两种等温扩增技术在二代测序病毒鉴定中的应用(新)
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Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ
Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｎａｔｉｏｎａｌ
１ ０２２０６，Ｃｈｉｎａ
ｆｏｒ
Ｖｉｒａｌ Ｄｉｓｄｅａｓｅ
Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ
Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｃｅｎｔｅｒ
ｆｏｒ
Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ
ｄｓＤＮＡ １．３
ＨＳ分析试剂盒定量。 等温扩增产物采用Ｉｏｎ
ＭｉＳｅｑ
两种检测方法覆盖度的分析
为了进一步观
二代测序及数据分析
察ＳＰＩＡ和ＭＤＡ两种扩增方法对病毒基因组覆盖度 的影响，我们对样本Ａ中的两种病毒进行了病毒基 因组覆盖度分析（表２）。结果显示，对于２２９Ｅ病 毒，ＳＰＩＡ可获得１２．２％的基因组覆盖，ＭＤＡ只覆盖 了７．４％的基因组区域。对于ＰＩＶ２病毒，ＳＰＩＡ可获 得８６．７％的基因组覆盖，且大部分区域覆盖深度高 于５×；而ＭＤＡ覆盖了７９．６０％的区域，且大部分区 域覆盖度低于５×。 ３讨论 临床样本由于采集量受限，在进行ＮＧＳ测序时
ＭＤＡ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ａｐｐｌｉｅｄ
ｔｏ
ｄｅｔｅｃｔ
ｏｆ ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ
ＳＰＩＡ ａｎｄ
ｐａｔｈｏｇｅｎ
ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｅｃｏｎｏｍｉｃ
ｕｓｉｎｇ ＮＧＳ ｉｎ
ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ．ＳＰＩＡ
ｔｏ
ｐｏｓｓｅｓｓｅｄ ｌｏｗｅｒ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｎｄ
ｉｎ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅ．
ｈｉｇｈｅｒ
ｃｏｓｔ，ｂｕｔ ｈａｄ ｈｉｇｈｅｒ ｃａｐａｃｉｔｙ
ｄｉｓｃｏｖｅｒ
ｔｈｅ ｃａｕｓｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ
【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】
Ｆｕｎｄ Ｙｅａｒ
Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；Ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ；Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｋｅｙ Ｐｒｏｇｒａｍ ｏｆ Ｍｅｇａ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ
ｐｒｉｍｅｒ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ
ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ＮＧＳ）得到了飞速发展，极大的促进了 其在公共卫生领域的应用…。ＮＧＳ技术结合高灵 敏度的核酸扩增，可以极大的提高临床实验室发现 病原的能力。目前，ＮＧＳ越来越多的用于临床实验
ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏ，ＳＰＩＡ）…和多重置换扩增（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ
Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ
ｔｏ
Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｖｉｒｕｓ．
