR（emulsion PCR ）或桥式PCR（bridge PCR）（图5）等方法获得测序模板。
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高通量测序技术是对传统测序一次革命性的改变，一次对 几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，因此在有些 文献中称其为下一代测序技术(next generation sequencing)足见其划时代的改变，同时高通量测序使得 对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可 能，所以又被称为深度测序(deepsequencing)。
测序技术
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目录
第一代测序技术 第二代测序技术（Illumina测序仪，SOLiD测序仪，
454基因组测，Ion Torrent 测序） 第三代测序技术 高通量测序技术
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第一代测序技术的发明人
利用DNA聚合酶和双脱氧链 终止测定DNA核苷酸序列的 方法。是英国剑桥分子生物学 实验室的生物化学家Fred Sanger及其同事在1997年发 明的。
一代二代三代测序原理
一代二代三代测序原理一代、二代和三代测序技术在测序原理上有一定的区别。
下面为您详细介绍这三代测序技术的原理：1. 一代测序（Sanger测序）：一代测序，也称为Sanger测序，是由英国生物化学家Frederick Sanger 发明的一种测序方法。
其核心原理是双脱氧链终止法，利用DNA复制过程中的终止现象进行测序。
在Sanger测序反应中，包含目标DNA片段、脱氧三磷酸核苷酸（dNTP）、双脱氧三磷酸核苷酸（ddNTP）、测序引物和DNA聚合酶等。
测序反应的关键是使用的ddNTP，由于缺少3'-OH基团，不具有与另一个dNTP连接形成磷酸二酯键的能力。
这些ddNTP可以用来中止DNA链的延伸。
在测序过程中，设置多个反应体系，分别加入引物、DNA聚合酶、四种dNTP和一定比例的ddNTP（带有放射性标记）。
例如，第一个体系中加入ddATP，负责测定T碱基的位置；依次加入ddCTP、ddTTP和ddGTP，分别测定C、T和G碱基的位置。
扩增过程中，ddNTP结合到相应的测序位点，最后通过凝胶电泳和放射自显影检测带有荧光标记的ddNTP，得到测序序列。
一代测序技术的主要特点是测序读长可达1000bp，准确性高达99.999%，但通量低、成本高。
目前，一代测序在验证序列和验证基因组组装完整性方面被认为是金标准。
2. 二代测序（高通量测序）：二代测序，也称为高通量测序技术，相较于一代测序，具有更高的通量。
它一次可以同时测序大量的序列，从而满足对一个物种或样本中所有序列信息进行分析的需求。
二代测序的核心原理是测序by synthesis（测序合成法），利用DNA聚合酶和测序引物在模板DNA上进行实时测序。
在测序过程中，将DNA 随机打断成小片段（如250-300bp），然后通过建库和富集这些DNA 片段。
建库后的样本放入测序仪中进行测序，测序仪中有着不同的测序深度，根据碱基互补配对原则，读取测序数据并拼接成完整的序列。
DNA第一代,第二代,第三代测序的介绍
原理是：核酸模板在DNA聚合酶、引物、4 种单脱氧核苷三磷酸 ( d NTP，其中的一种用放射性P32标记 )存在条件下复制时，在四管反应系统中分别按比例引入4种双脱氧核苷三磷酸 ( dd NTP )，因为双脱氧核苷没有3’-O H，所以只要双脱氧核苷掺入链的末端，该链就停止延长，若链端掺入单脱氧核苷，链就可以继续延长。
如此每管反应体系中便合成以各自的双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段。
反应终止后，分4个泳道进行凝胶电泳，分离长短不一的核酸片段，长度相邻的片段相差一个碱基。
