酶法制备魔芋甘露寡糖和产物分析
魔芋葡甘露寡糖的制备、化学结构及对胰岛NO自由基释放量的影响
魔芋葡甘露寡糖的制备、化学结构及对胰岛NO自由基释放量的影响陈秀敏;吕秀菊;傅德贤;欧阳藩【期刊名称】《中国生物化学与分子生物学报》【年(卷),期】2002(18)6【摘要】魔芋精粉经β 甘露聚糖酶酶解成寡糖后 ,用活性炭柱进行分离纯化 ,以不同浓度 (5 % ,10 % ,2 0 % )的乙醇洗脱 .研究不同洗脱组分对链脲佐菌素 (STZ)诱导糖尿病模型的胰岛NO自由基释放量的影响 .发现 1mg ml以 5 %乙醇洗脱的寡糖可以使胰岛培养液中的NO自由基释放量平均下降2 5 4 % (P <0 0 5 ) ,0 1mg ml以 5 %乙醇洗脱的寡糖使NO自由基水平下降 2 0 % (P <0 0 5 ) .结果表明 ,5 %乙醇洗脱的魔芋寡糖对保护胰岛免受链脲佐菌素 (STZ)的破坏有一定的作用 .用凝胶色谱、红外光谱、元素分析、核磁共振光谱、质谱等方法初步分析了 5 %乙醇洗脱的魔芋寡糖的化学结构 .发现该糖是一种四糖 ,分子量为 6 6 6 .其推测性结构式为:β D Man(1→ 4 ) β D Man(1→ 4 ) β D Glc(1→ 4 )α D Man ,β D Man(1→4 ) β D Glc(1→ 4 ) β D Man(1→ 4 )α D Man或β D Glc(1→ 4 ) β DMan(1→4 ) β D Man(1→ 4 )α D Man .【总页数】5页(P741-745)【关键词】降血糖作用;魔芋;葡甘露寡糖;制备;化学结构;胰岛;NO自由基释放量;影响【作者】陈秀敏;吕秀菊;傅德贤;欧阳藩【作者单位】中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室【正文语种】中文【中图分类】R285;Q946.3【相关文献】1.魔芋葡甘露聚糖的化学结构与流变性质 [J], 许时婴;钱和2.含魔芋胶/魔芋葡甘露低聚糖悬浮饮料的制备 [J], 吴月蛟;邓利玲;张志刚;钟耕3.魔芋葡甘露寡糖的干燥加热硒酸化及其产物的抗氧化性 [J], 和智坤;赵改红;李梦婷;王晓燕;李灿鹏4.魔芋葡甘露寡糖铬(Ⅲ)络合物的制备及其对小鼠血糖的影响 [J], 陈秀敏;傅德贤;欧阳藩5.魔芋葡甘露聚糖化学结构及改性研究进展 [J], 陈秀敏;傅德贤;欧阳藩因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
酸酶结合法水解魔芋葡甘露聚糖工艺研究
4. 5 -
3. 11
5. 0 13. 6 2. 88
5. 5 -
2. 76
6. 0 13. 4 2. 68
3期
陶兴无 : 酸酶结合法水解魔芋葡甘露聚糖工艺研究
3
从 表 2 可 以 看 出 , 使 用 柠 檬 酸 水 解 效 果 差 (6. 0 h后水解液的粘度才达到 13. 4 mPa. s) ,且加 入的柠檬酸量较大 ( 200 mL 溶液用量达 30. 72 g) , 无实际应用价值 。采用酸性较强的盐酸水解 KGM , 盐酸用量少 ,但水解效果比柠檬酸要好得多 。 2. 3 KGM 的酸酶结合降解
表 2 KGM 酸解液的粘度 /m Pa. s
酸解时间 / h 柠檬酸 盐酸
0
1. 0
30 500. 00 32. 2
30 500. 00 -
1. 5 20. 2 8. 74
2. 0 16. 5 7. 49
2. 5 15. 3
-
3. 0 14. 3 4. 80
3. 5 -
3. 93
4. 0 13. 9 3. 40
表 1 KGM 酶解液的粘度 /m Pa. s
酶解时间 / h β2葡聚糖酶
纤维素酶 对照 (不加酶 )
0 30 500. 00 30 500. 00 30 500. 00
0. 5 25. 12 1500. 00
—
1. 0 10. 62 480. 00 30 100. 00
1. 5 7. 86 230. 00
JJ21增力电动搅拌器 (江苏省金坛市医疗仪器 厂 ) ; HHSZ212不锈钢恒温水浴锅 (武汉市琴台医疗 器械厂 ) ; DHG29140A 电热恒温鼓风干燥箱 (上海精 宏设备有限公司 ) ; NDJ21 旋转黏度计 (上海精科天 平厂 ) ; TDL 25离心机 (上海安亭科学仪器厂 ) ; 7220 分光光度计 (尤尼柯上海仪器有限公司 ) 。 1. 3 实验方法 1. 3. 1 KGM 的酶解 称取一定量魔芋精粉 ,溶解 于少量 pH缓冲液中 ,搅拌溶胀 1h后 ,定容至试验 要求的浓度 。然后置恒温水浴锅上加热 ,并加入酶 制剂 。酶解一定时间后 ,取出加热 5m in灭酶 。冷却 后再用蒸馏水定容至反应前体积 (补充蒸发的水 分 ) ,离心并取上清液测粘度 、还原糖和总糖含量 。 1. 3. 2 KGM 的酸解 称取一定量魔芋精粉 ,溶解 于少量蒸馏水中 ,搅拌溶胀 1h后 ,定容至试验要求 的浓度 。然后置 80 ℃恒温水浴锅上加热 ,并加入 酸 。酸解一定时间后取出 ,冷却后再用蒸馏水定容 至反应前体积 (补充蒸发的水分 ) ,离心并取上清液 测粘度 、还原糖和总糖含量 。
饲用葡甘露低聚糖的酶法制取
饲用葡甘露低聚糖的酶法制取摘要：葡甘露低聚糖是一种重要的双歧因子，近年来已被作为一种功能性饲料添加剂，成为动物营养研究的新方向。
试验通过对黑曲霉酸性β-甘露聚糖酶酶解魔芋粉制备甘露寡糖进行条件研究，获得了以葡甘露低聚糖为主的酶解产物。
酶解条件为：用煮沸的 pH 值 3.5 的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制 180 g/l 的魔芋粉溶液，加酶量按 30 IU/g 魔芋粉计算，酶解水浴温度为65 ℃，酶解时间为4 h。
酶解结束后，将酶解液进行高温灭菌并接种酿酒酵母进行发酵，发酵温度为30 ℃，摇床转速200 r/min，发酵 20 h 后将发酵液离心，所得上清液即为不含单糖的葡甘露低聚糖，得率可以达到35.73%（以魔芋粉计）。
关键词：葡甘露低聚糖；β-甘露聚糖酶；魔芋粉葡甘露低聚糖是双歧杆菌和乳酸菌最好的生长因子之一，除具有一般低聚糖的双歧因子功能外，尚具有吸附、排除人和动物肠道病原菌，调节免疫功能，增强人和动物非特异性免疫活性，促进肝脏合成甘露糖结合蛋白等独特的生理功能。
近年来已被作为一种功能性饲料添加剂，成为动物营养研究的新方向(张力华等，2006) 。
葡甘露聚糖是魔芋块茎特有的主要成分，是由 d-葡萄糖和 d-甘露糖按 1： 1.6 摩尔比以β-1，4 糖苷键连接的杂多糖，其含量约为 44%～64%。
β-甘露聚糖酶是一类能够水解甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖及半乳葡萄甘露聚糖的内切酶，β-甘露聚糖酶水解植物胶(如角豆胶、瓜儿豆胶和魔芋等)可生成低聚甘露糖，引起了国内外食品、医药、动物饲料添加剂等领域的兴趣。
文中对β-甘露聚糖酶酶解魔芋粉制备葡甘露低聚糖的条件进行研究。
1 材料与方法1.1 酸性β-甘露聚糖酶的来源黑曲霉 Aspergillus niger MA-56 由本课题组筛选分离获得，为酸性β-甘露聚糖酶高产菌株（李艳丽等，2009；许少春等，2009）。
发酵培养基（以 10 g 干基为标准）：麸皮 8 g、豆粕 2 g、魔芋粉 0.1 g。
酵母甘露寡糖及其制备方法和应用
