最新第十一课：流式细胞术测定植物基因组大小概论课件PPT
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信号检测与分析
当细胞携带荧光素标记物，通过激光照射 时，产生代表细胞内不同物质、不同波长 的荧光信号，这些信号以细胞为中心，向 空间360度立体角发射，产生散射光和荧光 信号。 以激发图
散射光信号
散射光信号不依赖任何样品的制备技术 （如染色），因此称为细胞的物理参数。
①T淋巴细胞及亚群： 外周血中成熟淋巴细胞主要属于
TCRαβ＋T细胞，可分为Th、Ts、Treg， TCRγδT细胞和NK1.1＋T细胞等，他们 都有一个共同的标志CD3。
a、辅助/诱导性T淋巴细胞（Th）占27-51%， 是主要的功能亚群，主要表达CD3＋CD4＋CD8 －。
b、抑制/细胞毒性T淋巴细胞（Ts）占15-44%， 是 主 要 的 效 应 性 T 细 胞 亚 群 ， 主 要 表 达 CD3＋ CD4 －CD8＋。
因此通过流式细胞仪计数和多参数分析淋巴细胞亚群对了解 淋巴细胞发育、分化、活化和功能成熟，鉴别新的淋巴细胞 亚群具有重要价值；更重要的是通过研究和分析疾病与特异 性淋巴细胞亚群或某些疾病，如免疫性疾病、感染性疾病、 肿瘤等的诊断、治疗、免疫功能重建和器官移植检测有着重 要临床意义。
（1）淋巴细胞及其亚群分析
（三）质料采集和分析过程中 的质量控制
1、标本采集处理
a、组织标本采集： b、标本固定：70%的乙醇固定效果好。 C、单细胞悬液的制备：细胞浓度调整为1×106/ml。 d、石蜡包埋组织的单细胞制备：一般不用。
2、资料采集：一般每个标本应获取1×104。 2×104个有核细胞的荧光和散光系数，白血病 微小残余病变检测应收集5×104个细胞。 3、资料分析；略
缺点；细胞散射光特征丢失较肝素标本快。
（一） FCM单细胞标本的制备
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流式细胞仪发展的历史
• 起源: 1934年--- 细胞计数仪
• 雏形: 1949年--- Coulter 计数器
•
1959年--- B型Coulter计数器
•
1972年: BD(Becton-Dickinson)
• ④既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。
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• 概要说来，流式细胞术主要包括了样品的液流
技术、细胞的分选和计数技术，以及数据的采 集和分析技术等。FCM目前发展的水平凝聚了 半个世纪以来人们在这方面的心血和成果。
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高流速适用于定性测量，如免疫表型。样本 流变宽，细胞间距离缩短，这样在单位时间内流 经激光照射区的细胞数量增加，可以快速获取数 据。
低流速促使样本流变窄，单个细胞得以依次 通过，这样大多数细胞可流经激光束的中心，细 胞受激光照射的能量比较均一，因而低流速适用 于检测分辨率要求高的实验，如DNA分析。
选出来，并且可将单个或指定个数的细胞分选到特定的 培养孔或板上，同时可选配多种波长和类型的激光器， 适用于更广泛更灵活的科学研究应用。
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●流式细胞仪实物
BD-Calibur
BD FACSVantage
第十一课流式细胞术测定植物基因组大小
DNA的倍体和DNA指数的关系
DI=1.0±0.01 DI=1.0±0.15 DI=2.0±0.1
DI>2.10
二倍体 近二倍体 四倍体 多倍体
例：
D N A 倍 体
正 二 倍 体 (2n,D iploid) 亚 二 倍 体 (H aploid) 四 倍 体 (T eraploid) 低 倍 体 (H ypoploid) 高 倍 体 (H yperploid)
➢主要表达方式
Pseudo 3D Plot
3D Plot
二 植物C值分析原理
利用特殊的荧光染料(PI、EB、AO等)与细胞内DNA碱 基结合，被荧光染料染色的细胞在激光照射下发射出荧光， 荧光强度与DNA含量成正比。流式细胞仪通过测定细胞的 荧光强度推算出细胞的DNA含量。