经过放射自显影后，根据片段3’端的双脱氧核苷，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。
Sanger法因操作简便，得到广泛的应用。
后来在此基础上发展出多种DNA 测序技术，其中最重要的是荧光自动测序技术。
荧光自动测序技术荧光自动测序技术基于Sanger 原理，用荧光标记代替同位素标记，并用成像系统自动检测，从而大大提高了D NA测序的速度和准确性。
20世纪80 年代初Jorgenson 和 Lukacs提出了毛细管电泳技术( c a p il l ar y el ect r ophor es i s )。
1992 年美国的Mathies实验室首先提出阵列毛细管电泳 ( c a p il l ar y ar r a y el ectr ophor es i s ) 新方法，并采用激光聚焦荧光扫描检测装置，25只毛细管并列电泳，每只毛细管在内可读出350 bp，DNA 序列,分析效率可达6 000 bp/h。
1995年Woolley研究组用该技术进行测序研究，使用四色荧光标记法，每个毛细管长，在9min内可读取150个碱基，准确率约 97 % 。
目前, 应用最广泛的应用生物系统公司 ( ABI ) 37 30 系列自动测序仪即是基于毛细管电泳和荧光标记技术的D NA测序仪。
如ABI3730XL 测序仪拥有 96 道毛细管, 4 种双脱氧核苷酸的碱基分别用不同的荧光标记, 在通过毛细管时不同长度的 DNA 片段上的 4 种荧光基团被激光激发, 发出不同颜色的荧光, 被 CCD 检测系统识别, 并直接翻译成 DNA 序列。
DNA测序
DNA测序一、DNA测序发展史:DNA测序可以分为四个阶段：DNA的出现、第一代DNA测序技术、第二代DNA测序技术、第三代DNA测序技术1、DNA测序的出现：1975年Sanger和Coulson发明了加减法测定DNA序列。
1977年在引入双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)后,形成了双脱氧链终止法,使得DNA序列测定的效率和准确性大大提高。
Maxam和Gilbert在1977年报道了化学降解法测定DNA的序列。
2、第一代DNA测序技术：传统的化学降解法、双脱氧链终止法以及在它们的基础上发展来的各种DNA测序技术统称为第一代DNA测序技术。
人类基因组计划(human genome projec,tHGP)主要基于第一代DNA测序技术。
包括：化学降解法、双脱氧链终止法、荧光自动测序技术、杂交测序技术3、第二代DNA测序技术：新一代测序技术也称为第二代测序技术,主要包括罗氏454公司的GS FLX测序平台、Illumina公司的SolexaGenomeAnalyzer测序平台和ABI公司的SOL-iD测序平台。
4、第三代DNA测序技术：如生物科学公司(BioScienceCorporation)的HeliScope单分子测序仪(HeliScopeSingleMolecular Sequencer)以及正在研制的太平洋生物科学公司(Pacific Biosciences)的单分子实时DNA测技术[SingleMolecule RealTime (SMRT)DNA sequencingtechnology]和牛津纳米孔技术公司(OxfordNanopore TechnologiesLtd)的纳米孔单分子测序技术等二、Sanger双脱氧链终止法核酸模板在核酸聚合酶、引物、四种单脱氧碱基存在条件下复制或转录时，如果在四管反应系统中分别按比例引入四种双脱氧碱基，只要双脱氧碱基掺入链端，该链就停止延长，链端掺入单脱氧碱基的片段可继续延长。
测序技术介绍
Sanger 测序法的原理
每一次DNA 测序反应都由4 个独立反应组成； 由于DNA 双链中核苷酸以3′，5′-磷酸二酯键相连，因此在测序