《酵母甘露寡糖：制备方法和应用》一、引言在当今社会，随着人们对健康饮食的重视和需求的增加，功能性食品逐渐受到人们的关注和喜爱。
其中，酵母甘露寡糖作为一种功能性食品成分，受到了越来越多的关注。
它在医学、保健品、食品等领域有着广泛的应用，对人体健康起着重要的作用。
本文将深入探讨酵母甘露寡糖及其制备方法和应用，帮助读者更全面地了解这一主题。
二、酵母甘露寡糖的概念酵母甘露寡糖是一种由酵母菌发酵制备而成的寡糖，具有多种生物活性，是一种天然的生长促进剂。
在多种生物学功能方面均有研究表明具有广阔的应用前景。
酵母甘露寡糖通常被制备成粉剂或溶液形态应用在食品、医药和保健品等领域。
三、酵母甘露寡糖的制备方法1. 酵母发酵法酵母发酵法是指将酵母菌培养在适宜的培养基中，通过其对底物的代谢作用合成寡糖。
这种方法制备的酵母甘露寡糖纯度较高，操作简便。
2. 酶法酶法是利用酶催化反应，将酵母菌中的多糖水解成寡糖。
这种方法得到的酵母甘露寡糖纯度较高，适用于大规模工业生产。
3. 生物技术法生物技术法是利用生物技术手段，将酵母菌中的基因进行改良，使其在代谢过程中能够直接合成寡糖，从而得到酵母甘露寡糖。
这种方法的制备成本较低，但操作复杂度较高。
四、酵母甘露寡糖的应用1. 食品行业酵母甘露寡糖可作为一种功能性糖类添加剂，被广泛用于保健食品、乳制品、饮料、烘焙食品等领域，具有调节肠道菌群、增强免疫力、促进钙质吸收等作用。
2. 医药行业酵母甘露寡糖在医药领域被用作一种治疗肠道疾病的药物成分，具有抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗过敏等多种功能，对人体健康有着积极的影响。
3. 其他领域除了食品和医药领域，酵母甘露寡糖还在化妆品、农业等领域有着广泛的应用，如在护肤品中起到保湿、抗菌的作用，在农业中可以用作生长促进剂。
五、个人观点和总结通过本文对酵母甘露寡糖的深入探讨，我对其功能和应用有了更加全面深入的了解。
酵母甘露寡糖作为一种功能性食品成分，具有广泛的应用前景，在人体健康和医疗保健方面发挥着重要的作用。
魔芋甘露聚糖肽的制备工艺及理化特性研究
魔芋甘露聚糖肽的制备工艺及理化特性研究魔芋甘露聚糖肽的制备工艺及理化特性研究摘要：魔芋甘露聚糖肽是一种新型的活性多糖肽，具有广泛的生物功能和医疗应用前景。
本文通过研究魔芋甘露聚糖肽的制备工艺和理化特性，旨在为其进一步应用提供科学依据和参考。
1. 引言魔芋甘露聚糖肽是从魔芋中提取的一种新型多糖肽，其结构特殊且活性突出。
魔芋甘露聚糖肽具有抗氧化、抗肿瘤、降血脂等生物功能，并且对人体健康具有明显的保健作用。
因此，研究魔芋甘露聚糖肽的制备工艺和理化特性，对其广泛应用具有重要意义。
2. 制备工艺2.1 魔芋提取将新鲜魔芋经过洗净、切片、蒸煮等处理工艺，使其表面的有毒物质和杂质得以去除。
然后使用水或酸进行提取，取得魔芋提取液。
2.2 蛋白酶水解将魔芋提取液与蛋白酶进行反应，在适宜的温度和pH条件下进行酶解反应。
通过控制反应时间和酶解度，可以得到魔芋的蛋白质水解产物。
2.3 水解产物纯化采用超滤、透析等分离技术，将魔芋蛋白质水解产物中的杂质、溶剂等去除，得到纯净的魔芋甘露聚糖肽。
3. 理化特性3.1 成分分析利用高效液相色谱法（HPLC）分析魔芋甘露聚糖肽的分子量分布和含量。
通过比较样品与标准品的峰面积，计算出魔芋甘露聚糖肽的含量。
3.2 理化性质测定魔芋甘露聚糖肽的溶解度、水分吸附性、离子交换容量等理化性质。
结果表明，魔芋甘露聚糖肽具有良好的溶解度和吸水性，同时还具有一定的离子交换容量。
3.3 结构分析通过红外光谱分析和核磁共振技术，研究魔芋甘露聚糖肽的分子结构。
结果显示，魔芋甘露聚糖肽中含有多种官能团和结构单元，这些结构单元赋予了其生物活性和功能性。
4. 结论本研究通过对魔芋甘露聚糖肽的制备工艺和理化特性进行研究，为其应用提供了科学依据和参考。
魔芋甘露聚糖肽具有广泛的生物功能和医疗应用前景，未来有望成为一种重要的保健和治疗物质。
此外，魔芋甘露聚糖肽的结构也需要进一步研究，以更好地理解其生物活性和功能性通过对魔芋甘露聚糖肽的制备工艺和理化特性的研究，我们得到了以下结论：魔芋蛋白质水解产物可以通过控制反应时间和酶解度来得到。
甘露聚糖酶制备魔芋葡甘露低聚糖的研究_李剑芳
按文献[ 10 ]并略作改动 :吸取 011 mL 适当稀释 的粗酶液 ,加到 214 mL 用 p H 418 的 Na2 HPO42柠檬 酸缓冲液配制的质量浓度为 5 g/ L 的角豆胶溶液中 , 50 ℃准确反应 15 min ;采用 DNS 法测定酶解产生的 还原糖量 。在上述条件下 ,以每分钟酶解角豆胶底物 产生 1μmol 还原糖 (以甘露糖计) 的酶量定义为 1 个 β2甘露聚糖酶单位 ( IU) 。 11212 魔芋胶总糖含量测定
微生物发酵法是利用葡甘露低聚糖的难发酵性 ,
选择合适的微生物 (如酿酒酵母) 将酶解产物中的甘
露糖等可发酵性单糖除去 ,从而提高葡甘露低聚糖的
纯度[2 ] 。酵母发酵方法 :在待处理的魔芋胶酶解液中
添加酵母膏 210 g/ L 、蛋白胨 410 g/ L 、NaCl 012 g/ L 、
MgSO4·7 H2O 012 g/ L 、KH2 PO4 015 g/ L ,自然 p H ,
610 23197 50142
710 21108 44134
去离子水 27142 57167
21212 酶解加酶量的选择
试验了不同加酶量 (以 IU/ g 魔芋胶计) 对魔芋
胶水解率的影响 (表 2) 。
表 2 加酶量对魔芋胶水解率的影响
加酶量 / IU·g - 1 还原糖量 / g·L - 1 水解率
产黄青霉β-甘露聚糖酶的高效表达、性质及应用
产黄青霉β-甘露聚糖酶的高效表达、性质及应用甄红敏1，华晓晗1，马俊文2，温永平1,3，李延啸2,*，闫巧娟2,*，江正强1（1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083；2.中国农业大学工学院，北京100083；3.蒙牛高科乳制品（北京）有限责任公司，北京100101）摘 要：将产黄青霉（Penicillium chrysogenum）来源的β-甘露聚糖酶（Pc Man26A）在毕赤酵母中高效表达，经高密度发酵，发酵液酶活力达25 200 U/mL。
该酶属于GH26家族，与黑曲霉（Aspergillus niger）CBS 513.88来源的β-甘露聚糖酶同源性最高（67.8%），是一个新型β-甘露聚糖酶。
Pc Man26A的最适催化条件为pH 6.0和50 ℃，在pH 4.0～8.0和45 ℃下具有良好的稳定性。
该酶对魔芋粉具有最高的比活力，为3 581.0 U/mg。
进一步利用该酶水解魔芋粉得到魔芋甘露寡糖，产品得率为86.2%；经分析，其主要组分为聚合度大于4的甘露寡糖。
该β-甘露聚糖酶适用于生产魔芋甘露寡糖，为魔芋甘露寡糖的酶法生产提供了更多的选择。