（ＭＤＡ）ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ａｎｄ
Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ＳＰＩＡ
ｆｕｒｔｈｅｒ ｐｒｏｃｅｅｄｅｄ
ＮＧＳ ａｎｄ
ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｓ
ｉｄｅｎｔｉｆｙ
ｐｒｏｄｕｃｅｄ
ｓｈｏｒｔｅｒ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｔｈａｎ
与ＭＤＡ扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示， ＳＰＩＡ扩增产物主要分布在２００～５００ ｂｐ之间，条带 亮度较小；而ＭＤＡ扩增的产物大部分均大于２
０００
ｂｐ，且条带较亮，扩增效率高（图１）。ＤＮＡ定量结 果显示，ＳＰＩＡ扩增产物量为４００～６００ ｎｇ，而ＭＤＡ 扩增产物量为５～８“ｇ。 ２．２两种等温扩增方法对目标病毒的鉴定 两份 样本ＲＮＡ通过ＳＰＩＡ和ＭＤＡ扩增后进行二代测序， 共获得了１７８
ｔｗｏ
ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ
Ｚｏｕ
ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ
ｐａｔｈｏｇｅｎ
ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｕｓｉｎｇ
ｔｈｅ
ｎｅｘｔ
ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｎａｔｏｎａｌ
Ｘｉａｏｈｕｉ．Ｚｈａｏ Ｘｉａｎｇ，Ｆｅｎｇ Ｚｈａｏｍｉｎ，Ｗａｎｇ Ｄａｙａｎ，Ｓｈｕ Ｙｕｅｌｏｎｇ
ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｐｒｏｇｒａｍ：Ｃｈｉｎｅｓｅ
Ｄｉｓｅａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ
Ｎａｔｉｏｎａｌ １２ｔｈ Ｆｉｖｅ－
Ｐｌａｎ（２０１４ＺＸｌ０００４００２）
近年来，下一代测序技术（Ｎｅｘｔ
ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ
室病原鉴定，并取得了一系列成果…。ＮＧＳ技术已 经成为临床病原鉴定的一种重要技术手段，得到了 各个国家的高度重视‘“。 单引物等温扩增（ｓｉｎｇｌｅ
ＭＤＡ，ａｎｄ
ｈａｄ
ａ
ｌｏｗｅｒ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｔｈｅ
ｔｏ
ＳＰＩＡ Ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｔｈａｔ ｉｎ
ｏｎｅ
ｔａｒｇｅｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎ Ｂｏｔｈ
ｔｈｅ ｔｗｏ
ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅｓ ｔｅｓｔｅｄ．ｗｈｉｌｅ ＭＤＡ ｆａｉｌｅｄ
０ Ｏ ２１ ３ ５６５ ３０５
ｌＯ １ ５０４ ２９６
ｌ ２ ７４７ １３９ １７８ ８１４
０ ０ ０ １ ３１６ ０９８
总Ｒｅａｄｓ数目ＮＯ．Ｔｏｔａｌ
ｒｅａｄｓ
表２
Ｔａｂ・２
ＳＰＩＡ和ＭＤＡ扩增产物目标病毒覆盖度分析（样本Ａ）
ｔｗｏ
Ｖ１ＦＵＳ Ｉｎ
病毒
Ｖｉｒｕｓ
方法
Ｍ８‘ｈ。ｄｓ ＳＰＩＡ
基Ｇ因ｅ组ｎｏｍ大ｅ小—ｊ西爵ｉ———————垄堕塑墼生生兰竺里生芝≥———ｉ面＿～
Ｔｏｒｒｅｎｔ
ＰＧＭ（平均读长为２００ ｂｐ）或Ｉｌｌｕｍｉｎａ
（ＰＥ２５０）测序。ＮＧＳ数据采用ＣＬＣ
ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ
ｇｅｎｏｍｉｃｓ
７．５软件进行分析。首先将１００ ｂｐ以下
ｑｕａｌｉｔｙ
和质量值（Ｐｈｒｅｄ
ｓｃｏｒｅ）低于２０的ｒｅａｄｓ去
除，剩余的ｒｅａｄｓ进行ｄｅ ｎｏｙｏ组装。取片段长度超 过５００ ｂｐ的Ｃｏｎｔｉｇ进行ＮＣＢＩ ｎｒ数据库ＢＬＡＳＴ。取 ＢＬＡＳＴ检索到的病毒基因组为参考基因组进行 ｍａｐｐｉｎｇ比对。
选取了两份病原已知的重症肺炎病人咽
ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＳＰＩＡ）和多重置换等温扩增
（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＭＤＡ）的方法进行反转录扩增。扩增产物进行ＮＧＳ测序和宏基因
组学分析。结果ＳＰＩＡ扩增产物片段较短，扩增效率较低；而ＭＤＡ扩增的产物片段较长，扩增效率 也高。ＳＰＩＡ法在两份样本中均检测到目标病原，且目标病原基因组覆盖度较高。ＭＤＡ在其中一份
样本中未能检测出目标病原。结论ＳＰＩＡ与ＭＤＡ扩增方法均可用于ＮＧＳ病原鉴定。ＳＰＩＡ法扩增
效率较低，成本较高，但检测病原的能力高于ＭＤＡ。 【主题词】
等温扩增；下一代测序；病原鉴定
基金项目：“十二五”重大传染病专项“人感染新型流感防控技术研究（２０１４ＺＸｌ０００１００２）
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ
Ｍｉｎｉ
ＭＤＡ（Ｓａｍｐｌｅ Ａ ａｎｄ Ｂ）
样本ＲＮＡ采用德国 Ｋｉｔ试剂盒提取，并用
和１５条相应的ｃｏｎｔｉｇ，并分别获得了１１６和１１
１０２
条相应病毒ｒｅａｄｓ；而ＭＤＡ未能组装出２２９Ｅ的 ｃｏｎｔｉｇ，但获得了２１条２２９Ｅ的ｒｅａｄｓ。对于样本Ｂ， ＳＰＩＡ扩增可组装出１条长达２
７４７
ＮＥＢ公司ＤＮａｓｅ Ｉ消化宿主ＤＮＡ。ＲＮＡ采用文献 中介绍的ＳＰＩＡ＂１和ＭＤＡ¨１法进行等温随机扩增。 扩增产物采用Ｑｉａｇｅｎ公司ＭｉｎＥｌｕｔｅ
・２２８・
主堡塞堕塑堕鏖疸耋堂苤查！！！！生！旦筮！！鲞箜！塑
垦！ｉ！！！！！兰！Ｐ堡！！！！！竺！：垒Ｐ至！！！！！：！！！：！！！型！：！
技术方法．
两种等温扩增技术在二代测序病毒鉴定中
的应用
邹晓辉
赵翔
冯兆民
王大燕
舒跃龙
１０２２０６北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所国家流感中心，卫计委医学病 毒和病毒病重点实验室 通信作者：舒跃龙，Ｅｍａｉｌ：ｙｓｈｕ＠ｃｎｉｃ．ｏｒｇ．ｃｎ
Ｃｏｖｅｒａｇｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅ Ａ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ＳＰＩＡ ２３ ２７ ２６３ ２５ ９２７ ２４６ １ ３４１ ２ ０１４ １ ５９８
８ ８０葛
ａｎｄ ＭＤＡ
覆盖百分比
ｔａｇｅ 。
‘５ ５一１５ １５＿２５ ’５００ ｃ。Ｖｅｒａ９８ 。 ｅ （ ｚ Ｕｎｃｏｖｅｒｅｄ ｉＳｎｅ １００ｃ ５００ ｒｅｐ ，ｂｐ） ｂｐ １ ７０５ ３ ２ ０４７
ＤＯＩ：１０．３７６０／ｅｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１００３—９２７９．２０１６．０２．０２９
【摘要】
目的评估两种等温扩增方法在二代测序（Ｎｅｘｔ
ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ
ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ＮＧＳ）病毒鉴定
中的应用，为利用二代测序进行病毒鉴定提供参考。方法 拭子，分别采用单引物等温扩增（Ｓｉｎｇｌｅ
ｐｒｉｍｅｒ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ
８１４～３ ５６５ ３０５
ｒｅａｄｓ（表１）。对于样
本Ａ的两种病毒２２９Ｅ和ＰＩＶ２，ＳＰＩＡ分别组装出４
万方数据
・２３０
主堡塞堕塑堕鏖疸至堂盘查！！！！堡！旦筮塑鲞笙！塑璺！ｉ！！！！』垦翌璺！！！∑ｉ竺！：垒哑！！Ｑ！！：！！！：！！：盟！：！
表１
Ｔａｂ．１ Ｖｉｒｕｓ
ＳＰＩＡ和ＭＤＡ扩增产物病毒分布
２
结果
２．１
ＳＰＩＡ与ＭＤＡ扩增效率比较
取５“ｌ
ＳＰＩＡ
一般需先进行核酸扩增，特别是拭子类的样本，病毒 含量较低，直接提取的核酸量一般不能满足ＮＧＳ的 测序的最低起始量要求，因此，测序之前进行核酸扩 增是ＮＧＳ测序的常规步骤。传统的ＰＣＲ扩增容易 造成模板扩增的偏移，不利于后续的检测。等温扩 增技术具有较好的均一性，在近年来得到了越来越 多的应用‘８１。本研究利用咽拭子样本，比较近年来 发展较快的两种等温扩增方法在ＮＧＳ病原检测上 的应用，为临床实验室开展ＮＧＳ病原检测提供了方 法学参考。 ＲＴ—ＰＣＲ是现阶段临床检测病原微生物的主要
（Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ
ｖｉｒｕｓ 图１
ＳＰＩＡ与ＭＤＡ扩增两份临床样本（Ａ和Ｂ）产物电泳分析
Ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｆｒｏｍ ＳＰＩＡ ａｎｄ
２，ＰＩＶ２）两种病毒混合感染；样
Ｆｉｇ．１
本Ｂ为鼻病毒（Ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ，ＲｎＶ）感染。咽拭子采 集后保存于病毒采样液中，保存于一８０％备用。 １．２样本核酸提取和扩增 Ｑｉａｇｅｎ公司的ＲＮｅａｓｙ
Ｃｌｅａｎｕｐ
Ｒｅａｃｔｉｏｎ
ｂｐ的ｃｏｎｔｉｇ，并
获得１３９ ｒｅａｄｓ，而ＭＤＡ未能发现目的病毒ＲｎＶ的 ｃｏｎｔｉｇ和ｒｅａｄｓ。在各个样本中，ＳＰＩＡLeabharlann Baidu配上的各个 病毒的ｒｅａｄｓ数目明显高于ＭＤＡ。
２．１
Ｋｉｔ纯化。扩增产物进行１％的琼脂糖凝胶
电泳，产物浓度用Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ公司的Ｑｕｂｉｔ＠
Ｔｈｉｓ
ｓｔｕｄｙ ｅｖａｌｕａｔｅｄ ｔｗｏ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅｉｒ ａｂｉｌｉｔｙ
ａ
ｔｏ
ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅｓ，ｗｈｉｃｈ ｐｒｏｖｉｄｅｄ
ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｆｏｒ ｏｔｈｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈｅｒｓ ｕｓｉｎｇ
ｓｅｖｅｒｅ
万方数据
ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ
ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＭＤＡ）Ｅ ｓ］是近年来发展较
好的两种等温扩增技术。本研究利用两份病原已知 的临床样本来评估两种等温扩增方法在临床病原鉴 定中的应用，为临床利用ＮＧＳ技术发现病原提供了 参考。 １材料与方法
１．１
样本信息
两份咽拭子样本均来自临床重症
肺炎病人。ＲＴ－ＰＣＲ方法鉴定样本Ａ为冠状病毒 ２２９Ｅ（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ・２２９Ｅ）和副流感病毒２型
ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ＳＰＩＡ ａｎｄ ＭＤＡ ｐｒｏｄｕｃｔ ｕｓｉｎｇ ＮＧＳ
Ｃｏｎｔｉｇ数目ＮＯ．Ｃｏｎｔｉｇ
最长Ｃｏｎｔｉｇ（ｂｐ）Ｌｏｎｇｅｓｔ ｃｏｎｔｉｇ 病毒ｒｅａｄｓ数目ＮＯ．Ｒｅａｄｓ ｍａｐｐｅｄ
ｔｏ
４ ８８０ ｖｉｒｕｓ １１６ ２ ７２７ ３１０ １１
１５ ９７７ １０２
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｆａｍｉｌｙ Ｐｌａｎｎｉｎｇ
Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ，Ｂｅ讲ｎｇ
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ：Ｓｈｕ Ｙｕｅｌｏｎｇ．Ｅｍａｉｌ：ｙｓｈｕ＠ｃｎｉｃ．ｏｒｇ．ｃｎ
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】０ｂｊｅｃｔｉｖｅ
ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｔｈｅ
ＮＧＳ ｉｎ
ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｓｗａｂｓ ｆｒｏｍ ｔｗｏ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ
Ｐｒｉｍｅｒ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ
ｐｎｅｕｍｏｎｉａ ｗｅｒｅ
ａｍｐｌｉｆｉｅｄ
ｗｉｔｈ
Ｓｉｎｇｌｅ
Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＳＰＩＡ）ｍｅｔｈｏｄ
ｔｏ