过 程 中 掺 入 2′ ， 3′- 双 脱 氧 核 苷 三 磷 酸 ———ddNTP （ 不 含 3′OH），当ddNTP 位于DNA 双链的延伸末端时， 无羟基3′端不 能与其他脱氧核苷酸形成3′，5′-磷酸二酯键， 因此，DNA 双链 合成便终止； 若在终止位点掺入ddATP，则新生链末端为A，若掺入ddTTP、 ddCTP、ddGTP，相应地，新生链末端则是T、C 或G。
测序过程中的常见问题分析
2：为什么找不到我的PCR引物序列？用PCR引物作为测序引物，所测序列是 从引物3末端后第一个碱基开始的，所以就找不到您的测序引物了。可以进行 反向测序，得到引物的反向互补序列。还可以将所测片段克隆到适当载体中， 由于通用引物与插入序列有一段距离，就可以测出您的引物序列。
第二个峰，错位干扰。如果不判读为干扰峰，则说明样本可能比预期多一个碱基（G）， 如果判读为干扰峰，我们仍只需认定样品此处碱基为T为行了。
测序过程中的常见问题分析
6：为什么用PCR产物或质粒测序时，经常会出现套峰现象? 下图是pGEM-T载体测序的结果，在83位点处测序结果出现双峰，即模板中含
454测序仪的整个实验步骤可大致应板准备
• 上机测序
2020/1/25
454测序原理
1. 样品处理： 样品处理主要是针对大片段的DNA分子，如基因组DNA、Fosmid或 BAC质粒等，利用超声或氮气打断将这些DNA分子片段化，然后采用 琼脂糖凝胶电泳回收或磁珠纯化，选择500-800bp的DNA片段。对于 非编码RNA或PCR产物，则不需要这一步骤。
一代二代三代测序原理
一代二代三代测序原理一代测序原理：一代测序也被称为Sanger测序，其原理基于利用一种特殊的二磷酸异烟腺嘌呤（ddNTP）来终止DNA合成。
该方法需要将待测DNA样品进行PCR扩增，然后将DNA片段分为4个不同的反应管中，分别加入4种不同的ddNTPs和DNA聚合酶。
在反应过程中，ddNTPs会以随机的方式被DNA聚合酶插入DNA链中，由于ddNTPs不包含3'-OH基团，无法继续合成DNA链，因此会导致DNA合成的终止。
最终在每个反应管中会生成一系列不同长度的DNA片段。
接下来，需要将这些DNA片段进行电泳分离。
在电泳过程中，DNA片段会根据它们的长度在电泳胶中形成不同的带。
随后，可以通过将电泳胶放入X射线或紫外线仪器中，观察DNA片段的分布情况，并将结果录入计算机中。
根据电泳结果，可以确定DNA片段的长度，从而推断出DNA序列。
二代测序原理：二代测序也被称为高通量测序，与一代测序相比，它使用了并行的测序方法，可以在同一时间内测序多个DNA片段。
常见的二代测序技术有Illumina的测序技术、Ion Torrent的测序技术等。
以Illumina测序为例，其原理基于反复复制DNA片段，并通过称为“桥式PCR”（Bridge PCR）的方法，将每个DNA片段固定在微小的玻璃芯片上形成聚集点。
接下来，每个DNA聚集点会被DNA聚合酶以及具有不同荧光标记的ddNTPs引发合成，DNA合成会通过照射脉冲激光来进行读取。
反复重复这个过程，可以逐步将每个DNA片段进行扩增和读取。
在读取的过程中，荧光信号会被记录并转化为电信号，进而被电脑检测和分析。
最终，通过计算机软件将这些电信号转化为DNA序列，并进行测序结果的分析和处理。
三代测序原理：三代测序也被称为单分子测序，在DNA测序技术的发展中是最新的一代。
与一代和二代测序技术相比，三代测序技术具有更高的测序速度和更长的读长度。
以PacBio测序技术为例，其原理基于利用DNA聚合酶引导DNA合成。
简述一、二、三代测序技术
简述一、二、三代测序技术
一代测序
一代测序技术是首次开发的测序技术，也叫Sanger测序，它实际上是一种“拼接”技术，利用特定的DNA复制酶（DNA聚合酶）在双链DNA基础上进行延展反应，从而实现DNA测序的目的，其优势在于格式简单，容易操作，准确度高，但是比较耗时。
二代测序
二代测序技术，又叫“高通量测序”或“质谱测序”，最基本的原理是使用新的双链DNA片段作为模板，利用测序读码亚单位，不断改变测序片段的序列，从而快速完成测序工作，其优势在于测序效率高，但准确度要比一代测序低。
三代测序