关键词：产黄青霉；β-甘露聚糖酶；毕赤酵母；魔芋粉；甘露寡糖High-level Expression, Characterization, and Application of a Novel β-Mannanase from Penicillium chrysogenum ZHEN Hongmin1, HUA Xiaohan1, MA Junwen2, WEN Yongping1,3, LI Yanxiao2,*, YAN Qiaojuan2,*, JIANG Zhengqiang1(1. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China;2. College of Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China;3. Meng Niu Hi-Tech Dairy (Beijing) Co. Ltd., Beijing 100101, China)Abstract: A cloned β-mannanase (Pc Man26A) gene from Penicillium chrysogenum was successfully expressed in Penicillium chrysogenum. At the end of high cell density fermentation, the enzymatic activity of the fermentation supernatant reached 25 200 U/mL. The enzyme belonged to the glycoside hydrolase family 26 and shared the highest amino acid sequence identity (67.8%) with β-mannanase from Aspergillus niger CBS 513.88. The optimal reaction conditions for Pc Man26A were pH 6.0 and 50 ℃, and it was stable at 45 ℃ and within a broad pH range of 4.0–8.0. The enzyme showed the highest specific activity (3 581.0 U/mg) towards konjac powder. Furthermore, Pc Man26A was used for konjac powder hydrolysis, yielding konjac manno-oligosaccharide with a yield of 86.2%. The main composition of the konjac manno-oligosaccharide was manno-oligosaccharides with degree of polymerization > 4. The recombinant β-mannanase provides a new option for the enzymatic production of konjac manno-oligosaccharide.Keywords: Penicillium chrysogenum; β-mannanase; Pichia pastoris; konjac powder; manno-oligosaccharideDOI:10.7506/spkx1002-6630-20200819-248中图分类号：Q814 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2021）08-0098-08引文格式：甄红敏, 华晓晗, 马俊文, 等. 产黄青霉β-甘露聚糖酶的高效表达、性质及应用[J]. 食品科学, 2021, 42(8): 98-105.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20200819-248. ZHEN Hongmin, HUA Xiaohan, MA Junwen, et al. High-level expression, characterization, and application of a novel β-mannanase from Penicillium chrysogenum[J]. Food Science, 2021, 42(8): 98-105. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20200819-248. 收稿日期：2020-08-19基金项目：国家自然科学基金青年科学基金项目（31901627）；中国博士后科学基金面上项目（2018M641539）第一作者简介：甄红敏（1986—）（ORCID: 0000-0003-2233-1639），女，博士后，研究方向为食品生物技术。
魔芋甘露聚糖肽制备技术研究
魔芋甘露聚糖肽制备技术研究魔芋甘露聚糖肽制备技术研究引言魔芋甘露聚糖肽是一种新型的生物活性多糖肽，具有广泛的应用前景。
魔芋是一种天然植物，其根茎富含魔芋甘露聚糖，而魔芋甘露聚糖则是由魔芋中提取得到的。
魔芋甘露聚糖肽具有多种生物活性，包括抗肿瘤、降血糖、降血脂等作用，因此受到了越来越多的关注。
魔芋甘露聚糖肽制备技术魔芋甘露聚糖肽的制备技术主要包括魔芋提取、酶解、纯化和评价等步骤。
1. 魔芋提取魔芋富含魔芋甘露聚糖，因此首先需要将魔芋从植物中提取出来。
提取魔芋的方法通常有水煮、蒸煮和酶解等。
水煮法是目前应用较为广泛的一种方法，它能够高效地溶解魔芋甘露聚糖，并且能够同时去除魔芋中的杂质。
蒸煮法和酶解法相对来说操作更加简单，但是提取效果较水煮法略差。
2. 酶解酶解是将魔芋中的魔芋甘露聚糖水解成肽段的过程。
常用的酶有红曲酵素、玉米淀粉酶等。
酶解的条件包括酶解温度、pH值、酶解时间等。
在酶解过程中，需要控制好这些参数，以达到最佳的酶解效果。
研究表明，酶解时间和酶解温度是影响魔芋甘露聚糖肽得率和分子量分布的重要因素。
3. 纯化纯化是将酶解产物中的目标魔芋甘露聚糖肽提取出来的过程。
常用的纯化方法包括离心、超滤、反渗透和离子交换等。
离心是最简单的一种方法，它能够去除酶解产物中的悬浮颗粒。
超滤和反渗透则是通过膜的选择性渗透性质将魔芋甘露聚糖肽分离。
离子交换则是利用魔芋甘露聚糖肽的带电性与离子交换树脂之间的作用力进行分离。
4. 评价评价是对制备得到的魔芋甘露聚糖肽进行活性检测的过程。
常用的评价指标包括抗氧化活性、保护胃粘膜、抗炎活性等。
抗氧化活性是最常用的一种评价指标，它可以通过自由基清除实验来确定。
保护胃粘膜和抗炎活性则可以通过小鼠实验来评价。
发展趋势随着对生物活性多糖肽的研究不断深入，对魔芋甘露聚糖肽的制备技术也在不断改进。
目前，有学者利用基因工程的方法将魔芋甘露聚糖肽的合成酶引入到合适的宿主中进行大规模生产。
此外，还有学者利用纳米技术将魔芋甘露聚糖肽封装起来，以提高其生物利用度和稳定性。
酶法制备魔芋甘露寡糖和产物分析
２０％ｋｏｎｊａｃ，ａｎｄ ｔｈｅｎ
ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ
ｋｏｎｊａｃ
ｉＴｌａｎｎｏｓｅ－ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｗａｓ
ａｎａｌｙｓｉｓｅｄ，Ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ
（７）：５２０．５２１．
‰＠）＝、／灯伪）＋订④１）＋时＠２）＋玎④３），由表４，
