常见限制性内切酶识别序列

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酶切位点识别序列

上一段碱基的特定序列，DNAcutting site）：Restriction 酶切位点（Enzyme 序列切成两段。

限制性内切酶能够识别出这个序列并在此将DNA可能存在同尾酶，不同酶的识别序列不同，
WW 有的可能能识别多个酶切位点比如STY1识别序列有
PCR引物设计时酶切位点的保护碱基表不同内切酶对识别位点以外最少保护碱
基数目的要求（在本表中没有列出的）酶，则通常需在识别位点两端至少加上
6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。

简DNA的尾端时，限制性内切酶经常不能成功切断(保护碱基：当酶切位点在双链所以经常在引物设计=_=|||)单的想象为酶遇到识别位点之后从旁边掉下去了……
个碱基以确保成功酶切。

比32时，在末端的限制性内切酶识别位点之后
再加上、改3'
成可以的引物是5‘
GCTAGCNNNNN……如你5‘CAGGCTAGCNNNNN……3' 呃……CAG是我随便加的，你可以考虑一下CG/AT含量
注释
1.如果要加在序列的5'端，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的5'端加上相应的碱基（黑色），如果要在序列的3'端加上保护碱基，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的3'端加上相应的碱基（黑色）。

2.切割率：正确识别并切割的效率。

加保护碱基时最好选用切割率高时加的相应碱基。

3.。

限制性核酸内切酶

生理意义
限制作用实际就是限制酶降解外源DNA ，维护宿主遗传稳定的保护机制。甲基化是常见的修饰作用，可使腺嘌呤A和胞嘧啶C甲基化而受到保护。通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。所以，能产生防御病毒侵染的限制酶的细菌，其自身的基因组中可能有该酶识别的序列，只是该识别序列或酶切位点被甲基化了。但并不是说一旦甲基化了，所有限制酶都不能切割。大多数限制酶对 DNA甲基化敏感，因此当限制酶目标序列与甲基化位点重叠时，对酶切的影响有3种可能，即不影响、部分影响、完全阻止。对甲基化 DNA的切割能力是限制酶内在和不可预测的特性，因此，为有效的切割DNA，必须同时考虑DNA甲基化和限制酶对该类型甲基化的敏感性。另外，现在很多商业限制酶专门用于切割甲基化DNA。
E
Escherichia
(属)
co
coli
(种)
R
RY13
(品系)
I
的结构，辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型(Type I)、第二型(Type Ⅱ) 及第三型(Type Ⅲ)。
类型
第一型限制酶同时具有修饰(modification)及识别切割(restriction)的作用;另有识别 (recognize)DNA上特定碱基序列的能力，通常其切割位(cleavage site)距离识别位(recognition site)可达数千个碱基之远。例如:EcoB、EcoK。
第二型限制酶只具有识别切割的作用，修饰作用由其他酶进行。所识别的位置多为短的回文序列(palindrome sequence);所剪切的碱基序列通常即为所识别的序列。是遗传工程上，实用性较高的限制酶种类。例如:EcoRI、HindⅢ。

限制性内切酶

限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（一般4-8bp），并在此处切割DNA双链的核酸内切酶。

主要存在于原核生物，是原核生物自我保护的一种机制。

它的作用包含两类,一种是对外的,限制作用,指一定类型的细菌可以通过限制性核酸内切酶的作用,破坏入侵的外源DNA,使得外源DNA对生物细胞的入侵受到限制。

另一种是对内的，修饰作用，指在特定位置发生甲基化，可免遭自身限制性酶的破坏。

限制性核酸内切酶的发现是在本世纪中期，Arber等人对λ噬菌体在大肠杆菌不同菌株上的平板培养效应的研究为基础，发现了原核生物体内存在着寄主控制的限制和修饰系统。

实验是：在K株或B株大肠杆菌上生长繁殖的噬菌体λ（K）或λ（B），再次感染原寄主菌体的成斑率为1，而感染新的寄主菌株的成斑率则分别为10-4和4*10-4所以说受到了限制。

在 20 世纪 60 年代，噬菌体学家阐明了宿主限制和修饰现象的生化机制。

该研究工作在 Me-selson 和 Yuan（1968）纯化得到了大肠杆菌 K12 的限制性内切酶时达到高峰。

因为这个内切酶可以把未修饰的 DNA 切割成大的分离片段，人们认为它一定识别一个靶序列。

从而提供了对 DNA 进行可控操作的前景。

但不幸的是，K12 内切酶不具备人们希望的性质。

虽然它确实是结合到一定的区域序列上，切割却在几千个碱基对以外“随机”发生的（Yuan 等，1980）。

经过大量努力后，终于在1970 年取得了突破，人们发现了在流感嗜血杆菌（Haemophilusinfluenzae）中存在一种酶，其作用更加简单（Kelly & Smith，1970；Smith & W ilcox，1970），即这个酶可以识别双链 DNA 分子中的一个特定靶序列，并在该序列之内切断多聚核苷酸链，从而产生长度和序列一定的分离片段。