三代测序技术，又称“短序列测序”，是一种测序技术，其最基本的原理是使用单个DNA片段作为模板，构建测序片段，并记录每一个片段的碱基序列，从而实现测序的目的，其优势在于测序速度快，准确度高，但也比较昂贵。
一代、二代、三代基因测序技术的发展历史及应用
备注：数据来源于罗氏官网和网络
二代测序的技术平台——Thermo Fisher
ABI/SOLiD技术原理： SOLiD测序技术也是采用油包水的方式进行Emulsion PCR。
不同之处在于SOLiD形成的小水滴要比454系统小得多， 只有1μm大小，用连接酶替代了常用的DNA聚合酶。
二代测序的技术平台——Thermo Fisher
① Ion Torrent测序芯片，是一块半导体芯片； ② 孔即是测序微珠的容器，又同时是一个微型的PH计。 ③ 4种dNTP依次流过Ion芯片； ④ 发生聚合反应产生H+引起PH变化，被传感器记录下来。 每个碱基的检测只需要几秒钟。
二代测序的技术平台——Thermo Fisher
读长
2x150bp 2x150bp 2x300bp
台式测序 2x150bp
台式测序/大规 模
2x150bp
大规模 测序
2x250bp
大规模 测序
2x150bp
测序通量 1.2Gb 7.5Gb
15Gb
120Gb
330Gb
6000Gb
16Tb
最大reads数 4M
25M
25M+
运行时间 9.5-19h 4-24h
4-55h
400M 12-30h
1.1B+ 11-48h
200亿 13-44h
260亿（单） 520亿（双）
13-48h
二代测序的技术平台——华大智造
华大基因先推出了BGISEQ-500桌面化测序系统， 之后又推出： BGISEQ-50、 MGISEQ-200、 MGISEQ-2000均取得了NMPA（原CFDA）认证， 还推出了MGISEQ-T7， 2022年10月推出DNBSEQ-T10x4、DNBSEQ-T7高通量测 序仪。
基因组测序原理
参考文献： 岳桂东 高强 高通量测序技术在动植物研究领域中的应用 生命科学 2012年第42卷 陈 勇 柳亦松 曾建国 ，植物基因组测序的研究进展 生命科学研究 2014.2 杨晓玲 施苏华 唐恬新一代测序技术的发展及应用前景 生物技术通报 2010年第10期 周晓光 任鲁风 李运涛 张猛 俞育德, 于军 下一代测序技术: 技术回顾与展望 生命科学
原理: 利用合成测序理论，将样本DNA的单链分子绑定在该仪器特有的没有背景荧 光的玻璃表面，通过加入荧光标记的核苷酸和聚合酶到单分子阵列中，核苷酸会特异 性结合到DNA分子的结合位点上 通过激光激发结合在DNA子上的荧光标记的核苷酸， 从而使标记物发出荧光，相机以15ms速度快速扫描整个阵列，检测特异性结合到DNA 片段上的荧光碱基 之后，结合的核苷酸会被移除，然后，进入下一次结合。 优缺点：不需要PCＲ扩增，所以能反映样本的真实情况，通量也较高， 但由于该技术限制可读的DNA片段长度平均仅为32bp，而且其高度精密 的显微镜不仅造成其仪器庞大价格昂贵，而且对环境要求高升级困难。
优点：纳米级别的孔径保证了检测具有良好的持续性，测序的准确度 可达 99.8%以上 ，对于长达1000bp的单链DNA分子、RNA分子或者更短的核酸分子 而言，无需进行扩增或标记就可以使用纳米孔测序法进行检测，这使得便宜 快速地进行DNA测序成为可能。
三代测速技术的比较
第一代测序技术： 凭借其长的序列片段和高的准确率, 适合对新物种进行基因组长距框架的 搭建以及后期GAP填补, 但是成本昂贵, 而且难以胜任微量 DNA 样品的测序工 作。 第二代测序技术： 454 适合对未知基因组从头测序, 搭建主体结构, 但在判断连续单碱基重 复区时准确度不高。Solexa具有通量高、片段短、价位低的特点,适合于小片段 如miRNA 的研究。 SOLID 具有双碱基编码系统的纠错能力以及较高的测序通 量, 但无法在基因组拼接中的广泛应用。
人类基因组测序的历史与未来
人类基因组测序的历史与未来自1990年代开始，随着科技的不断发展，人类基因组测序技术也在不断地得到改进和提高。
基因组测序技术的发展，对于人们了解人类自身的分子机制、研究疾病的发病机理以及开发新的药物和治疗手段等方面都有着重要的作用。