计算‰ｌⅨ）＝１．８１ｘ１０－２，则“何）＝０．００４。 ２．２．６扩展不确定度 取包含因子ｋ＝２，则扩展不确定度为ＵⅨ）＝０．００８。
２．２．７测量不确定度的结果报告与表示
该白酒样品中氰化物含量的测定结果为Ｘ＝（０．２１±
ｆ１．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆＬｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｙｕｎｎａｎ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅ岱ｉｔｙ，Ｋｕｎｍｉｎｇ ６５００９２，Ｃｈｉｎａ；２．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅ
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆＢｉｏｍａｓｓ Ｅｎｅｒｇｙ，Ｍｉｍ＇ｓｔｒｙ ｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｋｕｎｍｉｎｇ ６５００９２，Ｃｈｉｎａ）
【５】ＧＢ／Ｔ ５７５０．５—２００６，生活饮用水标准检验方法无机非金属指标【ｓ】． 【６】郭虹．异烟酸一巴比妥酸分光光度法测定酒中氰化物【Ｊ】．中国卫生 检验杂志，２００５，１５（１２）：１４５２．１４５３． 【７】ＪＪＦ １０５９－１９９９测量不确定度评估与表示【Ｓ】．
２０１ ３ Ｖ０１．３２ Ｎｏ．５
Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆｋｏｎｊａｃ ｍａｎｎｏｓｅ－ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｂｙ
魔芋葡甘露聚糖的酶解
魔芋葡甘露聚糖的酶解方法一实验所需原料：魔芋精粉；0.2mol/lPBS缓冲液（需用Na2HPO4·12H2O，NaH2PO4·2H2O 配制）；β-甘露聚糖酶（10000u/g）；DNS试剂（由3，5-二硝基水杨酸，NaOH，酒石酸钠，苯酚，偏重亚硫酸钠配制）。
实验所需器材及仪器：1000ml容量瓶(2个)；滴定管（量取或配制溶液时使用）；250ml 锥形瓶；恒温水浴锅；恒温振荡器；冷冻离心机；紫外-可见分光光度计；移液枪预实验：1. PBS缓冲液的配制：（1）母液的配制：0.2mol/L Na2HPO4：称取71.6g，溶于1000mL水0.2mol/L NaH2PO4：称取31.2g NaH2PO4·2H2O，溶于1000mL水（2）pH6.0 87.7mL 0.2mol/L NaH2PO4·2H2O +12.3mL Na2HPO4·12H2O pH7.0 38mL 0.2mol/L NaH2PO4·2H2O +62mL Na2HPO4·12H2OpH8.0 5.3mL 0.2mol/L NaH2PO4·2H2O +94.7mL Na2HPO4·12H2O这只是大致比例，精确pH值需用pH计配制。
2.DNS试剂的配制方法（1）称取3，5-二硝基水杨酸6.3g，NaOH 21.0g充分溶解于500mL煮沸的蒸馏水中（煮沸是为了加速溶解）。
（2）加入酒石酸钠182.0g，苯酚5.0g，偏重亚硫酸钠5.0g于上一步的溶液中，加热搅拌至全部溶解，冷却，用蒸馏水定容至1000mL。
（3）充分溶解后盛于棕色瓶中，储存1周后使用。
实验步骤：⑴打开水浴锅，设定温度为50℃.⑵用量筒量取100ml一定pH的PBS缓冲液于锥形瓶中，塞上塞子置于水浴锅中加热，至50℃（可用温度计量）。
⑶用称量纸称取0.25g的魔芋精粉备用。
酶催化魔芋葡甘聚糖的可控降解
32002210214收稿,2002212228修稿;2001年国家留学回国人员启动基金和2003年广州市科技计划应用基础研究项目资助;33通讯联系人酶催化魔芋葡甘聚糖的可控降解3祁 黎1 李光吉133 宗敏华2(1华南理工大学高分子材料科学与工程系 广州 510640)(2华南理工大学生物工程系 广州 510640)摘 要 魔芋葡甘聚糖(KG M )是一种来自植物的天然高分子.它具有优异的可生物降解性和生物相容性,并具有许多独特的生理和药理功能.本实验首先测定了β2甘露糖酶在不同条件(温度、pH 值、介质)下的活性,发现β2甘露糖酶在50℃左右,pH 914附近,乙醇含量低于5%的水介质中具有较高的活力;而在pH 710以下,或温度低于30℃,或加入20%乙醇的条件下均基本上失活.在此研究基础上,探讨了β2甘露糖酶催化KG M 降解反应的规律,通过调节反应条件制备了一系列分子量不同的降解样品,并确定了KG M 的分子量与特性粘数之间的关系为:[η]=5106×10-4M 01754w ,使得酶催化KG M 的可控降解成为可能,从而为深入研究KG M 及其衍生物的结构与性能,扩展其应用领域奠定了良好的理论和实验基础.关键词 魔芋葡甘聚糖,β2甘露糖酶,可控降解,酶催化 魔芋是一种天南星科魔芋属的草本植物.魔芋葡甘聚糖(K onjac glucomannan ,简称KG M )是魔芋的主要成分,在干魔芋块茎中的含量高达55%～60%[1].它是由D 2葡萄糖(G )和D 2甘露糖(M )按1∶116或1∶1169的摩尔比通过β21,42吡喃糖苷键结合的复合多糖.KG M 通常带有短支链,并含有少量乙酰基[2,3].它在食品、石油、化工、纺织、医疗及化妆品等行业都具有广泛的用途[4].国内已有一些学者对KG M 的理化性质和开发应用进行了研究.其中,中科院成都生物所的贾成禹、莫卫平等[5]研究了KG M 的结构、凝胶性能和应用;华中农业大学的谢笔钧等[6]研究了KG M 及其衍生物的制备和应用;近年来,武汉大学的田炳寿等[7,8]对KG M 的长链脂肪酸酯的常规化学法制备以及产物的乳化性能进行了探讨,何东保等[9]研究了KG M 与黄原胶的协同作用及凝胶化性质,张俐娜等[10～12]则对KG M 与其它天然高分子的复合膜的性质和应用进行了较为深入的研究.一般说来,KG M 的分子量可达106数量级.高分子量一方面使其具有优良的增稠性、凝胶性,另一方面却使其应用范围受到了很大限制.能够实现KG M 的可控降解,得到预期分子量范围的KG M 将极大地扩展KG M 的应用领域.本研究利用生物催化反应具有高效、专一、条件温和、产物较纯以及对环境的影响较小等优点,选择嗜碱性β2甘露糖酶[13]作为催化剂来实现KG M 的可控降解.1 实验材料及仪器111 实验材料和试剂魔芋精粉(3A 2PF 2120),由海南多环保健品有限公司提供;嗜碱性β2甘露糖酶,由中国科学院北京微生物研究所提供.其它试剂均为分析纯,使用前未经处理.112 主要实验仪器NDF 21A 型旋转式粘度计:上海安德仪器设备公司;751G 型分光光度计:上海分析仪器厂;乌式粘度计:毛细管孔径015～016mm ,30℃±015℃条件下水流出时间>100s ;真空冷冻干燥机:德国Christ 公司,Alpha 122型.2 实验方法211 β2甘露糖酶活力的测定将250mg 魔芋精粉溶于50m L 一定pH 的缓冲液中,不加或加入一定量的无水乙醇,磁力搅拌,得到均匀的水溶胶;取910m L 该水溶胶于刻度试管内,加入410m L β2甘露糖酶(含410mg 固体酶),混合均匀;然后,将这一试管置于一定温度的水浴中保温20min ,再置于沸水中加热5min ,使酶失活.