流式细胞仪计算测量DNA含量实际上是细胞周期的测 量，由于细胞核G1期的DNA含量反应一个细胞的倍性，因 此常用DNA含量来估计细胞倍性，包括DNA的绝对含量或相 对含量。
临床型(BD,FACSCalibur台式机)
特点：
➢光路调节系统固定
➢自动化程度高
➢操作简便
➢使用寿命长
➢配备1-2根激光
➢细胞分选速度慢， 主要用于细胞分析
大型机(BD,FACSAria科研型)
特点： ➢分辨率高
➢选配多种波长和 类型激光器
➢可把感兴趣细胞 分选到特定培养孔 或板上（4路和24 孔板）
流式细胞仪(Flow Cytometer)
集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细 胞荧光化学技术、流体力学为一体的一种新型高科技仪器。
流式细胞术特点
单细胞悬液 或生物颗粒 分析速度高
多参数
流式细胞术原理及应用新课件PPT全
流式细胞术是20世纪70年代发展起来的一种技术，有人将流式细胞仪比喻成高级的荧光显微镜。 HLA-B27: 强直性脊柱炎 细胞功能检测：细胞周期、凋亡
Flow Sorting 直方图适用于：单参数分析
SORTING（细胞分选） CD16+56 NK细胞 可利用FCM进行细胞周期分析，适当选择周期特异性药物或非周期特异性药物。
巨血小板
• 细胞凋亡与坏死的区别 一般只测一个参数、不能分选
5、DNA含量分析法（晚晚期）
2F时LO必W需C停Y用TO免M疫E抑TR制Y剂。虽然凋亡与坏死的最终结果极为相似，但
凋亡检测
每一步都有检测它试剂盒们的过程与表现却有很大差别。
光路调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易学易掌握,适合
坏死（necrosis）：坏死是细胞受到强烈理 流式细胞分析在人类基因组计划中发挥了重要作用，流式细胞技术的应用也适用于植物，目前这个技术应用范围包括流式核型分析，
目前，该技术以广泛用于生物及医 学基础研究与临床检测，在分子生物学、 免疫学、遗传学、血液学、肿瘤学等领 域内发挥着重要作用。
流式细胞仪
荧光显微镜
Flow Cytometry
控制 一般只测一个参数、不能分选
电脑
人脑
其细胞及组织的变化与坏死有明显的不同。
可利用FCM进行细胞周期分析，适当选择周期特异性药物或非周期特异性药物。
• 空白对照：ALL 应用领域将不断开拓，成为科研与临床不可或缺的重要工具。
随着白细胞分化抗原意义的确认以及单克隆抗体技术的发展，随着人们创新意识的加强，结合计算机技术和其他技术，流式细胞仪的 应用领域将不断开拓，成为科研与临床不可或缺的重要工具。 坏死（necrosis）：坏死是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程。
流式细胞术 ppt课件
制备(如染色)无关。
✓前向角散射(FS)反映被测细胞的大小，它由 正对着流动室的光电二极管装置，接收并 转变为电信号。
✓侧向角散射(SS)反映被测细胞的细胞膜、细 胞质、核膜的折射率和细胞内颗粒的性状， 它由一个光电倍增管(PMT) 接收并转变为 电信号，这些电信号存储在流式细胞仪的 计算机硬盘或软盘内。
➢荧光信号也有两种：
✓一种是细胞自发荧光，它一般很微弱。
✓一种是细胞样本经标有特异荧光素的单克 隆抗体染色后，经激光激发发出的荧光， 它是我们要测定的荧光，荧光信号较强。
✓这两种荧光信号的同时存在是我们测定时 需要设定阴性对照的理由，以便从测出的 荧光信号中减去细胞自发荧光和抗体非特 异结合产生的荧光。
(1)单参数数据显示和分析
➢ 细胞的每一个单参数测 量数据用直方图来显示
➢ 横坐标表示散射光或荧 光信号相对强度值，其 单位是道数，可以是线 性的，也可以是对数的
➢ 纵坐标表示细胞数。
(2)双参数数据显示和分析：
➢细胞的双参数测量数据和细胞数量的关系 用一维直方图、二维点阵图、假三维地形 图、等高线图和密度图显示和分析。
✓流动室孔径有60μm、100μm、150μm 、 250μm等多种，供检测者选择。小型仪器一 般固定装置了一定孔径的流动室。
➢流动室里的鞘液流一般是稳定流动，控制鞘 液流的装置是在流体力学理论的指导下由一 系列压力系统、压力感受器组成。
➢调整好鞘液压力和标本管压力, 鞘液流包绕 样品流并使样品流保持在液流的轴线方向， 能够保证每个细胞通过激光照射区的时间相 等，从而使激光激发的荧光信息准确无误。Fra bibliotek等高线图
分别是测定细胞的两种荧光双参数数据，横坐标 和纵坐标分别代表一种荧光参数，同理只要设定 “十字门”就可得到两种荧光的各种测定值，密 度图和等高线图较点阵图更直观。
✓前向角散射(FS)反映被测细胞的大小，它由 正对着流动室的光电二极管装置，接收并 转变为电信号。
✓侧向角散射(SS)反映被测细胞的细胞膜、细 胞质、核膜的折射率和细胞内颗粒的性状， 它由一个光电倍增管(PMT) 接收并转变为 电信号，这些电信号存储在流式细胞仪的 计算机硬盘或软盘内。
➢荧光信号也有两种：
✓一种是细胞自发荧光，它一般很微弱。
✓一种是细胞样本经标有特异荧光素的单克 隆抗体染色后，经激光激发发出的荧光， 它是我们要测定的荧光，荧光信号较强。
✓这两种荧光信号的同时存在是我们测定时 需要设定阴性对照的理由，以便从测出的 荧光信号中减去细胞自发荧光和抗体非特 异结合产生的荧光。
(1)单参数数据显示和分析
➢ 细胞的每一个单参数测 量数据用直方图来显示
➢ 横坐标表示散射光或荧 光信号相对强度值，其 单位是道数，可以是线 性的，也可以是对数的
➢ 纵坐标表示细胞数。
(2)双参数数据显示和分析：
➢细胞的双参数测量数据和细胞数量的关系 用一维直方图、二维点阵图、假三维地形 图、等高线图和密度图显示和分析。
✓流动室孔径有60μm、100μm、150μm 、 250μm等多种，供检测者选择。小型仪器一 般固定装置了一定孔径的流动室。
➢流动室里的鞘液流一般是稳定流动，控制鞘 液流的装置是在流体力学理论的指导下由一 系列压力系统、压力感受器组成。
➢调整好鞘液压力和标本管压力, 鞘液流包绕 样品流并使样品流保持在液流的轴线方向， 能够保证每个细胞通过激光照射区的时间相 等，从而使激光激发的荧光信息准确无误。Fra bibliotek等高线图
分别是测定细胞的两种荧光双参数数据，横坐标 和纵坐标分别代表一种荧光参数，同理只要设定 “十字门”就可得到两种荧光的各种测定值，密 度图和等高线图较点阵图更直观。
流式细胞术PPT课件
电荷式分选
lasers
–超声振动器(15-100kHz)
–液流充电系统
–高压偏转板
–收集装置(流式管、培养板)
断裂点(充电) 高压偏转板
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四路分选原理
电荷式分选装置
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分选指标
• 分选时间由三方面决定：进样速度、目标细胞所占比例、 需要收集的细胞数。
需要细胞数
目标细胞所占比例(%)
1
5
50
104
• Hoechst（343, 450）常见为Hoechst33342和Hoechst33258，非嵌入的 方式与DNA链上的A-T碱基对结合。能对活细胞染色，用于活细胞 DNA定量分析，如精子分选；还用于侧群细胞的分选。
• PY（派若宁 560, 573） RNA染料，能进入活细胞。
• AO（吖啶橙 509, 525） DNA、RNA染料，染色后DNA呈黄绿色荧光， RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
• 多色标记荧光素搭配原则：每个通道只能选择一种荧光素； 各个通道之间的荧光素可以随意搭配。
FACSCalibur常用四色搭配：FITC、PE、PerCP、APC。
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B 根据抗原表达强弱合理选择 抗体
• 不同的荧光素强度有所不同；
CD5
• 高表达的抗原可用不太“亮” 的染料，更“亮”的荧光素分 配给表达低的抗原：
99%以上。 • 分选收获率是指被分选出的细胞与原来总细胞的百分比。 • 分选纯度和收获率永远是相互矛盾的，纯度提高，收获率
降低，反之亦然。
– 富集模式(enrich mode) – 纯化模式(purify mode) – 单细胞模式(single cell mode)
流式细胞术原理及应用ppt课件
•横坐标：道数 •纵坐标：细胞数
•横坐标：某细胞参数 相对含量
•纵坐标：该细胞另一
参数含量
等高线图（Contour Plot）
整理版课件
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细胞分选系统
• 电荷式分选 ✓超声振动器(15-100kHz) ✓液流充电系统 ✓高压偏转板 ✓收集装置(流式管、离心 管、培养板、载波片等)
MACS ®技术：Magetic Activated Cell Sorting 免疫学+细胞生物学+磁力学
流式细胞术原理及应用
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1
一、什么是流式细胞术？ 流式细胞仪的构造
二、怎样设计流式实验？ 三、流式实验中涉及到的关键步骤 四、常见流式细胞术应用
整理版课件
2
一、流式细胞术基本概念
• 流式细胞术（Flow Cytometry）是对于处在快速直 线流动中的细胞和生物颗粒进行多参数、快速的定量 分析和分选技术.
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科研应用
在免疫学研究中的应用: • 鉴定免疫细胞类型 • 抗原特异性T细胞研究 • 细胞因子分泌细胞研究 • 全血细胞研究 • 凋亡检测 • 细胞增殖检测 • 干细胞向免疫细胞分化的研究 • 转染荧光蛋白细胞系研究 • 稀有细胞检测 • 。。。
在神经生物学研究中的应用： • 神经干细胞和神经祖细胞的特性
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10
• 实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细 胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
红细胞、死细胞和碎片
整理版课件
粒细胞 单核细胞 淋巴细胞
11
• 阈值：溶液中的杂质或者死细胞，很容易产生微小的干扰信 号，所以必须设置阈值，排除杂质、细胞碎片或体积较小的 死细胞。
流式细胞术原理及应用 ppt课件
• 荧光染料/荧光化合物 PI、7-AAD等插入核酸链中； CFSE和蛋白质共价结合；
– 荧光蛋白-如GFP、RFP、YFP、CFP、mCherry、DsRed等，自身发荧 光。
ppt课件
19
常用荧光素
ppt课件
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常用荧光染料
• PI（碘化丙啶 535, 623） 可选择性的插入核酸双螺旋碱基对中。常用于 DNA分析，需要用RNase处理细胞排除RNA对DNA荧光定量的影响；PI 不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。
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• 实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细 胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
红细胞、死细胞和碎片
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粒细胞 单核细胞 淋巴细胞
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• 阈值：溶液中的杂质或者死细胞，很容易产生微小的干扰信 号，所以必须设置阈值，排除杂质、细胞碎片或体积较小的 死细胞。
•横坐标：道数
•横坐标：某细胞参数
•纵坐标：细胞数
相对含量
•纵坐标：该细胞另一
参数含量
等高线图（Contour Plot）
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细胞分选系统
• 电荷式分选 超声振动器(15-100kHz) 液流充电系统 高压偏转板 收集装置(流式管、离心 管、培养板、载波片等)
MACS ®技术：Magetic Activated Cell Sorting 免疫学+细胞生物学+磁力学
RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