突破性的进展始于 Hamilton Smith 的发现，他从嗜血流感细菌（Haemophilus influenzae）菌株 Rd中找到了一种限制性内切酶（Smith & Wilcox，1970），并阐明了它在噬菌体 T7 DNA 中切割的核苷酸序列（Kelly & Smith，1970）。

限制性核酸内切酶

限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶：是识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。

限制性核酸内切酶的分类：依照限制酶的结构,辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，别离是第一型（Type I）、第二型（Type II）及第三型（Type III）。

第一型限制酶同时具有修饰(modification)及认知切割(restriction)的作用；还有认知(recognize)DNA 上特定碱基序列的能力，通常其切割位(cleavage site)距离认知位(recognition site)可达数千个碱基之远,并非能准确信位切割位点，因此并非经常使用。

例如：EcoB、EcoK。

第二型限制酶只具有认知切割的作用，修饰作用由其他酵素进行。

所认知的位置多为短的回文序列(palindrome sequence)；所剪切的碱基序列通常即为所认知的序列。

是遗传工程上，有效性较高的限制酶种类。

例如：EcoRI、HindIII。

第三型限制酶与第一型限制酶类似，同时具有修饰及认知切割的作用。

可认知短的不对称序列，切割位与认知序列约距24-26个碱基对，并非能准确信位切割位点，因此并非经常使用。

例如：EcoPI、HinfIII。

限制酶在遗传学方面的应用：1、在甚因工程方面利用能产生“粘性结尾”的限制酶, 进行DNA的体外重组, 是较为方便的, 只要用同一限制酶处置不同来源的DNA, 由于所产生的水解片段具有相同的粘性结尾, 能够彼此“粘合”,再经连接酶处置, 就成为重组DNA分子了. 目前, 基因工程上, 限制酶要紧应用于以下两方面（1）目的基因与载体的重组细菌细胞中的限制酶能水解外源DNA , 因此必需通过适当的载体(质粒或噬菌体)的帮忙才能将外源DNA引人受体细胞并在其中增殖和表达。

将供体DNA与载体用一样的限制酶处置, 使载体带上各类各样的外源DNA片断, 然后引人受体细菌细胞增殖, 菌细胞增殖, 再挑选出所需的菌株, 便取得带有某一目的基因的繁衍系.用这种方式, 已成功地将酵母菌的咪哇甘油磷酸脱水酶基因、夕一异丙基苹果酸脱氢酶基因和色氨酸合成酶基因通过几噬菌体转人大肠杆菌,并表达了信息.（2）建造新的基因载体作为基因载体,在引人受体细胞后, 必需有较高的复制率, 以求取得大量的基因产物；必需具有一个选择性标志, 以便挑选；还要有一最多种限制酶的作用位点（每种酶只有一个切口）；也要求利用平安。

限制性内切酶

限制性内切酶
生技2班张维嘉楼辉辉梁竟一冯夏艳孟慧毛荣殷智强
限制性核酸内切酶是可以识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶，简称限制酶。根据限制酶的结构，辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型、第二型及第三型。 Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解； Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解； III型限制性内切酶同时具有修饰及认知切割的作用。
用于DNA基因组物理图谱的组建；基因的定位和基因分离；DNA分子碱基序列分析；比较相关的DNA分子和遗传工程。限制性核酸内切酶是由细菌产生的，其生理意义是提高自身的防御能力. 限制酶一般不切割自身的ype II restriction enzyme ）识别序列： 5'GGGCC^C 3‘ BamHI（类型：Type II restriction enzyme ）识别序列： 5' G^GATCC 3' BglII （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列： 5' A^GATCT 3' EcoRI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列： 5' G^AATTC 3' HindIII （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列： 5' A^AGCTT 3' KpnI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列： 5' GGTAC^C 3' NcoI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列： 5' C^CATGG 3' NdeI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列： 5' CA^TATG 3' NheI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列： 5' G^CTAGC 3' NotI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列： 5' GC^GGCCGC 3' SacI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列： 5' GAGCT^C 3' SalI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列： 5' G^TCGAC 3' SphI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列： 5' GCATG^C 3' XbaI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列： 5' T^CTAGA 3' XhoI （类型：Type II restriction enzyme ）识别序列： 5' C^TCGAG 3'

基因工程中常用的三种工具酶

一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）1．定义：凡能识别和切割双链DNA分子内特定核苷酸序列的酶，也称为限制酶（restriction enzyme，RE）。