本文将介绍人类基因组测序技术的历史、现状以及未来的发展趋势。
一、基因组测序技术的发展历程1. 第一代基因组测序技术自20世纪80年代初起，人类基因组测序技术开始了漫长的发展历程。
最初的基因组测序技术被称为第一代测序技术，其基本原理是先将DNA序列分解成小片段，然后通过不断的试错过程，在实验室内利用各种化学手段将这些小片段合成为完整的DNA序列。
虽然第一代基因组测序技术的运行速度和对数据的准确性都存在着严重的局限，但它的出现为后来的基因组测序技术奠定了坚实的科学基础。
2. 第二代基因组测序技术尽管第一代基因组测序技术存在着明显的缺陷，但它的出现给科学家们踏上了测序基因组的科学之路。
2005年以后，诸如Illumina、Roche等公司陆续推出了第二代基因组测序技术，使得基因组测序技术进入了黄金时代。
第二代基因组测序技术是目前测序速度最快、测序效率最高的技术之一。
其主要原理是利用特殊的化学荧光技术，将DNA序列分析后转换成电子信号，再通过计算机算法分析这些信号之间的差异，推测出原始DNA序列。
同时，这里所谓的“第二代测序技术”还包括了生物纳米孔技术、长读全基因组测序等其他相关技术。
3. 第三代基因组测序技术随着科技的不断进步，第三代基因组测序技术也应运而生。
和第二代技术相比，第三代测序技术的优势在于：其测序的精度更高、效率更高、噪音更少、处理量更大。
其基本原理是将DNA模板分子直接读取，将DNA分子的单个碱基和标记触发芯片进行读取，亦称为长读技术。
尽管第三代基因组测序技术目前的成熟度还不够高，但其潜力是非常巨大的。
可以预见，未来的第三代基因组测序技术将成为人类基因组测序的主流技术。
基因测序的前世今生（一代测序,二代测序,三代测序最详原理）
测序技术的前世今生测序技术的发展历程第一代测序技术（Sanger测序）第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法或者是1976-1977年由马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解）,在2001年，完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础。
原理：ddNTP的3’无羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP （分为：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。
第二代测序技术(NGS)第一代测序技术的主要特点是测序读长可达1000bp，准确性高达99.999%，但其测序成本高，通量低等方面的缺点，严重影响了其真正大规模的应用。
经过不断的技术开发和改进，以Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa、Hiseq技术和ABI公司的Solid技术为标记的第二代测序技术诞生了。
其大大降低了测序成本的同时，还大幅提高了测序速度，并且保持了高准确性，以前完成一个人类基因组的测序需要3年时间，而使用二代测序技术则仅仅需要1周，但在序列读长方面比起第一代测序技术则要短很多，大多只有100bp-150bp。
1.illuminaIllumina公司的Solexa和Hiseq是目前全球使用量最大的第二代测序机器，占全球75%以上，以HiSeq系列为主，技术核心原理都是边合成边测序的方法，测序过程主要分为以下4步：步：1）构建DNA测序文库测序文库DNA分子用超声波打断成200bp-500bp长的序列片段，并在两端添加上不同的接头。
2）测序流动槽（flowcell）结构：Flowcell是测序的载体，课吸附DNA文库，每个flowcell有8条lane，每个lane有2镜头课捕获荧光信号。
DNA测序技术及展望
双脱氧链终止法基本原理：
➢DNA聚合酶不能够区分dNTP和ddNTP，ddNTP参入 到寡核苷酸链的3’-末端，终止DNA链的增长。