水解液经过滤后,将滤液定容到50m L ,第5期2003年10月高 分 子 学 报ACT A PO LY MERIC A SI NIC AN o.5Oct.,2003650用3,52二硝基水杨酸法[14](DNS 法)测定滤液中的还原糖的含量.本研究中pH 值为410、710和810的缓冲溶液由磷酸氢二钠2柠檬酸体系组成;pH 值为910、914和1010的缓冲溶液由甘氨酸2氢氧化钠体系组成,分别如表1和表2所示.T able 1 The preparation of Na 2HPO 42citric acid bu ffer s olution pH 012m ol ΠL Na 2HPO 4S olution(m L )011m ol ΠL Citric acid s olution(m L )410717112129710161473153810191450155T able 2 The preparation of glycin 2NaOH bu ffer s olution pH 012m ol ΠL G lycin s olution(m L )012m ol ΠL NaOH S olution(m L )910508189145016181010503210 β2甘露糖酶的活力定义为在一定条件(温度、pH 、底物浓度)下,每毫克β2甘露糖酶每分钟能催化生成的还原糖的量(μm ol ).212 β2甘露糖酶催化KG M 降解反应将一定量的β2甘露糖酶溶于尽量少的蒸馏水中,并将所得的酶液加入100m L pH 为910的缓冲液中,于30℃水浴中边搅拌边加入一定量的KG M ,搅拌反应一定时间后向反应体系中加入一倍体积的乙醇,终止降解反应.沉淀出来的降解产物过滤并用无水乙醇多次洗涤和脱水,经真空冷冻干燥、碾磨后得到白色粉末状的KG M 降解产物.213 特性粘度的测定将降解产物配成浓度为0105%的水溶液,在30℃±015℃的条件下用乌式粘度计测定其特性粘数.214 分子量测定用Waters 公司的G PC 测定一组KG M 降解产物的分子量.测试条件:Waters 410检测器,Ultrahydrogel 500凝胶柱,柱温40℃,流动相为NaCl 溶液,流速为016m LΠmin.3 结果与讨论311 β2甘露糖酶活力的影响因素实验研究了β2甘露糖酶在一定条件下,反应温度、pH 值和反应介质水Π乙醇中的乙醇含量对酶的活力的影响及其规律,结果分别如图1、2、3所示.由图1可以看到,在30℃～70℃之间,β2甘露糖酶均具有催化活力;在50℃附近催化活力最高.但进一步的实验发现,较高反应温度下得到的KG M 降解产物的水溶性变差.因此,为了得到水溶性好的降解产物,下一步的酶催化降解反应均在30℃下进行.Fig.1 Enzyme activity as a function of tem perature pH 914;E thanol :0%图2则显示,在中性和酸性条件下,β2甘露糖酶对这一反应没有催化活力.而在碱性条件下,特别是pH 914附近,β2甘露糖酶表现出较高的催化活力.同时,考察了pH 为1110时酶的活力.这一实验表明,在pH 为1110的介质中,KG M 水溶胶在受热条件下不稳定,形成不可逆凝胶,故无法测出此条件下相应的酶的活力.Fig.2 Enzyme activity as a function of pH of the medium Reaction tem perature :60℃;E thanol :0%图3反映了当反应体系中乙醇含量低于5%时,乙醇的存在对酶活力的影响不是很明显.随着乙醇含量的增加,酶的活力下降很快.当乙醇含量达到10%时,酶的活力几乎下降了一半;当乙醇含量达到20%时,酶基本上失去了活力.因此,在1565期祁黎等:酶催化魔芋葡甘聚糖的可控降解Fig.3 Enzyme activity as a function of ethanol content in the mediumReaction tem perature :60℃;pH 914酶催化KG M 降解反应中,当达到预定反应时间后,向体系中加入20%(V ΠV )以上的乙醇可确保酶催化反应及时中止.312 β2甘露糖酶催化KG M 降解产物分子量的表征图4显示了酶用量为8mg 的条件下,不同底物(KG M )浓度下的酶催化KG M 降解反应过程中,降解产物的特性粘数[η]随降解反应时间的变化.可以看出,随着降解反应的进行,[η]快速下降;初始底物浓度越低,则[η]下降的速度越快;随着反应时间的延长,这种下降的趋势减缓.特性粘数的变化趋势反映了分子量的变化趋势,即KG M 的分子量在降解反应开始后的10min 快速下降,随后趋于平缓.分子量降低速率变慢可以从β2甘露糖酶的性质以及它对聚多糖的作用机理上来进行分析.Fig.4 The curves of intrinsic viscosity versus degradation time for the KG M sam ples enzymatically degraded KG M at various substrate concentrationsβ2M annanase :810mg ;Reaction tem perature :30℃葡甘聚糖是一种杂多糖,它由葡萄糖单元(G )和甘露糖单元(M )以1∶116或1∶1169的比例随机连接构成.虽然连接各糖单元的均是β21,4糖苷键,但依然存在着种类上的不同,即连接不同糖单元的β21,4糖苷键属于不同的类型.例如葡甘聚糖就有4种β21,4糖苷键:甘露糖苷键(M →M )、葡萄糖苷键(G →G )、甘露糖2葡萄糖糖苷键(M →G )和葡萄糖2甘露糖苷键(G →M ).日本学者甲藤等[15]做过通过β21,4糖苷键连接的二糖类的酸降解研究.研究结果表明,不同种类的β21,4糖苷键的“强度”不同.在反应开始后,弱的β21,4糖苷键如M →G 和M →M 被迅速切断,强的β21,4糖苷键如G →M 和G →G 则保留下来,因而降解反应的速率随反应时间的延长而降低.由此可以推测,酶催化降解过程中同样存在这一现象,即虽然β2甘露糖酶能够使β21,4糖苷键断裂,但使不同种类的β21,4糖苷键断裂的难易程度不同.在反应初期,大量存在的较弱的β21,4糖苷键迅速被β2甘露糖酶切断,降解反应迅速发生;随着降解反应的进行,较易断裂的部位减少,故分子量的降低趋于平缓.用G PC 测定了未降解KG M 样品以及一组酶催化降解的KG M 样品的分子量.用lg M w 对lg[η]作图,结果如图5所示.Fig.5 The plot of lg M w versus lg[η]for the aqueous s olution of KG M sam ples prepared by enzyme 2catalyzed degradation对图5中的lg M w 2lg[η]关系进行线性回归分析,可以得到lg M w 与lg[η]之间存在着的数学关系:lg M w =11327×lg[η]+41371(1)经数学变换可得到:[η]=5106×10-4M 01754w (2)K ishida 等[16]曾给出部分甲基化的KG M (DS =0145)的特性粘数和分子量之间的关系,即[η]=6137×10-4M 0174w(3)256高 分 子 学 报2003年 K ishida 等人之所以选用甲基化KG M 而不是未甲基化改性的KG M ,是因为他们发现未甲基化改性的KG M 溶解性和溶液的稳定性都不够好,给特性粘数的测定带来困难.