2．类型：来自原核生物，有三种类型。

Ⅰ型：兼具甲基化修饰和ATP参与的核酸内切酶活性，随机切割。

Ⅱ型：大多能特异识别4～6个核苷酸序列（回文结构），最大识别序列为8个核苷酸，如SfiI、NotI；但有近10种Ⅱ型限制酶的识别序列为非回文结构，如SfaNI、MnlI等，Ⅱ型限制酶均可作为基因工程的工具酶。

另有一些来源不同的限制酶的识别位点是相同的核苷酸序列，将这类酶特称为同工异源酶（isoschizomers）或同裂酶。

同工异源酶切割产生相同的末端；有一些同工异源酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感性有所差别，故可用来研究DNA 甲基化作用，如SmaI和XmaI；HpaII和MspI；MboI和Sau3AI是成对的同工异源酶；其中HpaII和MspI是一对同工异源酶，其识别位点是CCGG。

与同工异源酶对应的一类限制酶，它们虽然来源各异，识别序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端，称为同尾酶（isocaudamers）。

常用的限制酶BamHI、BclI、BglII、Sau3AI和XhoII就是一组同尾酶，它们切割DNA之后都形成由GATC4个核苷酸组成的粘性末端。

显而易见，由同尾酶所产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的，因此在基因克隆实验中很有用处。

但必须指出，由两种同尾酶消化产生的粘性末端，重组之后所形成的序列结构再不能被原来的任何一种同尾酶所识别。

Ⅲ型：功能基本同Ⅰ型，但为特定位点切割。

三种限制酶的区别如下表所示：Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型DNA底物dsDNA dsDNA dsDNA辅助因子Mg2+,A TP,SAM Mg2+ Mg2+,A TP识别序列特异特异特异切割位点非特定（于识别序列前后100~1000bp范围之内）特定（切割于识别序列之中或近处，固定位点）特定（切割点在识别序列后25~75bp处）与甲基化作用的关系内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用酶蛋白不具有甲基化作用内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用3．命名：第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株。

限制酶识别序列

二轮小专题限制酶识别序列一．回文诗：静思伊久阻归期，久阻归期忆别离；忆别离时闻漏转，时闻漏转静思伊。

赏花归去马如飞，去马如飞酒力微。

酒力微醒时已暮，醒时已暮赏花归。

二．DNA回文序列限制性内切酶Ⅱ类酶有EcoR I、BamH I、Hind Ⅱ、Hind Ⅲ等。

其分子量小于105道尔顿；反应只需Mg2+；最重要的是在所识别的特定碱基顺序上有特异性的切点，因而DNA分子经过Ⅱ类酶作用后，可产生特异性的酶解片断，这些片断可用凝胶电泳法进行分离、鉴别。

限制性内切酶识别DNA序列中的回文序列。

有些酶的切割位点在回文的一侧（如EcoR I、BamH I、Hind等），因而可形成粘性末端，另一些Ⅱ类酶如Alu I、BsuR I、Bal I、Hal Ⅲ、HPa I、Sma I等，切割位点在回文序列中间，形成平整末端。

Alu I的切割位点如下：5'-A G^C T-3'3'-T C^G A-5'酶类型识别序列ApaI Type II restriction enzyme 5'GGGCC^C 3' BamHI Type II restriction enzyme 5' G^GATCC 3' BglII Type II restriction enzyme 5' A^GATCT 3' EcoRI Type II restriction enzyme 5' G^AATTC 3' HindIII Type II restriction enzyme 5' A^AGCTT 3' KpnI Type II restriction enzyme 5' GGTAC^C 3' NcoI Type II restriction enzyme 5' C^CATGG 3' NdeI Type II restriction enzyme 5' CA^TATG 3' NheI Type II restriction enzyme 5' G^CTAGC 3' NotI Type II restriction enzyme 5' GC^GGCCGC 3' SacI Type II restriction enzyme 5' GAGCT^C 3' SalI Type II restriction enzyme 5' G^TCGAC 3' SphI Type II restriction enzyme 5' GCATG^C 3' XbaI Type II restriction enzyme 5' T^CTAGA 3' XhoI Type II restriction enzyme 5' C^TCGAG 3'。

限制酶bamhi识别序列

限制酶bamhi识别序列全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：BamHI酶是最常用的限制酶之一，在分子生物学领域被广泛应用于DNA分子的切割和连接。