➢合成的互补链在不同位置随机终止反应，产生只差一 个核苷酸的DNA分子，读取待测DNA的顺序。
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Sanger 双脱氧末端终止法测序原理
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“双脱氧末端终止”的含义
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PCR（聚合酶链式反应）原理
反应所需物质：DNA模板、引物、DNA聚合 酶、 dNTP、缓冲液
每个循环包括：变性（90℃）、退火（54 ℃）、 延伸（72 ℃）
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所有克隆在同一平面上，反应大规模平行进行， 每个延伸反应所掺入的荧光标记的成像检测也能同时
进行，从而获得测序数据。
DNA序列延伸和成像检测不断重复，最后经计算 机分析获得完整的DNA序列。
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第二代测序技术的特点
*高通量
*准确度高
*成本低
*覆盖度高 *产出巨大
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生命的奥秘蕴藏于 “四字天书”之中
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第二代测序技术
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一、我们将如何应对海量的基因信息新一代测序技术带给人们大量遗传信息的同时，却成为限制其广泛应用的一个障碍。
1980年，英国生物化学家Frederick Sanger与美国生物化学家Walter Gilbert建立了DNA测序技术并获得诺贝尔化学奖，至今已有近三十年了。
在这三十年，DNA测序技术取得了令人瞩目的进展。
目前已进入市场的循环阵列测序平台采用的是与Sanger生物化学测序方法完全不同的原理。
在过去几年，应用极为广泛的毛细管电泳测序法采用的则是多线并行阵列格式，它运用尖端的荧光成像技术进行碱基识别。
上述各类新技术为生物学研究领域开辟了新的视角，也使实验研究达到一个新的水平。
学界对开发这类新技术的兴趣持续高涨，与此同时，人们却发现这些技术存在一定的不足——大量信息数据的产生限制了技术更加广泛的应用，并降低了其市场价值。
过去，研究人员使用Applied Biosystems（ABI）公司的3730XL毛细管电泳测序仪进行基因分析，每年至多能完成六千万碱基的测序量。
随着测序技术日新月异的发展，这种情况已经成为历史。
在2005年刚刚开始进行新一代测序技术开发时，Roche公司和454公司联合开发的焦磷酸测序仪的分析速度就已经达到了上述提及的ABI仪器速度的50倍之上。
也就是从那时起，因基因数据过多而产生的问题凸显了出来，而且这个问题随着其他制造商开发出更多更快的测序仪而愈加严重。
举个例子，ABI的新一代测序平台SOLiD（supported oligonucleotide ligation and detection）单次运行，便可以分析6Gb的碱基序列；而Roche/454测序仪单次运行可以将上述结果转换成12-15个千兆字节（gigabytes）的数据信息；Illumina Genome Analyzer（GAII）测序系统仅在两个小时的运行时间里，就得到10兆兆字节（terabytes）的信息。
尽管对于像Applied Biosystems这样的制造商而言，可以为用户提供高达11.25TB的存储量，但对于多数实验室所具有的信息管理系统来说，规模如此庞大的数据信息，就好像是迎面而来的洪水，让人感到难以控制。
过量信息所带来的一个副作用在于，用户无法将初始图像数据进行分类存档，而必须交给相关公司，利用软件对数据进行读取，然后才能对数据进行保存。