经过甲基化后,产物的溶解性和溶液的稳定性都得到了很大的改善,使这一问题得到了解决.在本研究中,曾尝试将试样配制成012g ΠdL 的溶液来进行特性粘数的测定,结果也发现溶液的稳定性不够好,流出时间的重现性比较差.然而,当将KG M 溶液的浓度降至0105g ΠdL 后,流出时间就能表现出良好的重现性,溶液的稳定性问题不再对特性粘数的测定造成影响.比较式(2)和(3),可以看出,二者的α值比较接近,而本研究中所测得的k 值要小于K ishida 等所得到的M w 2[η]关系式中的k 值,这应该与K ishida 等对KG M 进行了甲基化改性有关.KG M 特性粘数与分子量之间数学关系的确定,使KG M 分子量的确定更加便捷,使其可控降解成为可能,为扩展KG M 的应用范围提供了实验基础.另外研究了酶的用量对KG M 降解反应的影响.图6给出了底物(KG M )浓度为2%,反应温度为30℃,介质pH 为910,降解时间为20min 条件下,降解产物的特性粘数随酶用量的变化规律.由图6可以看出,酶的浓度越高,相同条件下降解产物的特性粘数就越低.当酶浓度达到48mg ΠdL 时,这种下降的趋势明显地变缓.Fig.6 The plot of intrinsic viscosity versus enzyme concentration for the KG M sam ples prepared by the enzymatic degradation reactionatvarious enzymeconcentrationsSubstrate concentrion :2%;Reaction time :20m in ;Reaction tem p.:30℃;pH 910 通过对β2甘露糖酶催化魔芋葡甘聚糖可控降解反应的研究,可以得出以下结论:β2甘露糖酶在50℃左右,pH 914附近,乙醇含量低于5%的水介质中具有较高的活力;而在pH 710以下,或温度低于30℃,或加入20%乙醇的条件下均基本上失活;在降解反应初期,KG M 的特性粘数快速下降,随后趋于平缓;酶的浓度越高,相同条件下降解产物的特性粘数就越低,当酶浓度达到48mg Πd L 时,下降趋势明显变缓;KG M 的特性粘数与其重均分子量之间的关系为:[η]=5106×10-4M 01754w .REFERENCES1 M o X iangtao (莫湘涛),Zhang M eifen (张梅芬),Li M inyan (李敏艳).Journal of Hunan N ormal University (Natural Science )(湖南师范大学自然科学学报),1998,21(1):85～882 Vipul Dav é,S tephen P M cCarthy.J Environ P olym Degrad ,1997,5(4):237～2413 Z ou X inxi (邹新禧),X ie M eiran (谢美然).M odern Chem ical Industry (现代化工),1995,15(12):15～174 W ang G uiyun (王桂芸).Fine and S pecial Chem icals (精细与专用化学品),1998,21:9～105 Jia Chengyu (贾成禹),Chen Suwen (陈素文),M o W eiping (莫卫平),M o Y iwen (蒙义文),Y ang Lei (杨磊).Chinese Biochem ical Journal (生物化学杂志),1988,4(5):407～4136 Hu M in (胡敏),Hu W eiwang (胡慰望),X ie Bijun (谢笔钧).J of Wuhan University (Natural Science Edition )(武汉大学学报(自然科学版)),1994,3:101～1097 T ian Binshou ,D ong Changm ing ,Chen Lei.J Appl P olym Sci ,1998,67(6):1035～10388 T ian Bingshou (田炳寿),D ong Changm ing (董常明),Luo Ding fa (骆定法).Acta P olymerica S inica (高分子学报),1999,(3):326～3309 He D ongbao (何东保),Zhan D ong feng (詹东风),Zhang W enju (张文举).Acta P olymerica S inica (高分子学报),1999,(4):460～46410 Y ang G uang ,Zhang Lina ,Y amane Chihiro ,M iyam oto Ikuya ,Inam oto M iki ,Okajima K unihiko.Journal of M embranes Science ,1998,139:47～5611 X iao Chaobo ,G ao Shanjun ,W ang Heng ,Zhang Lina.J Appl P olym Sci ,2000,76:509～51512 X iao Chaobo ,G ao Shanjun ,Zhang Lina.J Appl P olym Sci ,2000,77:617～62613 M a Y anhe (马延和),T ian X inyu (田新玉),Zhou Peijin (周培瑾).Acta M icrobiological S inica (微生物学报),1991,31(6):443～4483565期祁黎等:酶催化魔芋葡甘聚糖的可控降解456高 分 子 学 报2003年14 Zhang Longxiang(张龙翔),Zhang T ing fang(张庭芳),Li Lingyuan(李令媛).T echnique and M ethods of Biochem istry Experiments(生化实验技术和方法).Beijing(北京):People’s Education Press(人民教育出版社),198116～1115 K ato K,M atsuda K.Agr Biol Chem,1972,36:639～64216 N oriko K ishida,S tatoshi Okimasu,T oshio K amata.Agric Biol Chem,1978,42(9):1645～1650ENZ YME2CATA LYZE D CONTR OLLAB LE DEGRADATIONOF K ON JAC G L UCOMANNANQI Li1,LI G uangji1,Z ONG Minhua2(1Department o f Polymer Science and Engineering;2Biotechnology Department,South China Univer sity o f Technology,Guangzhou 510640)Abstract K onjac glucomannan(KG M)is a natural polymer from a plant.It possesses excellent biodegradability, biocom patibility and many