BamHI酶的识别序列为5'-GGATCC-3'，具有非常高的识别特异性和切割效率。

在实验室中，研究人员常常需要使用BamHI酶来对DNA分子进行特定的切割，以便进行进一步的实验操作。

BamHI酶的识别序列非常短，只有6个碱基对，但却能够在DNA 分子中非常准确地识别并切割特定的DNA序列。

这种高度特异性的作用是由于BamHI酶的结构和活性机制所决定的。

BamHI酶是一种双链DNA切割酶，它可以同时切割DNA分子的两条链，形成具有“突出末端”的DNA断裂。

这种特殊的切割方式使得BamHI酶可以在切割后方便地用于DNA连接实验。

BamHI酶的识别序列为5'-GGATCC-3'，其中GGATCC是酶的具体识别部位。

在DNA序列中，只有当该识别序列被BamHI酶完全识别时，酶才能够进行切割作用。

由于BamHI酶对识别序列的要求非常严格，即使是一个碱基对的差错也会导致酶无法进行切割。

在实验操作中，研究人员需要非常小心地设计和检查DNA序列，确保BamHI 酶能够准确识别和切割目标序列。

除了识别序列的准确性外，BamHI酶的切割效率也是研究人员需要考虑的重要因素之一。

在实验操作中，一般情况下会根据需要调节BamHI酶的酶活性和反应条件，以确保DNA分子能够被完全切割。

由于BamHI酶的酶活性受到许多因素的影响，如酶的来源、纯度和保存状态等，研究人员在实验操作中需要仔细控制这些因素，以确保实验结果的准确性和可靠性。

第二篇示例：限制酶（Restriction Enzyme）是一种能够识别和切割DNA特定序列的酶类，广泛应用于分子生物学和基因工程领域。

BamHI是一种常用的限制酶，它具有识别并切割GGATCC序列的能力。

本文将主要讨论BamHI限制酶的特点及其在科研实验中的应用。

限制性内切酶

5’-G BamH I 3’-CCTAG
GATCT-3’ A-5’
Bgl Ⅱ
BamH I 5’-GGATCC-3’ 3’-CCTAGG-5’
5’-GGATCT-3’ 3’-CCTAGA-5’ Sau 3A
Bgl Ⅱ
5’-AGATCT-3’ 3’-TCTAGA-5’
III类限制性内切酶
能完全肯定的识别位点和切割位点，但切割位点也是在识别位点的一侧的一定距离，通常距特异性位点24bp-26bp。

I 型：切割位点不确定，不适用于基因工程。 Ⅱ型：基因工程的工具酶。 Ⅲ型：切割位点不在识别位点，对分子克隆操作亦无实用意义。
I型限制性内切酶
首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年从大肠杆菌B株和K株分离得到。作用原理：识别双链DNA未甲基化修饰的特异序列，与该序列相互作用，然后延DNA分子移动，在距离特异性识别位点约1000-1500bp处随机切开一条单链，造成大约75个核苷酸的切口。
4.DNA的分子结构
DNA分子的不同构型对限制性内切酶的活性也有很大的影响。某些限制性核酸内切酶切割超螺旋的质粒DNA所需要的酶量要比消化线性的DNA量高出很多倍。
5. 缓冲液
是影响限制酶活性的重要因素。商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。
化学组成 MgCl2、NaCl/KCl：提供Mg2+和离子强度 Tris-HCl：维持pH 二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定
• 识别序列
通常识别的是4-8bp的回文序列，多为6bp，在识别序列内或其附近水解DNA链中的磷酸二酯键。
• 酶切切口
齐平末端：在识别序列内的对称轴上切割，其切割产物具平头末端（不易重新连接）。

限制性内切酶分类指南

30多年前，当人们在对噬菌体的宿主特异性的限制-修饰现象进行研究时，首次发现了限制性内切酶。

细菌可以抵御新病毒的入侵，而这种"限制"病毒生存的办法则可归功于细胞内部可摧毁外源DNA的限制性内切酶。

首批被发现的限制性内切酶包括来源于大肠杆菌的EcoR I 和EcoR II，以及来源于Heamophilus influenzae的Hind II和Hind III。

这些酶可在特定位点切开DNA，产生可体外连接的基因片段。

研究者很快发现内切酶是研究限制性内切酶的主要功能是保护细菌不受噬菌体的感染，这一观点已被人们广泛接受。

它们作为微生物免疫机制的一部分行使其功能。

当一个没有限制性内切酶的细菌被病毒感染时，大部分病毒颗粒都能成功地进行感染。

然而一个有限制性内切酶的同种细菌被成功感染的比率显著下降。

出现更多的限制性内切酶将会起到多重保护作用;而一个拥有4到5种各自独立的限制性内切酶将会使细胞坚不可摧。

限制性内切酶常常伴随一到两种修饰酶(甲基化酶)出现。

后者的作用是保护细胞自身的DNA 不被限制性内切酶破坏。

修饰酶识别的位点与相应的限制性内切酶相同，但只甲基化每条链中的一个碱基，而不是切开DNA链。

限制性内切酶识别位点处的甲基基团伸入到双螺旋的大沟中去，阻碍了限制性内切酶的作用。

这样，限制性内切酶和它的"搭档"--甲基化酶一起就构成了限制-修饰(R-M)系统。

在一些R-M系统中，限制性内切酶和修饰酶是两种不同的蛋白，它们各自独立行使自己的功能;而在另一些系统中，两种功能由同一种限制-修饰酶的不同亚基，或是同一亚基的不同结构域来执行。