对于大多数研究人员来说，像这样在每次实验后对原始数据进行处理的方式既繁琐又不经济。
与花费上万美元对每一段序列进行备份分析相比，对每一次测序结果进行重新测定显然是一个更简单、更便宜的选择。
测序仪制造商称，对原始数据再次进行分析并不能得到更多新的信息。
但是，对于454测序仪而言，用户至少可以通过更新的软件从原始数据得到质量更高的序列，从而提高碱基识别分辨率，减少误差。
除数据处理问题之外，研究人员还需要拥有一个足够强大的计算机平台，以便将来自多个测序技术的短小基因片段进行组合，形成基因组外显子。
目前问题在于，测序仪生产商仅仅提供用于某些特定基因信息分析的软件，如靶标重测序、基因表达分析、染色质免疫沉淀反应或基因组从头测序等，而并未提供任何其它类型的下游生物学信息分析软件。
研究界越来越熟悉这些测序平台对循证生物学的巨大潜力，这也就产生了新的研究问题以及全新类型的试验方法，而这单凭依赖目前的生物学信息是无法满足的。
从这个角度看，SOLiD软件研发公司（/gf/）于今年七月刚刚兼并了两个新的软件公司，这一举动无疑朝正确的方向迈进了一步。
该公司在开放源码许可证下开发软件分析工具，目的就是为了给生物信息学领域提供支持，并为其开发新的算法。
对用户而言，如果能够将数据格式与不同测序平台获得的结果进行比较所得的统计数字进行标准化，无疑具有重大的意义。
特别是由于目前以测序平台为核心的市场竞争激烈，因此每个生产商都努力提供最好的数据结果。
在这样的大环境下，对数据及不同产品的比较结果进行标准化，便显得尤为重要。
有一个方法可以更好地对不同的新一代测序技术进行比较，那就是建立一个微阵列定性分析小组（Microarray Quality Control consortium），不仅可以对不同的技术结果进行比较，而且还可以将新技术结果与DNA微阵列或定量PCR 进行比较。
综合以上各类因素，可以预见的是，新一代测序平台在近几年内，仍然会局限于少数实验室及研究者，而大多数缺少能够对基因信息进行进一步分析的实验室则无法从新测序技术中获益。
对大多数实验室而言，即使新一代的测序平台能够提供更多的信息，DNA微阵列分析仍然是一个相对便宜的选择。
例如，在转录分析中，虽然新一代测序结果不仅能给出具有很大动态范围的基因丰度信息，同时还可提供剪切变异信息以及SNP数据，但是这些数据结果都需要进行不同的DNA微阵列分析才能获得。
那么，有没有什么方法可以解决这些问题呢？首先，相关的资金授予机构应该对生物信息学的发展予以与测序技术同等的关注；此外，由于生物信息学发展中的瓶颈已经限制了测序机器的销售，测序仪生产商也应该联合起来解决这一难题。
同时，制造商应该致力于制定以研究领域为基础而不是以不同公司为基础的生物信息学解决方案。
因此，如果新一代测序平台真的能够带动基因组测序“普及化”——让基因组测序从大型测序中心走入每个研究人员的实验室或者小型研究小组，那么还需要研究人员付出更多努力，开发出经济实惠的分析软件以及数据管理系统。
目前的状况是，与新一代测序技术相关的生物信息学分析工作仅仅掌握在少数人手里，但是这一具有重要价值的技术毫无疑问应该由大多数人掌握。
如果数据处理问题不能得到有效解决，那么ABI公司的SOLiD系统、454公司的超高通量基因组测序系统——GS FLX、Illumina公司的GAII系统等新一代测序仪就永远无法真正出现在能够展现其价值的舞台上。
原文检索：Editorial. (2008) Prepare for the deluge. Nature Biotechnology, 26(10): 1099.二、传统的DNA测序技术——Sanger测序法自上世纪90年代初，所有的DNA测序操作几乎无一例外地全部采用半自动化毛细管电泳Sanger测序法。
而后来出现的高通量测序方法则首先采用以下两种方法中的一种对DNA进行预处理。
无论采用以上哪种方法处理后，我们均可以得到大量的待测序模板片段——质粒或PCR产物。
随后，测序仪会进行“循环测序”反应。
在每一轮测序反应的引物延伸步骤中，会随机引入已被四种不同颜色荧光分别标记的ddNTP（ddATP、ddTTP、ddGTP、ddCTP）以终止延伸反应。
