一株枯草芽孢杆菌分离鉴定

产生芽孢菌霉素L，大侧柏酸，表面活性素三种物质的枯草芽孢杆

菌BBK-1菌株的分离鉴定研究

Niran Roongsawang•Jiraporn Thaniyavarn•Suthep Thaniyavarn•Takayuki Kameyama•Mitsuru Haruki•Tadayuki Imanaka•Masaaki Morikawa•Shigenori Kanaya

摘要

从泰国中部地区采集耐盐咸土，砂，海水和发酵食品等样品，分理得到二十三株耐盐碱且产表面活性素的菌株，通过培养，发现一株产生物表面活性素活性较高的菌株，将其命名为BBK-1 。BBK-1菌株分离自发酵食品中，通过生理生化试验和16SrRNA基因序列分析，将该菌株鉴定为枯草芽孢杆菌。实验发现，该菌株在添加16%的氯化钠培养基上生长良好，在添加8%的氯化钠培养基里能同时产生三种表面活性脂肽，根据它们的分子量和氨基酸成分，将这三种脂肽鉴定为芽孢菌霉素L，大侧柏酸，表面活性素。通过克隆和测序编码4-磷酸酰巯基乙胺基转移酶的生物合成基因，发现该氨基酸序列与枯草芽孢杆菌RB14菌株产生的溶血磷脂酸基因十分相似。枯草芽孢杆菌RB14菌株同时也产生伊枯草菌素A和表面活性素。

关键词

芽孢菌霉素L 芽孢杆菌属生物表面活性素耐盐碱脂肽大侧柏酸莎梵婷

引言

生物表面活性素是由细菌和真菌产生的具有生物表面活性的化合物，与化学表面活性素相比，生物表面活性素更具优势，在工业生产上应用广阔(Fiechter 1992)。生物表面活性素通常为复杂脂类，比如糖脂、脂肽、磷脂和脂肪酸(Cooper and Zajic 1980)。芽孢杆菌属是一种常用的生产脂肽类物质如生物表面活性素(LPBS)和抗生素(LPAB)的工业生防菌（见表一）。LPBS和LPAB都具有两性分子结构即同时含有亲水性和亲脂性部分，且大多具有环状结构β-羟基脂肪酸 (β-羟基型)或β氨基脂肪酸(β-氨基型)。

表面活性素是芽孢杆菌中最常见的 LPBS之一，其生物合成机理在基因水平和生化反应中已深入研究 (Quadri et al. 1998; Peypoux et al. 1999)。 srfA操纵子、comA(以前称为srf B)和sfp是枯草芽孢杆菌产生物表面活性素不可或缺的三个遗传位点。srfA 操纵子由四个开放阅读框组成，分别编码载体蛋白(PCP)，消旋酶结构域和硫酯酶蛋白。这些蛋白形成一个非核糖体肽合成酶复合物(表面活性素合成酶)。srfA操纵子长度为28 KB(Cosmina et al.1993)。comA和sfp各自编码srfA(Roggiani and Dubnau 1993)的转录激活酶和4’-磷酸酰巯基乙胺基转移酶(sfp 磷酸酰巯基乙胺基转移酶/ PPTase，srfA 的多元活化酶酶复合物)，(Nakano et al. 1992;Lambalot et al. 1996)。sfp(PPTase)将表面活性素合成酶中的惰性的脂蛋白七PCP域转换成活泼的脂蛋白。已有报道证实大肠杆菌和酿酒酵母中的sfp经修饰后转录出不同的聚酮化合物6- deoxyerythronolide B和6-甲基水杨酸合成酶((Kealey et al. 1998; Pfeifer et al. 2001)。sfp 具有较多的的酶切位点分别使非核糖体肽合成酶的七PCP域和聚酮合成酶的酰基载体蛋白(ACP)转录修饰成为可能。因此，PPTase 在LPBS、LPAB及聚酮化合物的生产中是一个重要的、有价值的酶。

尽管他们在工业应用以及石油污染的治理中潜力巨大，但目前生物表面活性素只能在温和条件下，从细菌和真菌中获得。有关在极端环境下产生生物表面活性素的报道较少(Yakimov et al. 1995)。为了扩大生物表面活性素在工业上的应用，本课题组在泰国众多

高盐区采集了能够产生大量生物表面活性素的耐盐菌，并分离各种嗜盐菌。本实验分离鉴定了一株耐盐芽孢杆菌BBK-1，发现并证实了BBK-1菌株能产生芽孢菌霉素L，大侧柏酸，和生物表面活性素。为了深入研究耐盐菌产生物表面活性素的机理通过借助分子生物学的方法克隆编码PPTase的sfp同源基因。

材料与方法

从泰国中部采集各种样品，包括耐盐咸土，砂，海水和发酵食品，分离产生物表面活性素的细菌。将这些样品稀释涂布在石油–LBGS琼脂平板上，30℃下过夜培养。油–LBGS 琼脂平板配方为(w/v)：1%细菌蛋白胨、酵母膏0.5%、1%葡萄糖、5%氯化钠、1.5%琼脂，NaOH调节pH值为7.5、覆盖表面的原油为30ml。有油晕的菌落说明生产了生物表面活性剂，(Morikawa et al. 1992)。挑取菌落，接种在LBGS液体培养基中，在30℃下200 rpm搅拌有氧培养24h。分离上清液，用于生物表面活性素的试验。

生物表面活性剂生产量的测定

培养液上清液中的表面张力通过环张力计测量(K6; Kruss, Germany)。

临界胶束浓度(CMC)为表面张力开始增加时的浓度。需要达到CMC稀释的定义是CMC-1被认为和原始样品中的生物表面活性素的量成比例(Sheppard and Mulligan 1987)。取表面张力低于35mN/m，最高的CMC-1值的培养液的细菌菌株进行下一步的实验。

细菌菌株和质

本实验已介绍的枯草芽孢杆菌BBK-1；源于马尔堡病毒168株并且不能产生表面活性素的枯草芽孢杆菌MI113 (arg-15,，trpC2,，hsrM,，hsmM，sfp◦ )(Morikawa et al. 1992)；大肠杆菌DH5α[F. ø80，lacZ∆M15，recA1，endA1，gyrA96，thi–1，hsdR17, r k-，m k+，SupE44，relA1，deoR，∆(lacZYA-argF)U169, λ– ]作为克隆程序的宿主；分别用来转化大肠杆菌DH5α和枯草芽孢杆菌的质粒pUC19，pCR2.1(Invitrogen, San Diego, CA)，和ptb523(Tc r ;Morikawa et al. 1992)。