传统上将限制性内切酶按照亚基组成、酶切位置、识别位点、辅助因子等因素划分为三大类。

然而，蛋白测序的结果表明，限制性内切酶的变化多种多样，若从分子水平上分类，则应当远远不止这三种。

I型限制性内切酶是一类兼有限制性内切酶和修饰酶活性的多个亚基的蛋白复合体。

限制性内切酶小知识

限制性核酸内切酶
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简介
限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease):识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。 [别名] Endodeoxyribonuclease [酶反应] 限制性内切酶能分裂DNA分子在一限定数目的专一部位上。它能识别外源DNA 并将其降解。 [单位定义] 在指明pH与37℃，在0.05mL反应混合物中， 1小时消化1μg的λDNA的酶量为1单位。
特征和种类
1．限制与修饰现象早在 50 年代初，有许多学者发现了限制与修饰现象，当时称作寄主控制的专一性（host controlled specificity）。 l 噬菌体表现的现象便具有代表性和普遍性，其在不同宿主中的转染频率可说明这一问题（表 2-1）。 l 在感染某一宿主后，再去感染其它宿主时会受到限制。 E.coli 菌株 λ噬菌体感染率 lK lB lC E.coli K 1 10-4 10-4 E.coli B 10-4 1 10-4 E.coli C 1 1 1 说明 K 和 B 菌株中存在一种限制系统，可排除外来的 DNA 。 104 的存活率是由宿主修饰系统作用的结果，此时限制系统还未起作用。而在 C 菌株不能限制来自 K 和 B 菌株的 DNA 。限制作用实际就是限制酶降解外源 DNA ，维护宿主遗传稳定的保护机制。甲基化是常见的修饰作用，可使腺嘌呤 A 成为 N6 甲基-腺膘呤，胞嘧啶 C 成为 5' 甲基胞嘧啶。通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。
3．限制酶切割的位置限制酶对 DNA 的切割位置大多数在内部，但也有在外部的。在外部的，又有两端、两侧和单侧之别。切点在两端的有 Sau3AⅠ（↓GATC）、 NlaⅢ（CATG↓）和 EcoRⅡ（↓CCWGG）等；在两侧的有 BcgⅠ[（10/12）CGA（N）6TGC（12/10）]和 TspRⅠ （CASTGNN↓）， BcgⅠ 酶的切割特性与其它酶不同，它们在识别位点的两端各切开一个断点，而不是只产生一个断点。切点在识别位点外侧的还有 BbvⅠ[GCAGC（8/12）] 和 BspMⅠ[ACCTGC（4/8）] 等。 BcgⅠ ↓10（N）CGA（N）6TGC（N）12↓； ↑12（N）CGA（N）6ACG（N）10↑ TspRⅠ NNCAC（G）TGNN↓ ↑NNGTG（C）ACNN

常用限制性内切酶的识别序列和同裂酶

酶同裂酶识别序列酶同裂酶识别序列酶同裂酶识别序列ACC I-GT (A/C)(G/T)AC BsuR I Hae III GG CC Msp I4Hpa II C CGGACC III BspE II T CCGGA Cfo I Hha I GCG C Hap IIBspm II HinP1 I G CGC Mst II Bsu36 I CC TNAGGMro I Cfr9 I Xma I C CCGGG Nar I-GG CGCCAha II Acy I G(A/G) CG(T/C)C Sma I CCC GGG Ehe I GGC GCC Hsp92 I Cfr13 I Asu I G GNCC Kas I G GCGCCAha III Dra I TTT AAA Sau96 I Bbe I GGCGC CAlu I-AG CT Cfr42 I Sac II CCGC GG Nco I Bsp19 I C CATGGAlw26 I2BsmA I GTCTC(1/5)Cla I Ban III AT CGAT Nde I-CA TATGAlw44 I ApaL I G TGCAC Bsp106 I Nde II Mbo I GATC SnoI BspD I Sau3A IApa I-GGGCC C Bsu15 I Nhe I-G CTAGCAsp I Tth111 I GACN NNGTC Csp I Rsr II CG G(A/T)CCG Sph IAsp718 I Acc65 I G GTACC Cvn I Bsu36 I CC TNAGG Not I-GC GGCCGC Kpn I GGTAC C Dde I- C TNAG Nst I Ava III ATGCA TAsn I Vsp I AT TAAT Dpn I3-GmeA TC EcoT22 IAsu I Sau96 I G GNCC Dra I Aha III TTT AAA Mph1103 I Cfr13 I Ecl136 II EcolCR I GAG CTC Nsp III Ava I C (T/C)CG(A/G)G Asu II Csp45 I TT CGAA Sal I GAGCT C PaeR7 I Xba I T CTAGAAva I Eco88 I C(T/C)CG(A/G)G Eco24 I Ban II G(AG)GC(TC) C Pal I Hae III GG CC Nsp III Eco32 I EcoR V GAT ATC Pst I-CTGCA GAva II Sin I G G(A/T)CC Eco64 I Ban I G G(TC)(AG)CC Pvu I Xor II CGAT CG Eco47 I Eco88 I Ava I C (TC)CG(AG)G Pvu II-CAG CTG Axy I Bsu36 I CC TNAGG Eco91 I BstE II G GTNACC Rsa I-GT ACBal I Msc I TGG CCA Eco147 I Stu I AGG CCT Rsr II Csp I CG G(A/T)CCG MluN I Eco255 I Sca I AGT ACT Sac I Sst I GAGCT C BamH I-G GATCC EcolCR I Ecl136 II GAG CTC Ecl136 II GAG CTC Ban I BshN I G G(T/C)(A/G)CC Sac I EcolCR I GAG CTC Eco64 I Sst I GAGCT C Sac II Sst II CCGC GGHgaC I EcoR I-G AATTC Ksp IBan III Cla I AT CGAT EcoR II BstO I CC (A/T)GG Cfr42 IBbe I-GGCGC C EcoR V Eco32 I GAT ATC Sal I-G TCGAC Nar I GG CGCC EcoT14 I Sty I C C(A/T)(A/T)GG Sau I Bsu36 I C CTNAGG Bbu I Pae I GCATA C EcoT22 I Nsi I ATGCA T Sau3A I Mbo I GATC Sph I Eco47 I Ava II G G(A/T)CC Nde II Bcl I-T GATCA Sin I Sau96 I Asu I G GNCC Bcn I Nci I CC (C/G)GG Eco81 I Bsu36 I CC TNAGG Cfr13 IBst98 I C TTAAGG Fok I-GGATG(9/13)Sca I Eco255 I AGT ACTBgl I-GCCNNNN NGGC Hae II Bsp143 II(A/G)GCGC (T/C)Sfi I-GGCCNNNNN NGGCC BseN I BsrS I ACTGGN Hae III BsuR I GG CC Sin I Ava II G G(A/T)CC Bsr I Pal I Eco47 IBgl II- A GATCT Hap II Hpa II C CGG Sma I-CCC GGG BshN I Ban I G G(T/C)(A/G)CC Msp I Xma I C CCGGGBsp19 I Nco I C CATGG HgaC I Ban I G G(T/C)(A/G)CC Cfr9 IBsp68 I Nru I TCG CGA Hha I Cfo I GCG C Spe I- A CTAGTBsp106 I Cla I AT CGAT HinP1 I G CGC Sph I Bbu I GCATG CBsp143 I Mbo I GATC Hinc II Hind II GT(T/C) (A/G)AC Pae IBsp143 II Hae II(A/G)GCGC (T/C)Hind III- A AGCTT Ssp I-AAT ATT BspD I Cla I AT CGAT Hinf I-G ANTC Sst I Sac I GAGCT C BspE I Acc III T CGGA HinP1 I-G CGC EcolCR I GAG CTC BspM II Acc III T CCGGA Hha I Cfo I GCG C Sst II Sca II CCGC GGBst71 I2Bbv I GCAGC(8/12)Hpa I-GTT AAC Sty I EcoT14 I C C(A/T)(A/T)GG Bst98 I Afl II C TTAAG Hpa II Msp I C CGG Taq I TthHB8 I T CGA Bfr I Hap II Tru9 I Mse I T TAABstB I Csp45 I TT CGAA Kpn I-G GTACC Tru II Tth111 I GACN NNGTC BstE II BstP I G GTNACC Asp718 I GGTAC C Tth111 I Asp I GACN NNNGTC Eco91 I Acc65 I Tru IIBstN I BstO I CC (A/T)GG Ksp I Sac II CCGC GG TtHB8 I Taq I T CGABst0 I Apy I CC (A/T)GG Xba I-T CTAGABstN I Mbo I Sau3A I GATC Xho I PaeR7 I C TCGAGEcoR II Nde II Xho II BstY I(A/G) GATC(T/C) Mva I Bsp143 I Mfl IBstX I-CCANNNNN NTGG Mbo II-GAAGA(8/7)Xma I Cfr I C CCGGG BstY I Xho II(A/G) GATC(T/C)Mfl I Xho II(A/G) GATC(T/C)Sma I CCC GGGBsu15 I Cla I AT GAT Mlu I- A CGCGT Xma III Eco52 I C GGCCGBsu36 I Axy I CC TNAGG MluN I Bal I TGG CCA BstZ ISau I Mro I Acc III T CCGGA Eag IMstII Msc I Bal I TGG CCA EclX ICvn IAoc IEco81 I。