这样就形成了大量末端被荧光标记的、长短不一（终止位点不同）的延伸产物。
接着，再用高分辨率的毛细管凝胶电泳分离这些延伸产物，通过对延伸产物末端四种不同荧光颜色的区分，计算机软件会自动“读出”DNA序列。
不过，该方法在“读取”每一个碱基信息时都有可能出错。
后续操作中，比如基因组组装或者找出变异位点等就是具体情况具体解决了。
一般，这种高通量测序仪一次最多只能同时进行96个或384个样品测序。
Sanger DNA测序技术经过了30年的不断发展与完善，现在已经可以对长达1,000bp的DNA片段进行测序了，而且对每一个碱基的读取准确率高达99.999%。
在高通量基因组鸟枪法测序操作当中，使用Sanger测序法的费用大约为0.5美元/1,000个碱基。
原文检索：Jay Shendure & Hanlee Ji. (2008) Next-generation DNA sequencing. Nature Biotechnology,26(10):1135-1145.三、新一代DNA测序技术DNA测序技术已广泛应用于生物学研究的各个领域，很多生物学问题都可以借助高通量DNA测序技术予以解决。
过去三年，大规模平行测序平台（massively parallel DNA sequencing platform）已经发展为主流的测序技术，这项测序技术的出现不仅令DNA测序费用降到了以前的百分之一，还让基因组测序这项以前专属于大型测序中心的“特权”能够被众多研究人员分享。
目前，新的测序技术及手段还在不断涌现，比如最新的进展就包括建立序列数据库、建立序列数据分析新方法以及设计测序试验等等。
新一代DNA测序技术有助于人们以更低廉的价格，更全面、更深入地分析基因组、转录组及蛋白质之间交互作用组的各项数据。
今后，各种测序将成为一项广泛使用的常规实验手段，这有望给生物学和生物医学研究领域带来革命性的变革。
DNA测序技术经历了漫长而曲折的发展历程。
迄今为止，我们获得的绝大部分DNA序列都是基于Sanger 测序法获得的。
在过去5年间，人们至少从以下四个方面刺激了DNA测序技术的发展。
1. 具有代表性的新一代DNA测序仪最近市面上出现了很多新一代测序仪产品，例如美国Roche Applied Science公司的454基因组测序仪、美国Illumina公司和英国Solexa technology公司合作开发的Illumina测序仪、美国Applied Biosystems公司的SOLiD测序仪、Dover/Harvard公司的Polonator测序仪以及美国Helicos公司的HeliScope单分子测序仪。
所有这些新型测序仪都使用了一种新的测序策略——循环芯片测序法（cyclic-array sequencing），也可将其称为“新一代测序技术或者第二代测序技术”。
所谓循环芯片测序法，简言之就是对布满DNA样品的芯片重复进行基于DNA的聚合酶反应（模板变性、引物退火杂交及延伸）以及荧光序列读取反应。
2005年，有两篇论文曾对这种方法做出过详细介绍。
与传统测序法相比，循环芯片测序法具有操作更简易、费用更低廉的优势，于是很快就获得了广泛的应用。
虽然这些新一代测序仪以及芯片的实际制作过程似乎都和传统的测序方法有很大的不同，而且各有特点（表3），但实际上它们背后的原理和技术都是非常相似甚至是相同的（图1b）。
新一代测序法首先也是将基因组DNA 随机切割成小片段DNA分子，然后在体外给这些小片段分子的末端连接上接头制成文库，也可以使用配对标签（mate-paired tag）制成跨步文库（jumping libraries）。
随后可以通过原位polony（in situ polony，小词典1）、微乳液PCR（emulsion PCR）或桥式PCR（bridge PCR）（图5）等方法获得测序模板。
上述方法有一个共同点，那就是任何一个小片段DNA分子的PCR扩增产物都是在空间上聚集的：原位polony法和桥式PCR法中所有的产物都集中在平板的某处，在微乳液PCR法（emulsion PCR）中所有的产物都集中在微珠的表面。