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三、如何设计流式实验
准备工作： •确定实验要检测的marker •选择合适的荧光素标记的抗体 •选择合适的同型对照抗体
– 荧光蛋白-如GFP、RFP、YFP、CFP、mCherry、DsRed等，自身发荧 光。
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常用荧光素
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20
常用荧光染料
• PI（碘化丙啶 535, 623） 可选择性的插入核酸双螺旋碱基对中。常用于 DNA分析，需要用RNase处理细胞排除RNA对DNA荧光定量的影响；PI 不能透过活细胞膜，常用于鉴定死细胞。
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• 实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细 胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。
红细胞、死细胞和碎片
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粒细胞 单核细胞 淋巴细胞
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• 阈值：溶液中的杂质或者死细胞，很容易产生微小的干扰信 号，所以必须设置阈值，排除杂质、细胞碎片或体积较小的 死细胞。
•横坐标：道数
•横坐标：某细胞参数
•纵坐标：细胞数
相对含量
•纵坐标：该细胞另一
参数含量
等高线图（Contour Plot）
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细胞分选系统
• 电荷式分选 超声振动器(15-100kHz) 液流充电系统 高压偏转板 收集装置(流式管、离心 管、培养板、载波片等)
MACS ®技术：Magetic Activated Cell Sorting 免疫学+细胞生物学+磁力学
RNA呈橙黄色荧光，可进行DNA/RNA双参数分析。
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三、如何设计流式实验
准备工作： •确定实验要检测的marker •选择合适的荧光素标记的抗体 •选择合适的同型对照抗体
流式细胞术ppt课件
可区分高FL细胞与低FL细胞。 一般的流式细胞仪装有一个激光光源（488nm），可
测出三个FL，即FL1、FL2、FL3，大型的流式细胞仪 装有三个激光光源（488nm、633nm和407nm），可测 出13个FL。
2、荧光信号
双色直接染色
二、荧光染料的选择
选择荧光染料要考虑: 1、流式细胞仪配置的激光可否激发该荧光染料； 2、流式细胞仪可否检测该荧光染料的发射波长； 3、使用多种荧光染料时，要考虑荧光染料之间的干扰。
二、荧光染料的选择
颜色补偿
➢荧光染料的发射波长范围一般宽于检测器检测到的波 长范围；检测范围之外的波长可能会进入相邻的检测器 被检测，从而造成荧光信号之间的干扰。流式细胞仪可 以通过“颜色补偿”校正这一干扰。 ➢ 单标管用于调补偿。
Fluorescein (FITC)
300 nm
400 nm
Excitation
500 nm
Wavelength
Emisson
600 nm
700 nm
400 nm
500 nm
600 nm
700 nm
Protein
Phycoerytherin (PE)
300 nm 400 nm
Excitation Emisson
500 nm
600 nm
700 nm
Protein
FITC和PE荧光光谱
直接染色
间接染色
样品制备过程中常见的问题及解决对策
常见问题 细胞密度低 非特异荧光
强
碎片多 细胞聚集
荧光弱
原因 细胞损失 抗体不纯、死细胞多
细胞死亡、机械损伤 消化不完全
抗体少、反应时间短
解决对策 增加离心时间、弃上清 选择纯度高的抗体、用同型 对照抗体或双标记排除非特
测出三个FL，即FL1、FL2、FL3，大型的流式细胞仪 装有三个激光光源（488nm、633nm和407nm），可测 出13个FL。
2、荧光信号
双色直接染色
二、荧光染料的选择
选择荧光染料要考虑: 1、流式细胞仪配置的激光可否激发该荧光染料； 2、流式细胞仪可否检测该荧光染料的发射波长； 3、使用多种荧光染料时，要考虑荧光染料之间的干扰。
二、荧光染料的选择
颜色补偿
➢荧光染料的发射波长范围一般宽于检测器检测到的波 长范围；检测范围之外的波长可能会进入相邻的检测器 被检测，从而造成荧光信号之间的干扰。流式细胞仪可 以通过“颜色补偿”校正这一干扰。 ➢ 单标管用于调补偿。
Fluorescein (FITC)
300 nm
400 nm
Excitation
500 nm
Wavelength
Emisson
600 nm
700 nm
400 nm
500 nm
600 nm
700 nm
Protein
Phycoerytherin (PE)
300 nm 400 nm
Excitation Emisson
500 nm
600 nm
700 nm
Protein
FITC和PE荧光光谱
直接染色
间接染色
样品制备过程中常见的问题及解决对策
常见问题 细胞密度低 非特异荧光
强
碎片多 细胞聚集
荧光弱
原因 细胞损失 抗体不纯、死细胞多
细胞死亡、机械损伤 消化不完全
抗体少、反应时间短
解决对策 增加离心时间、弃上清 选择纯度高的抗体、用同型 对照抗体或双标记排除非特
流式细胞术测定植物基因组大小
临床型(BD,FACSCalibur台式机)
特点：
光路调节系统固定
自动化程度高
操作简便
使用寿命长
配备1-2根激光
细胞分选速度慢， 主要用于细胞分析
大型机(BD,FACSAria科研型)
特点： 分辨率高
选配多种波特定培养孔 或板上（4路和24 孔板）
主要表达方式
Pseudo 3D Plot
3D Plot
二 植物C值分析原理
利用特殊的荧光染料(PI、EB、AO等)与细胞内DNA碱 基结合，被荧光染料染色的细胞在激光照射下发射出荧光， 荧光强度与DNA含量成正比。流式细胞仪通过测定细胞的 荧光强度推算出细胞的DNA含量。
流式细胞仪计算测量DNA含量实际上是细胞周期的测 量，由于细胞核G1期的DNA含量反应一个细胞的倍性，因 此常用DNA含量来估计细胞倍性，包括DNA的绝对含量或相 对含量。
DNA指数(DNA index,DI)：DI指的是样本G0/G1峰的平均道数与正常二
倍体G0/G1峰的平均道数之间的比值。DI为1 意味着二倍体(2c)。
DI=
样品G0/1细胞峰均道值
正常二倍体标准细胞G0/1期细胞均道值
倍体(Ploidy)：原指染色体数目，流式中用来描述总的DNA含量。二倍体 细胞有正常细胞的DNA含量但不除外染色体异常。DI为1.9-2.1 的细胞为 四倍体(CV<5%)。除二倍体和四倍体，其他均称异倍体。
DNA的倍体和DNA指数的关系
DI=1.0±0.01 DI=1.0±0.15 DI=2.0±0.1 DI>2.10
例：
DNA倍体
正二倍体 (2n, Diploid) 亚二倍体 (Haploid) 四倍体 (Teraploid) 低倍体 (Hypoploid) 高倍体 (Hyperploid)
流式细胞术应用概述分析解析ppt课件
抑制免疫反应/杀伤异源细胞
CD3+CD8+CD28CD3+CD4+CD29-
CD3+CD4+CD8+
抑制性T细胞(Ts) 杀伤性T细胞(Tc)
活化的T细胞
抑制细胞和体液免疫 细胞毒性T细胞 在T细胞恶性增生时升高
CD3+CD4-CD8CD4+/CD8+比值 CD45RA+CD45RO-
表达 / T细胞受体(TCR / )
设定阴性、阳性范围
-
12
第二部分
流式细胞术在临床检测和科研中的应用
一、免疫学检测和科研应用
-
13
1、细胞表面分子标记
（以淋巴细胞亚群检测为例）
-
14
原理
人的淋巴细胞根据其生物功能和细胞表面抗原的表达可 分为三大类：T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK自然杀伤 细胞。
T淋巴细胞特异性标志为CD3，包括CD4＋和CD8＋T细胞 两个亚群；
幼稚的/静止的T淋巴细胞
当免疫系统没有能力更新辅助性或抑 制性/细胞毒性淋巴细胞的祖细胞时此 细胞亚群较低
CD45RA-CD45RO+
记忆性T淋巴细胞