限制性内切酶

限制性内切酶1，发现限制性内切酶能保护细菌不受噬菌体的感染，行使微生物免疫功能，缺乏限制性内切酶的大肠杆菌极易被噬菌体感染，但是如果拥有限制性内切酶，被感染的几率就会降低。

限制性内切酶在原核生物中普遍存在，所有自由生存的细菌和古细菌几乎都能编码限制性内切酶。

2，限制-修饰（R-M）系统大多数限制性内切酶常常伴随有一两种修饰酶（DNA甲基化酶），从而保护细胞自身的DNA不被限制性内切酶破坏。

修饰酶识别的位点与相应的限制性内切酶相同，但它们的作用是甲基化每条链中的一个碱基，而不是切开DNA链。

甲基化所形成的甲基基团能够伸入到限制性内切酶识别位点的双螺旋的大沟中，阻碍限制性内切酶发挥作用，即组成R-M系统。

在R-M系统中，有些限制性内切酶和修饰酶是两种不同的蛋白，独立行使自己的功能，有些本身就是一种大的限制-修饰复合酶，由不同的亚基或同一亚基的不同结构域分别执行自己的功能。

3，分类最常用的II型限制性内切酶，能够在识别序列内部或附近特异性的切开DNA链，产生特性的片段和凝胶电泳条带，是唯一一类能用于DNA分析和克隆的限制性内切酶。

限制性内切酶切割后产生一个3-羟基和5-磷酸基，只有当镁离子存在时才具有活性，而相应的修饰酶则需要S-腺苷甲硫氨酸的存在。

备注：NEBuffer: Tris-HCl , MgCl, DTT（二硫苏糖醇，强还原剂）星号活性：在非理想条件下，内切酶切割与识别位点相似但不完全相同的序列，称为星号活性。

使用高保真内切酶，即经过基因工程改造降低了星号活性。

同裂酶：识别序列相同的限制性内切酶即为同裂酶，第一个被发现的内切酶称为原酶，后来发现的识别序列相同的内切酶称为原酶的内裂酶。

4，甲基化（1）原核生物甲基化在原核生物中，DNA甲基化酶作为限制修饰系统的一个组成部分广泛存在，作用是保护宿主菌不被相应的限制性内切酶切割。

Dam甲基化酶：G m ATCDcm甲基化酶：C m CAGG和C m CTGG例如，从dam+ E.coli 中分离的质粒DNA则不能被识别序列为GA TC的限制性内切酶所切割，但是被Dam甲基化阻断的限制性位点可以通过克隆方法去甲基化，及将DNA转入至dam-的菌种中进行增殖。

限制性内切酶的说明

限制酶使用说明一、分类目前，已被发现的限制酶，根据其反应的必须因子和切断点等特性，被分为以下三大类：类别反应必须因子切点酶例 I 型 s-腺苷基蛋氨酸、ATP、Mg2+识别部位和切点不同，切断部位不定Eco B、Eco KII 型 Mg2+切断识别部位或其附近的特定部位Eco R I、Bam H I III 型 ATP、Mg2+识别部位和切点不同，但切断特定部位Eco P I、Hin f III 应用于基因工程研究用的限制酶，一般全是II型酶，现在市场上销售的酶都属于II型酶, 这些限制酶由于其反应条件和底物DNA种类的不同，其切断状况及出现Star活性的频率等各有不同，并且其程度也根据酶的不同而千差万别。

因而在使用限制酶时，必须对这些要素充分注意，确保目标序列的切断反应能顺利进行，下面具体介绍一下使用限制酶时的一些注意点。

二、注意事项1. 甲基化的影响从带有DNA甲基化酶基因的宿主菌中制备的DNA，其碱基的一部分已经被甲基化，因此即便使用能够识别、切断被甲基化部分的序列的限制酶，也几乎无法切断被甲基化的部分。

被甲基化的部位，根据底物DNA及宿主种类的不同而不同。

例如宿主菌为大肠杆菌的情况下，根据宿主的种类有以下两种情况：在进行转化时，通常使用的菌株为C600、HB101、JM109等，因为都带有dam、dcm甲基化酶，所以使用这些菌株制备的DNA时，必须注意。

另外，动物由来的DNA，CG序列多为5m CG；植物由来的DNA，CG及CNG序列多为5m CG和5m CNG。

2. Star活性限制酶在一些特定条件下使用时，对于底物DNA的特异性可能降低。

即可以把与原来识别的特定的DNA序列不同的碱基序列切断，这个现象叫Star活性。

Star活性出现的频率，根据酶、底物DNA、反应条件的不同而不同，可以说几乎所有的限制酶都具有Star活性。

并且，它们除了识别序列的范围增大之外，还发现了在DNA的一条链上加入切口的单链切口活性，所以为了极力抑制Star活性，一般情况下，即使会降低反应性能，我们也提倡在低甘油浓度、中性pH、高盐浓度条件下进行反应。