ａｎｄ
Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｎａｌｙｓｉｓ
Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｎａｔｉｏｎａｌ
１ ０２２０６，Ｃｈｉｎａ
ｆｏｒ
Ｖｉｒａｌ Ｄｉｓｄｅａｓｅ
Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ
Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｃｅｎｔｅｒ
ｆｏｒ
Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ
ｄｓＤＮＡ １．３
ＨＳ分析试剂盒定量。 等温扩增产物采用Ｉｏｎ
ＭｉＳｅｑ
两种检测方法覆盖度的分析
为了进一步观
二代测序及数据分析
察ＳＰＩＡ和ＭＤＡ两种扩增方法对病毒基因组覆盖度 的影响，我们对样本Ａ中的两种病毒进行了病毒基 因组覆盖度分析（表２）。结果显示，对于２２９Ｅ病 毒，ＳＰＩＡ可获得１２．２％的基因组覆盖，ＭＤＡ只覆盖 了７．４％的基因组区域。对于ＰＩＶ２病毒，ＳＰＩＡ可获 得８６．７％的基因组覆盖，且大部分区域覆盖深度高 于５×；而ＭＤＡ覆盖了７９．６０％的区域，且大部分区 域覆盖度低于５×。 ３讨论 临床样本由于采集量受限，在进行ＮＧＳ测序时
ＭＤＡ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ａｐｐｌｉｅｄ
ｔｏ
ｄｅｔｅｃｔ
ｏｆ ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ
ＳＰＩＡ ａｎｄ
ｐａｔｈｏｇｅｎ
ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｅｃｏｎｏｍｉｃ
ｕｓｉｎｇ ＮＧＳ ｉｎ
ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ．ＳＰＩＡ
ｔｏ
ｐｏｓｓｅｓｓｅｄ ｌｏｗｅｒ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｎｄ
ｉｎ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅ．
ｈｉｇｈｅｒ
ｃｏｓｔ，ｂｕｔ ｈａｄ ｈｉｇｈｅｒ ｃａｐａｃｉｔｙ
ｄｉｓｃｏｖｅｒ
ｔｈｅ ｃａｕｓｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ
【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】
Ｆｕｎｄ Ｙｅａｒ
Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；Ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ；Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｋｅｙ Ｐｒｏｇｒａｍ ｏｆ Ｍｅｇａ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ
ｐｒｉｍｅｒ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ
ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ＮＧＳ）得到了飞速发展，极大的促进了 其在公共卫生领域的应用…。ＮＧＳ技术结合高灵 敏度的核酸扩增，可以极大的提高临床实验室发现 病原的能力。目前，ＮＧＳ越来越多的用于临床实验
ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏ，ＳＰＩＡ）…和多重置换扩增（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ
Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ
ｔｏ
Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｖｉｒｕｓ．
（ＭＤＡ）ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ａｎｄ
Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ＳＰＩＡ
ｆｕｒｔｈｅｒ ｐｒｏｃｅｅｄｅｄ
ＮＧＳ ａｎｄ
ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｓ
ｉｄｅｎｔｉｆｙ
ｐｒｏｄｕｃｅｄ
ｓｈｏｒｔｅｒ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｔｈａｎ
与ＭＤＡ扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果显示， ＳＰＩＡ扩增产物主要分布在２００～５００ ｂｐ之间，条带 亮度较小；而ＭＤＡ扩增的产物大部分均大于２
０００
ｂｐ，且条带较亮，扩增效率高（图１）。ＤＮＡ定量结 果显示，ＳＰＩＡ扩增产物量为４００～６００ ｎｇ，而ＭＤＡ 扩增产物量为５～８“ｇ。 ２．２两种等温扩增方法对目标病毒的鉴定 两份 样本ＲＮＡ通过ＳＰＩＡ和ＭＤＡ扩增后进行二代测序， 共获得了１７８
ｔｗｏ
ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ
Ｚｏｕ
ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ
ｐａｔｈｏｇｅｎ
ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｕｓｉｎｇ
ｔｈｅ
ｎｅｘｔ
ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｎａｔｏｎａｌ
Ｘｉａｏｈｕｉ．Ｚｈａｏ Ｘｉａｎｇ，Ｆｅｎｇ Ｚｈａｏｍｉｎ，Ｗａｎｇ Ｄａｙａｎ，Ｓｈｕ Ｙｕｅｌｏｎｇ
ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｐｒｏｇｒａｍ：Ｃｈｉｎｅｓｅ
Ｄｉｓｅａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ
Ｎａｔｉｏｎａｌ １２ｔｈ Ｆｉｖｅ－
Ｐｌａｎ（２０１４ＺＸｌ０００４００２）
近年来，下一代测序技术（Ｎｅｘｔ
ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ
室病原鉴定，并取得了一系列成果…。ＮＧＳ技术已 经成为临床病原鉴定的一种重要技术手段，得到了 各个国家的高度重视‘“。 单引物等温扩增（ｓｉｎｇｌｅ
ＭＤＡ，ａｎｄ
ｈａｄ
ａ
ｌｏｗｅｒ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｔｈｅ
ｔｏ
ＳＰＩＡ Ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｔｈａｔ ｉｎ
ｏｎｅ
ｔａｒｇｅｔｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎ Ｂｏｔｈ
ｔｈｅ ｔｗｏ
ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅｓ ｔｅｓｔｅｄ．ｗｈｉｌｅ ＭＤＡ ｆａｉｌｅｄ
０ Ｏ ２１ ３ ５６５ ３０５
ｌＯ １ ５０４ ２９６
ｌ ２ ７４７ １３９ １７８ ８１４
０ ０ ０ １ ３１６ ０９８
总Ｒｅａｄｓ数目ＮＯ．Ｔｏｔａｌ
ｒｅａｄｓ
表２
Ｔａｂ・２
ＳＰＩＡ和ＭＤＡ扩增产物目标病毒覆盖度分析（样本Ａ）
ｔｗｏ
Ｖ１ＦＵＳ Ｉｎ
病毒
Ｖｉｒｕｓ
方法
Ｍ８‘ｈ。ｄｓ ＳＰＩＡ
基Ｇ因ｅ组ｎｏｍ大ｅ小—ｊ西爵ｉ———————垄堕塑墼生生兰竺里生芝≥———ｉ面＿～
Ｔｏｒｒｅｎｔ
ＰＧＭ（平均读长为２００ ｂｐ）或Ｉｌｌｕｍｉｎａ
（ＰＥ２５０）测序。ＮＧＳ数据采用ＣＬＣ
ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ
ｇｅｎｏｍｉｃｓ
７．５软件进行分析。首先将１００ ｂｐ以下
ｑｕａｌｉｔｙ
和质量值（Ｐｈｒｅｄ
ｓｃｏｒｅ）低于２０的ｒｅａｄｓ去
除，剩余的ｒｅａｄｓ进行ｄｅ ｎｏｙｏ组装。取片段长度超 过５００ ｂｐ的Ｃｏｎｔｉｇ进行ＮＣＢＩ ｎｒ数据库ＢＬＡＳＴ。取 ＢＬＡＳＴ检索到的病毒基因组为参考基因组进行 ｍａｐｐｉｎｇ比对。
选取了两份病原已知的重症肺炎病人咽
ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＳＰＩＡ）和多重置换等温扩增