病菌感染时升高, 但在慢性病毒感染, 如HIV患者中降低
CD45RA+CD45RO+
活化的T细胞, 感染时升高 感染时升高
CD4+CD25+CD127- 调节性T细胞（Treg-)
T淋巴细胞
-
16
淋巴细胞亚群及功能
T淋巴细胞(CD3+) CD3+CD4+
名称
功能
辅助性/诱导性T细胞(Th/Ti) 辅助和诱导细胞免疫和体液免疫
CD3+CD8+CD28CD3+CD4+CD29-
CD3+CD4+CD8+
抑制性T细胞(Ts) 杀伤性T细胞(Tc)
活化的T细胞
抑制细胞和体液免疫 细胞毒性T细胞 在T细胞恶性增生时升高
CD3+CD4-CD8CD4+/CD8+比值 CD45RA+CD45RO-
表达 / T细胞受体(TCR / )
设定阴性、阳性范围
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第二部分
流式细胞术在临床检测和科研中的应用
一、免疫学检测和科研应用
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1、细胞表面分子标记
（以淋巴细胞亚群检测为例）
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原理
人的淋巴细胞根据其生物功能和细胞表面抗原的表达可 分为三大类：T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK自然杀伤 细胞。
T淋巴细胞特异性标志为CD3，包括CD4＋和CD8＋T细胞 两个亚群；
幼稚的/静止的T淋巴细胞
当免疫系统没有能力更新辅助性或抑 制性/细胞毒性淋巴细胞的祖细胞时此 细胞亚群较低
CD45RA-CD45RO+
记忆性T淋巴细胞
病菌感染时升高, 但在慢性病毒感染, 如HIV患者中降低
CD45RA+CD45RO+
活化的T细胞, 感染时升高 感染时升高
CD4+CD25+CD127- 调节性T细胞（Treg-)
T淋巴细胞
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淋巴细胞亚群及功能
T淋巴细胞(CD3+) CD3+CD4+
名称
功能
辅助性/诱导性T细胞(Th/Ti) 辅助和诱导细胞免疫和体液免疫
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DNA的倍体和DNA指数的关系
DI=1.0±0.01 DI=1.0±0.15 DI=2.0±0.1
DI>2.10
二倍体 近二倍体 四倍体 多倍体
例：
D N A 倍 体
正 二 倍 体 (2n,D iploid) 亚 二 倍 体 (H aploid) 四 倍 体 (T eraploid) 低 倍 体 (H ypoploid) 高 倍 体 (H yperploid)
流式细胞仪(Flow Cytometer)
集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细 胞荧光化学技术、流体力学为一体的一种新型高科技仪器。
流式细胞术特点
单细胞悬液 或生物颗粒 分析速度高
多参数
精度高
高灵敏度
当代最先进的细 胞定量分析技术
无害分析 和分选
流式细胞仪检测范围
细胞大小
G0G1
count
s G2M
0
200
400
600
800
1000
2N
4N
DNA content
DNA检测的常用术语
变异系数(Coefficient of Variation,CV)：通常以G0/G1峰的宽度来反映,该 指标反映了仪器的分辨率或精确度。影响CV的因素主要包括两方面： 仪器因素（如鞘液的流速、光路、机器调试等）和样本制备(如样品中 碎片含量、细胞团块、细胞活性和细胞浓度等)及染色过程对标本的人 为影响。优化DNA分析条件就是指最大程度地减少这两大因素带来的变 异。
➢主要表达方式
Pseudo 3D Plot
3D Plot
二 植物C值分析原理
利用特殊的荧光染料(PI、EB、AO等)与细胞内DNA碱 基结合，被荧光染料染色的细胞在激光照射下发射出荧光， 荧光强度与DNA含量成正比。流式细胞仪通过测定细胞的 荧光强度推算出细胞的DNA含量。
流式细胞仪计算测量DNA含量实际上是细胞周期的测 量，由于细胞核G1期的DNA含量反应一个细胞的倍性，因 此常用DNA含量来估计细胞倍性，包括DNA的绝对含量或相 对含量。
光电转换 数据处理系统 • 细胞分选系统
液流系统：流动室、液流驱动系统
Injector Tip
Sheath fluid
Fluorescence signals
Focused laser beam
液流中心由单列 匀速运动颗粒组 成的液柱
分选系统
488 nm laser
Charged Plates
FALS Sensor Fluorescence detector
DNA指数(DNA index,DI)：DI指的是样本G0/G1峰的平均道数与正常二
倍体G0/G1峰的平均道数之间的比值。DI为1 意味着二倍体(2c)。
DI=
样品G0/1细胞峰均道值
正常二倍体标准细胞G0/1期细胞均道值
倍体(Ploidy)：原指染色体数目，流式中用来描述总的DNA含量。二倍体 细胞有正常细胞的DNA含量但不除外染色体异常。DI为1.9-2.1 的细胞为 四倍体(CV<5%)。除二倍体和四倍体，其他均称异倍体。
细 胞 结 构
细胞粒度
细胞表面面积
细
核浆比例
胞 功
DNA含量与细胞周期 能
特异性抗原 （细胞表面/胞浆/核） 细胞内细胞因子 细胞活性 酶活性
RNA含量 蛋白质含量
激素结合位点 细胞受体
流式细胞技术的最新突破
细胞信号转导/通路分析 细胞间相互作用 分子共定位与胞内分子转运 细胞形态学 荧光原位杂交 基因表达分析 细胞凋亡 细胞周期分析 白细胞亚群分析
第十一课：流式细胞术测定植 物基因组大小概论
一 流式细胞术的基本知识
概念
流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)
流式细胞术，即利用流式细胞计对处在快速直线流动状态中的单细 胞活生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分 选的现代细胞分析技术，是20世纪70年代发展起来的一项技术，综 合了激光技术、计算机技术、半导体技术、流体力学、细胞化学等 各学科的知识，它orted into test tubes
信号检测--散色光
它反应细胞的物理特性,根据前侧向散射 光，可以把不同类型的细胞群加以区分 FSC(前角散射光)它反应细胞的相对大小和截面积的大小
SSC (90度角散射光)代表细胞的颗粒度和精细结构的变化
Laser
FALS Sensor
D N A 指 数 (D I) 意 义 (染 色 体 数 )
1.00
46条 染 色 体
0.50
23条 染 色 体
2.00
92条 染 色 体
<1.0
<46条 染 色 体
>1.0
>46条 染 色 体
Normal Cell Cycle
M G2
G0
G1
s
DNA Analysis
G0G1
count
s G2M
0
200
400
600
800
1000
2N
4N
DNA content
300
DNA Analysis
DNA index 1.21 Aneuploid peak
225
150
Counts
75
0
0
200
2N400
4N 600
800
1000
PI Fluorescence
复叶槭
猕猴桃
柠檬马鞭草
柠檬 Loureiro et al.,2007. Fig 3
测量DNA的绝对含量时，须设一个已知DNA含量的标准样 品作对照，来换算出DNA的绝对含量。
样品2C DNA含量=[(样品G0/G1峰均值)/ (标准G0/G1峰均值)] ×标准2C DNA含量(pg DNA)
测量DNA的相对含量时，须设一已知倍性的同类材料作照， 换算出待测样品的DNA相对含量，进行倍性分析。
数据显示类型
单参数直方图（Histogram）
X轴：代表荧光信号或 散射光信号的强度，用 “通道数”表示，可以 与光强度之间线性关系 或对数关系
Y轴：代表该通道内所 出现具有相同光信号特 征性细胞的频率
二维等高图和密度图
二维点图Dot Plot
➢便于数据统计
➢不同的细胞群 可以用不同的颜 色标记
ImageStream成像流式细胞仪
分选微型模式生物
COPASTM 生物分选系统
模式动植物研究、大体积细 COPAS在线虫分选方面的应用，就在 胞研究及药物筛选等方面 Nature系列杂志上发表了7篇以上的文献
流式细胞仪的工作原理
• 光学系统 激光光源 光收集系统
• 液流系统 流动室
液流驱动系统 • 电子系统