常见限制性内切酶识别序列

常见限制性内切酶识别序列(酶切位点)（BamHI、EcoRI、HindIII、NdeI、XhoI等）Time：2009-10-22 PM 15:38Author:bioer Hits: 7681 times在分子克隆实验中，限制性内切酶是必不可少的工具酶。

无论是构建克隆载体还是表达载体，要根据载体选择合适的内切酶（当然，使用T 载就不必考虑了）。

先将引物设计好，然后添加酶切识别序列到引物5' 端。

常用的内切酶比如BamHI、EcoRI、HindIII、NdeI、XhoI等可能你都已经记住了它们的识别序列，不过为了保险起见，还是得查证一下。

下面是一些常用的II型内切酶的识别序列，仅供参考。

先介绍一下什么是II型内切酶吧。

The Type II restriction systems typically contain individual restriction enzymes and modification enzymes encoded by separate genes. The Type II restriction enzymes typically recognize specific DNA sequences and cleave at constant positions at or close to that sequence to produce 5-phosphates and 3-hydroxyls. Usually they require Mg 2+ ions as a cofactor, although some have more exotic requirements. The methyltransferases usually recognize the same sequence although some are more promiscuous. Three types of DNA methyltransferases have been found as part of Type II R-M systems forming either C5-methylcytosine, N4-methylcytosine or N6-methyladenine.酶类型识别序列ApaIType II restrictionenzyme5'GGGCC^C 3'BamHIType II restrictionenzyme5' G^GATCC 3'BglIIType II restrictionenzyme5' A^GATCT 3'EcoRIType II restrictionenzyme5' G^AATTC 3'HindIIIType II restrictionenzyme5' A^AGCTT 3'KpnIType II restrictionenzyme5' GGTAC^C 3'NcoIType II restrictionenzyme5' C^CATGG 3'NdeIType II restrictionenzyme5' CA^TATG 3'NheIType II restrictionenzyme5' G^CTAGC 3'NotIType II restrictionenzyme5' GC^GGCCGC 3'SacIType II restrictionenzyme5' GAGCT^C 3'SalIType II restrictionenzyme5' G^TCGAC 3'SphIType II restrictionenzyme5' GCATG^C 3'XbaIType II restrictionenzyme5' T^CTAGA 3'XhoIType II restrictionenzyme5' C^TCGAG 3'要查找更多内切酶的识别序列，你还可以选择下面几种方法：1. 查你所使用的内切酶的公司的目录或者网站；2. 用软件如：Primer Premier5.0或Bioedit等，这些软件均提供了内切酶识别序列的信息；3. 推荐到NEB的REBASE数据库去查（网址：/rebase/rebase.html）当你设计好引物，添加上了内切酶识别序列，下一步或许是添加保护碱基了，可以参考：NEB公司网站提供的关于设计PCR引物保护碱基参考表下载（也可见图片）双酶切buffer的选择（MBI、罗氏、NEB、Promega、Takara）再给大家推荐一种新的不需要连接反应的分子克隆方法，优点包括：①设计引物不必考虑选择什么酶切位点；②不必考虑保护碱基的问题；③不必每次都选择合适的酶来酶切质粒制备载体；④而且不需要DNA连接酶；⑤假阳性几率低（因为没有连接反应这一步，载体自连的问题没有了）。

常用限制性内切酶酶切位点保护残基

酶切位点保护碱基-PCR引物设计用于限制性内切酶发布: 2010-05-24 20:19| 来源:生物吧| 编辑:刘浩| 查看: 161 次本文给出了分子克隆中常用限制性内切酶的保护碱基序列，如AccI，AflIII，AscI，AvaI，BamHI，BglII，BssHII，BstEII，BstXI，ClaI，EcoRI，HaeIII，HindIII，KpnI，MluI，NcoI，NdeI，NheI，NotI，NsiI，PacI，PmeI，PstI，PvuI，SacI，SacII，SalI，ScaI，SmaI，SpeI，SphI，StuI，XbaI，XhoI，XmaI，为什么要添加保护碱基？在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。

由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。

其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边的酶切位点切割。

该如何添加保护碱基？添加保护碱基时，最关心的应该是保护碱基的数目，而不是种类。

什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。

添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的Tm值和各引物的碱基分布及GC含量。

如果某条引物Tm值偏小，GC%较低，添加时多加G或C，反之亦反。

为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，NEB采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。

实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA末端时也很有用。

在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。

实验方法：用γ-[32P]ATP在T4多聚核苷酸激酶的作用下标记0.1A260单位的寡核苷酸。