unique physiological and pharmacological functions.In this w ork the effects of various factors(i.e.,tem peratures,pH,medium)on the activity ofβ2mannanase was firstly studied.The results show thatβ2mannanase possesses high activity in the aqueous medium(pH914)containing enthanol less than5%(VΠV) at about50℃,and basically lose its activity in the medium with pH lower than710or containing enthanol m ore than 20%(VΠV),or at tem peratures lower than30℃.Based on these results,the degradation reaction of KG M catalyzed byβ2mannanase and its affecting factors were investigated,and a series of KG M sam ples with different m olecular weights was prepared by adjusting the reaction conditions.M oreover,the intrinsic viscosity([η])and the weight2 average m olecular weight(M w)of the degraded KG M products were measured,obtaining the following equation:[η] .This w ork makes it possible to realize controllable degradation of KG M by means of an =5106×10-4M01754wenzyme2catalyzed reaction,thus laying a s olid experimental and theoretical foundation for further studying the structure and properties of KG M and its derivatives,and developing new application fields of them.K ey w ords K onjac glucomannan,β2mannanase,C ontrollable degradation,Enzyme2catalyze。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
‰＠）＝、／灯伪）＋订④１）＋时＠２）＋玎④３），由表４，
计算‰ｌⅨ）＝１．８１ｘ１０－２，则“何）＝０．００４。 ２．２．６扩展不确定度 取包含因子ｋ＝２，则扩展不确定度为ＵⅨ）＝０．００８。
２．２．７测量不确定度的结果报告与表示
该白酒样品中氰化物含量的测定结果为Ｘ＝（０．２１±
用０．１ｍｏｌ／Ｌ柠檬酸缓冲液和０．２ｍｏｌ／Ｌ磷酸氢二钠缓
冲液配成ｐＨ值为５．５、６．０、６．５、７．０、７．５的磷酸氢二钠．柠檬 酸缓冲液各１００ｍＬ，准确称取０．３９魔芋粗粉分别加入上述 不同ｐＨ值的缓冲液中，加热制各成魔芋胶溶液；用缓冲 液配置５ＩＵ／ｍＬ的１３一甘露聚糖酶液。向４组试管（每组６支） 中分别加入１．８ⅡｌＬ魔芋胶，４５℃水浴５ｍｉｎ后，分别向试管中入
合成不确定度
Ｕ饼）＝０．００８。各不确定度分量评定结果显示，白酒中氰化 物含量测定的不确定度主要来源于重复性实验引入的不 确定度及标准溶液引入的不确定度，故本实验要求人员 具有较高的操作水平，且应从正规渠道采购符合要求的标 准溶液。 本方法较国标方法操作简便、快捷，且克服了国标法 中显色液浑浊、回收率低等问题，可替代国标法，作为白酒 中氰化物检测的方法。 参考文献：
附表葡萄糖标准曲线的设定
Ａ牡ａｃｈｅｄ ｔａｂｌｅ Ｓｅｔｔｉｎｇ ｇｌｕｃｏｓｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔａｎｄａｒｄ
ｃｕｒｖｅ
体系０ 体系中标准物／ｍｇ 双蒸水／．２ １．８ ３
２ ０．４ １．６ ３
３ ０．６ １．４ ３
４ ０．８ １．２ ３
Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆｋｏｎｊａｃ ｍａｎｎｏｓｅ－ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｂｙ
ＨＥ Ｄａｎｌ，ＧＵＯ Ｘｉｏｎ９１，ＹＡＮＧ Ｓｈｕａｎｇｌｉａｎｌ，ＬＩ
ｐ－ｍａｎｎａｎａｓｅ ａｎｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ
Ｚｕｎｘｉｕ，ＴＡＮＧ Ｘｉａｎｇｈｕａｌ。‘
ａｎａｌｙｓｉｓ
Ｊｕｎｊｕｎｌ，ＨＵＡＮＧ
１：２。
６０ＩＵ／ｍＬ、７０ＩＵ／ｍＬ各５０ｍＬ，ｐＨ值为６，５的Ｂ．甘露聚糖酶液 （要求每克魔芋粉按照５０ＩＵ、１００ＩＵ、１５０ＩＵ、２００ＩＵ、２５０ＩＵ、 ３００ＩＵ、３５０ＩＵＩ约１３．甘露聚糖酶添加，探究酶添加量对寡糖得 率的影响）。向上述梯度的反应瓶中，分别加入１０９魔芋粗粉，
显色剂：２ｍＬ苯胺、２９二苯胺、１０ｍＬ ８５％磷酸溶于
ｆ１．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆＬｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｙｕｎｎａｎ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅ岱ｉｔｙ，Ｋｕｎｍｉｎｇ ６５００９２，Ｃｈｉｎａ；２．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅ
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆＢｉｏｍａｓｓ Ｅｎｅｒｇｙ，Ｍｉｍ＇ｓｔｒｙ ｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｋｕｎｍｉｎｇ ６５００９２，Ｃｈｉｎａ）
【ｌ】王汉斌，牛文凯，刘晓玲．急性氰化物中毒的诊治现状【Ｊ】．中国全科医 学，２００９，１２（１０Ｂ）：１８８２．１８８４． 【２】李源栋，樊林，钱海燕，等．酒中氰化物测定方法的研究进展【Ｊ】酿 酒，２００９，３６（６）：１６．１８。 【３】黄选忠，杜洪山，吕全勇．ＣＴＭＡＢ．异烟酸．吡唑酮显色光度法测定 白酒中氰化物的研究［Ｊ】．湖北预防医学杂志，２００１，１２（１）：３５．３６． 【４】辛若竹，康澍．白酒中氰化物测定方法的改进［Ｊ】．理化检验，２００５，４１
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ
ａｓ
ｗｅｉ＇ｅ
ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｂｙ ｏｎｅ－ｗａｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｐＨ ｖａｌｕｅ，ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｅｎｚｙｍｅ ａｄｄｅｄ ａｎｄ
ｔｉｍｅ．Ｔｈｅ
ｍａｎｌｙ
ｏｐｔｉｍａｌ
ｆｏｌｌｏｗ，ｐ・ｍａｎｎａｎａｓｅ ２５０ＩＵ／ｇ，ｐＨ ｖａｌｕｅ ６．５，ｅｎｚｙｍｏｌｙｓｉｓ ｉｎ ４５℃ｆｏｒ ５０ｍｉｎ．Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅｓｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｔｈｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ
１．１．３
１００ｍＬ丙酮中。 １．２试验方法 １．２，ｌ葡萄糖标准曲线的制作 准确称取１００ｍｇ干燥葡萄糖，用少量蒸馏水溶解后， 转移多］１００ｍＬ容量瓶中，定容、摇匀，浓度为ｌ ｍｇ／ｍＬ。按附 表分别加入试剂，将各管溶液混合均匀后，在沸水浴中加 热５ｍｉｎ，立即用冷水冷至室温，分别定容至２０ｒａＬ，摇匀，于 波长５４０ｈｍ处测吸光度值。然后根据吸光度值作标准曲线。
研究报告
中
国
酿造
２０１３年第３２卷第５期 总第２５４期
・８７・
５ １．０ １．０ ３
６ １．２ ０．８ ３
１．２．２魔芋粗粉酶解寡糖得率（以还原糖计）的测定
用Ｂ．甘露聚糖酶水解魔芋粗粉，将酶水解后的产物经 离心取上清液适当稀释后，用ＤＮＳ法测定酶解液中还原糖 的含量，寡糖得率计算公式：
寡糖得率（％）＝酶解液中还原糖的量（ｇ）／魔芋精粉的量（ｇ）
１．２．３
ｐＨ值对酶水解魔芋粉能力的影响
０．２ｍＬ
３－甘露聚糖酶液４５℃水浴５ｍｉｎ，对照组加入０．２ｍＬ蒸
馏水，反应１０ｍｉｎ，取出加入３ｍＬ ＤＮＳ试剂，煮沸５ｍｉｎ， 定容至２０ｍＬ，波长５４０ｎｍ处比色，测定还原糖含量。 １．２．４反应温度对酶水解魔芋粉能力的影响 配锘ｌＪｐＨ值为６．５的０．３％魔芋胶溶液和５１Ｕ／ｍＬ酶液，向 ４组试管（每组６支）中分别加入１．８ｍＬ魔芋胶，并分别将其 置于３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃的水浴锅中，恒温水 浴５ｒａｉｎ，加入０．２ｍＬ酶液，对照组加入０．２ｍＬ蒸馏水，反应 １０ｍｉｎ，取出加入３ｍＬＤＮＳ试剂，煮沸５ｍｉｎ，定容至２０ｍＬ， 波长５４０ｎｍ处比色，测定还原糖含量。 １．２．５酶添加量对寡糖得率的影响 根据１．２＿３和１．２．４的试验结果，选取ｐＨ值为６．５，温度为 ４５％的条件下，研究不同量的酶降解２０％底物的魔芋粉，分 别配制ｌ ０砌／ｍＬ、２０ＩＵ／ｍＬ、３０ＩＵ／ｍＬ、４０ＩＵ／ｍＬ、５０ｎ
【５】ＧＢ／Ｔ ５７５０．５—２００６，生活饮用水标准检验方法无机非金属指标【ｓ】． 【６】郭虹．异烟酸一巴比妥酸分光光度法测定酒中氰化物【Ｊ】．中国卫生 检验杂志，２００５，１５（１２）：１４５２．１４５３． 【７】ＪＪＦ １０５９－１９９９测量不确定度评估与表示【Ｓ】．
２０１ ３ Ｖ０１．３２ Ｎｏ．５
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ，口・ｍａｎｎａｎ鹤ｅ ＷａＳ ｕｓｅｄ ｔｏ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ
２０％ｋｏｎｊａｃ，ａｎｄ ｔｈｅｎ
ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ
ｋｏｎｊａｃ
ｉＴｌａｎｎｏｓｅ－ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｗａｓ
ａｎａｌｙｓｉｓｅｄ，Ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ
研究报告
中
国
酿造
２０１３年第３２卷第５期 总第２５４期
・８５・
酶法制备魔芋甘露寡糖和产物分析
何丹－，郭 熊，，杨双莲，，李俊俊１，黄遵锡“ｚ，唐湘华ｎｚ木
（１．云南师范大学生命科学学院，云南昆明６５０５００；２．生物能源持续开发利用教育部工程研究中心，云南昆明６５０５００） 摘要：利用Ｂ一甘露聚糖酶水解２０％魔芋粗粉制备魔芋甘露寡糖并对其产物进行成分分析。在工艺研究中对反应的ｐＨ值、温度、酶添 加量、时间等进行单因素试验，确定最佳工艺条件为酶添加量为２５０ＩＵ／ｇ，ｐＨ值６．５，４５℃条件下，酶解５０ｍｉｎ，寡糖得率为３５％。魔芋甘 露寡糖的粗产物经硅胶薄层层析（ｎＣ）分离表明。三糖、四糖含量较大。 关键词：Ｂ．甘露聚糖酶；魔芋粗粉；魔芋甘露寡糖；薄层层析 中图分类号：ＴＳ２０２。３ 文献标识码：Ａ 文章编号：０２５４－５０７１（２０１３）０５—００８５—０４
・８６・
Ｓｅｒｉａｌ Ｎｏ．２５４
Ｃｈｉｎａ Ｂｒｅｗｉｎｇ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｐｏｒｔ
魔芋是唯一可进行商业化提取魔芋葡甘聚糖的植 物，广泛分布在云南、贵州、四川Ｉ等地【ｌ】。魔芋甘露寡糖 （ＭＯＳ）又称甘露低聚糖或甘露寡聚糖，能利用Ｂ．甘露聚 糖酶降解魔芋葡甘聚糖得到。ＭＯＳ是由几个甘露糖分子或 甘露糖与葡萄糖主要通过ｄ—ｌ，２糖苷键、ｏ【一ｌ，３糖苷键、仅．１， ６糖苷键或ｐ．１，４糖苷键、Ｂ．１，３糖苷键连接成的寡聚糖【２】。 魔芋甘露寡糖具有极高的应用价值，国ｉ为Ｊ＇ｂ科学家做 了大量的相关研究。在国内，江海燕等［３】的实验表明，利用 实硫酸化魔芋葡甘低聚糖对Ｈｅｐ Ｇ２．２．２．１５细胞株ＨＢｓＡｇ、 ＨＢｅＡｇ和乙肝病毒ＤＮＡ的产生均有一定程度的抑制作 用，其中对ＨＢｓＡｇ最为显著；高启禹等【４】对糖尿病小鼠模 型的研究表明，甘露寡糖具有降低血清中的血脂作用；于 艳梅等［５１研究表明，魔芋甘露寡糖能提高黄颡鱼非特异性 免疫功能。在国外，ＭＩＧＵＥＬ ＪＣ等Ｉ叼报道，甘露寡糖作为断 奶仔猪的生长促进剂，断奶初期仔猪的应激最大，此时饲 喂甘露寡糖，效果最好；ＢＡＲＢＡＲＡ Ｇ等［７－８）研究表明，饲喂 寡糖可以促进肠道内有益菌的生长、抑制有害菌的繁殖， 改善肠道微生态系统、提高非特异性免疫，最终达到促进 生长的目的。魔芋甘露寡糖具有重要的功能，但是在甘露 寡糖的组分中，功能性糖是哪一类还没有具体的报道，本 次实验旨在通过１３一甘露聚糖酶降解魔芋甘露聚糖，并利用 硅胶薄层层析（ＴＬＣ）对其产物进行分析，以期为其后期进 行单一组分的化学分析研究奠定基础，同时也是为其工业 化生产提供理论依据。 １材料与方法 １．１材料与仪器 １．１．１主要试剂 魔芋粗粉：云南丽江市玉元食品有限公司；３－甘露聚 糖酶（酶活力７９５１ＩＵ／ｇ，最适温度４５％，最适ｐＨ值为６．０）： 昆明爱科特生物有限公司；葡萄糖：Ｓｉｇｍａ公司；其他试剂 均为国产分析纯。 １．１．２主要材料 ＵＶ一２０００型紫外分光光度计：上海菁华科技有限公司； Ｇ一硅胶板：青岛海洋化工厂分厂；电子天平：奥豪斯仪器有 限公司；ｐＨ计：赛多利斯科学仪器有限公司；恒温水浴锅。