（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＭＤＡ）的方法进行反转录扩增。扩增产物进行ＮＧＳ测序和宏基因
组学分析。结果ＳＰＩＡ扩增产物片段较短，扩增效率较低；而ＭＤＡ扩增的产物片段较长，扩增效率 也高。ＳＰＩＡ法在两份样本中均检测到目标病原，且目标病原基因组覆盖度较高。ＭＤＡ在其中一份
样本中未能检测出目标病原。结论ＳＰＩＡ与ＭＤＡ扩增方法均可用于ＮＧＳ病原鉴定。ＳＰＩＡ法扩增
效率较低，成本较高，但检测病原的能力高于ＭＤＡ。 【主题词】
等温扩增；下一代测序；病原鉴定
基金项目：“十二五”重大传染病专项“人感染新型流感防控技术研究（２０１４ＺＸｌ０００１００２）
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ
Ｍｉｎｉ
ＭＤＡ（Ｓａｍｐｌｅ Ａ ａｎｄ Ｂ）
样本ＲＮＡ采用德国 Ｋｉｔ试剂盒提取，并用
和１５条相应的ｃｏｎｔｉｇ，并分别获得了１１６和１１
１０２
条相应病毒ｒｅａｄｓ；而ＭＤＡ未能组装出２２９Ｅ的 ｃｏｎｔｉｇ，但获得了２１条２２９Ｅ的ｒｅａｄｓ。对于样本Ｂ， ＳＰＩＡ扩增可组装出１条长达２
７４７
ＮＥＢ公司ＤＮａｓｅ Ｉ消化宿主ＤＮＡ。ＲＮＡ采用文献 中介绍的ＳＰＩＡ＂１和ＭＤＡ¨１法进行等温随机扩增。 扩增产物采用Ｑｉａｇｅｎ公司ＭｉｎＥｌｕｔｅ
・２２８・
主堡塞堕塑堕鏖疸耋堂苤查！！！！生！旦筮！！鲞箜！塑
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技术方法．
两种等温扩增技术在二代测序病毒鉴定中
的应用
邹晓辉
赵翔
冯兆民
王大燕
舒跃龙
１０２２０６北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所国家流感中心，卫计委医学病 毒和病毒病重点实验室 通信作者：舒跃龙，Ｅｍａｉｌ：ｙｓｈｕ＠ｃｎｉｃ．ｏｒｇ．ｃｎ
Ｃｏｖｅｒａｇｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅ Ａ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ＳＰＩＡ ２３ ２７ ２６３ ２５ ９２７ ２４６ １ ３４１ ２ ０１４ １ ５９８
８ ８０葛
ａｎｄ ＭＤＡ
覆盖百分比
ｔａｇｅ 。
‘５ ５一１５ １５＿２５ ’５００ ｃ。Ｖｅｒａ９８ 。 ｅ （ ｚ Ｕｎｃｏｖｅｒｅｄ ｉＳｎｅ １００ｃ ５００ ｒｅｐ ，ｂｐ） ｂｐ １ ７０５ ３ ２ ０４７
ＤＯＩ：１０．３７６０／ｅｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１００３—９２７９．２０１６．０２．０２９
【摘要】
目的评估两种等温扩增方法在二代测序（Ｎｅｘｔ
ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ
ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ＮＧＳ）病毒鉴定
中的应用，为利用二代测序进行病毒鉴定提供参考。方法 拭子，分别采用单引物等温扩增（Ｓｉｎｇｌｅ
ｐｒｉｍｅｒ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ
８１４～３ ５６５ ３０５
ｒｅａｄｓ（表１）。对于样
本Ａ的两种病毒２２９Ｅ和ＰＩＶ２，ＳＰＩＡ分别组装出４
万方数据
・２３０
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表１
Ｔａｂ．１ Ｖｉｒｕｓ
ＳＰＩＡ和ＭＤＡ扩增产物病毒分布
２
结果
２．１
ＳＰＩＡ与ＭＤＡ扩增效率比较
取５“ｌ
ＳＰＩＡ
一般需先进行核酸扩增，特别是拭子类的样本，病毒 含量较低，直接提取的核酸量一般不能满足ＮＧＳ的 测序的最低起始量要求，因此，测序之前进行核酸扩 增是ＮＧＳ测序的常规步骤。传统的ＰＣＲ扩增容易 造成模板扩增的偏移，不利于后续的检测。等温扩 增技术具有较好的均一性，在近年来得到了越来越 多的应用‘８１。本研究利用咽拭子样本，比较近年来 发展较快的两种等温扩增方法在ＮＧＳ病原检测上 的应用，为临床实验室开展ＮＧＳ病原检测提供了方 法学参考。 ＲＴ—ＰＣＲ是现阶段临床检测病原微生物的主要
（Ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ
ｖｉｒｕｓ 图１
ＳＰＩＡ与ＭＤＡ扩增两份临床样本（Ａ和Ｂ）产物电泳分析
Ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｆｒｏｍ ＳＰＩＡ ａｎｄ
２，ＰＩＶ２）两种病毒混合感染；样
Ｆｉｇ．１
本Ｂ为鼻病毒（Ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ，ＲｎＶ）感染。咽拭子采 集后保存于病毒采样液中，保存于一８０％备用。 １．２样本核酸提取和扩增 Ｑｉａｇｅｎ公司的ＲＮｅａｓｙ
Ｃｌｅａｎｕｐ
Ｒｅａｃｔｉｏｎ
ｂｐ的ｃｏｎｔｉｇ，并
获得１３９ ｒｅａｄｓ，而ＭＤＡ未能发现目的病毒ＲｎＶ的 ｃｏｎｔｉｇ和ｒｅａｄｓ。在各个样本中，ＳＰＩＡLeabharlann Baidu配上的各个 病毒的ｒｅａｄｓ数目明显高于ＭＤＡ。
２．１
Ｋｉｔ纯化。扩增产物进行１％的琼脂糖凝胶
电泳，产物浓度用Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ公司的Ｑｕｂｉｔ＠
Ｔｈｉｓ
ｓｔｕｄｙ ｅｖａｌｕａｔｅｄ ｔｗｏ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅｉｒ ａｂｉｌｉｔｙ
ａ
ｔｏ
ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅｓ，ｗｈｉｃｈ ｐｒｏｖｉｄｅｄ
ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｆｏｒ ｏｔｈｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈｅｒｓ ｕｓｉｎｇ
ｓｅｖｅｒｅ
万方数据
ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ
ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＭＤＡ）Ｅ ｓ］是近年来发展较
好的两种等温扩增技术。本研究利用两份病原已知 的临床样本来评估两种等温扩增方法在临床病原鉴 定中的应用，为临床利用ＮＧＳ技术发现病原提供了 参考。 １材料与方法
１．１
样本信息
两份咽拭子样本均来自临床重症
肺炎病人。ＲＴ－ＰＣＲ方法鉴定样本Ａ为冠状病毒 ２２９Ｅ（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ・２２９Ｅ）和副流感病毒２型
ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ＳＰＩＡ ａｎｄ ＭＤＡ ｐｒｏｄｕｃｔ ｕｓｉｎｇ ＮＧＳ
Ｃｏｎｔｉｇ数目ＮＯ．Ｃｏｎｔｉｇ
最长Ｃｏｎｔｉｇ（ｂｐ）Ｌｏｎｇｅｓｔ ｃｏｎｔｉｇ 病毒ｒｅａｄｓ数目ＮＯ．Ｒｅａｄｓ ｍａｐｐｅｄ
ｔｏ
４ ８８０ ｖｉｒｕｓ １１６ ２ ７２７ ３１０ １１
１５ ９７７ １０２
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｆａｍｉｌｙ Ｐｌａｎｎｉｎｇ
Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ，Ｂｅ讲ｎｇ
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ：Ｓｈｕ Ｙｕｅｌｏｎｇ．Ｅｍａｉｌ：ｙｓｈｕ＠ｃｎｉｃ．ｏｒｇ．ｃｎ
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】０ｂｊｅｃｔｉｖｅ
ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｔｈｅ
ＮＧＳ ｉｎ
ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｓｗａｂｓ ｆｒｏｍ ｔｗｏ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ
Ｐｒｉｍｅｒ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ
ｐｎｅｕｍｏｎｉａ ｗｅｒｅ
ａｍｐｌｉｆｉｅｄ
ｗｉｔｈ
Ｓｉｎｇｌｅ
Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＳＰＩＡ）ｍｅｔｈｏｄ
ｔｏ
ａｎｄ
Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｎａｌｙｓｉｓ