乙肝表面抗原检测操作规程

乙型肝炎病毒表面抗原检测（ ELISA）

1原理：

在微孔板上预包被被纯化的乙肝表面抗体（HBsAb），配以酶标记抗体（ HbsAb-HRP）及 TMB 等其它试剂，采用夹心法原理检测人血清（或血浆）中乙肝表面抗原（HBsAg）。

2试剂：

2.1试剂名称：乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒（酶联免疫法）

2.2试剂生产厂家：英科新创（厦门）科技有限公司

2.3包装规格： 96Test/Kit

2.4试剂盒组成：HbsAb预包被微孔板（包被 HbsAb），HbsAg 酶标抗体（含 HRP标记 HbsAb）, HbsAg 阳性对照（含基因工程 HbsAg），HbsAg 阴性对照（正常人血清），HbsAg样品稀释液（含 BSA缓冲液），浓缩洗涤液（ PBS-T 缓冲液），底物 A（含 H2O2），底物 B（含 TMB），终止液（含

H2SO4），封板膜，自封袋，说明书。

2.5试剂储存条件及有效期： 2~8 ℃避光保存，有效 12 个月。

3样本采集：

取静脉血 3-4ml 于干净容器中分离出血清或血浆标本，如不及时测定可置于 4℃冰箱保存，如长期保存需置于 -15 至-20 ℃冻存，并避免样本反复冻融。高脂血、高胆红素及溶血样本可能会影响试验结果的准确性，建议不使用。

4所需仪器

4.1全自动酶免分析仪

4.2新鲜蒸馏水或去离子水

4.3酶标仪（单波长 450nm或双波长 450nm/630nm）

4.4微量移液器

4.537 ℃恒温箱或水浴箱

4.6洗板机或洗瓶

5检验方法

5.1平衡：将试剂盒各组分从盒中取出，平衡至室温

（ 18~25℃），微孔板板开封后，余者即时以自封袋封存。

5.2配液：浓缩洗涤液配置前充分摇匀（如有晶体应充分溶解），浓缩洗涤液和蒸馏水去离子水按 1：19 稀释后使用。

5.3编号：取所需数量微孔条固定于支架，按序编号。

5.4稀释：每孔加入 20ul 样品稀释液。

5.5加样：分别在相应孔中加入 100ul 阴、阳性对照血清或待测样本。

5.6温育：置 37℃温育 60min 。

5.7加酶：分别在每孔中加入酶标记抗体 50ul 。

5.8温育：置 37℃温育 30min 。

5.9洗涤：用洗涤液充分洗涤 5 次、洗涤后扣干（每次应

保持 30~60s 的浸泡时间）。

5.10显色：每孔加入底物 A、B 各 50ul ，轻拍混匀， 37℃

暗置 30min 。

5.11终止：每孔加入终止液 50ul ，混匀。

5.12测定：用酶标仪单波长 450nm 或双波长 450nm/630nm 测

定各孔 OD值（用单波长测定时，需用空白对照调零），并记录结果。

6结果判定与分析

临界值（ C.O. ）的计算：临界值 =阴性对照孔 OD平均值

*2.1 ；阴性对照 OD均值小于 0.05 时以 0.05 计算。

结果判定：样本 OD值 S/C.O.>=1 者为 HbsAg阳性样本 OD 值 S/C.O.<1 者为 HbsAg阴性阴性对照均值 >0.1 或阳性对照均值 <0.4 时，实验无效，应重新试验。

7质量控制

每次试验用 HBsAg的质控血清同步检测， S/CO值应在控制范围内；如失控，检查试剂校期、储藏温度、试验温度是否正常、操作步骤是否正确，直至从新试验使其在控。

8参考范围阴性

9临床意义

在血清或血浆中 HbsAg的存在表明有急性乙肝或慢性乙肝或为无症状携带者。

10操作性能灵敏度为 ng/ml ，特异性高

11方法的局限性

11.1此方法仅适用于个体的血清或血浆样本的检测，不适合与混合血清或血浆样本及其他体液样本。

11.2该方法仅作为定性检测乙型肝炎病毒表面抗原。

11.3试剂盒中的阳性对照不能作为灵敏度的考核指标，阳性对照仅用于按照说明书步骤操作时，验证试剂盒中的组分

是否有效。

11.4由于方法学的局限性，本实验结果仅作为判断疾病的一

项依据，如需对患者进行确诊，建议施于其它检验手段予以确认。

12注意事项

12.1 试验前请详细阅读试剂说明书，任何违反试剂说明书的使用或操作行为，都可能得到不准确的结果。

12.2所有样本、试剂和各种废弃物应按传染物处理，严格防止交叉感染，严格健全和执行消毒隔离制度。对于含有传染病和怀疑含有传染源的物质，应有合适的生物安全保证制度，下列为有关注意事项，但不仅限于此：

1）戴手套处理样本和试剂；

2）不要用嘴吸样；

3）不可在处理这些物品时吸烟、进食、喝饮料、美容和处理隐形眼镜等；

4）用消毒剂对溅出的样本和试剂进行消毒；

5）按科室有关条列来消毒和处理所有样本、试剂和潜在的污染物。

12.3加试剂前应先将试剂瓶翻转数次，使液体混匀。建议使用加液器进行加液，并经常对加液器进行校准。加液时注意勿使加液枪头接触孔内液体，避免液体间相互污染。仔细操作，避免加样时在孔中产生气泡。

12.4每板设阴、阳性对照各两孔，设空白对照 1 孔，空白对

照不加样本和酶标抗体、其余各步相同。

12.5避免在孵育和保存过程中试剂被阳光暴晒和接触次氯酸等

强氧化性物质。

12.6孵育温度要保持在 37℃+-1 ℃，温度过高或者过低可能会影响检测结果的准确性。

12.7封模板为一次性使用，重复使用可能导致污染。

12.8洗板机在使用结束后要使用新鲜蒸馏水或高品质去离子水冲洗干净，以防止管路堵塞和腐蚀。洗涤时各孔军需加满但不溢出，防止孔内有残留物未能洗净。

12.9每次洗涤结束请尽早进行后续加液操作，避免长时间暴露而引起错误结果。

12.10使用全自动生化仪器时，封板和洗版后扣干步骤可以省略。但需要注意保证洗涤液的加液量，保证洗涤后将微孔板孔中的洗液充分吸干，以免对实验造成错误的结果。

12.11确保反应孔板的底清洁干燥，在读板前要确保孔中液体没有气泡。

12.12终止后尽早用酶标仪进行读数测量（建议在 10min 内完成读值），避免放置过长时间而引起的错误结果。

12.13检测结果用酶标仪进行读数测量。样本的检测读数与样本中抗原的浓度不一定呈正相关。

12.14检测结果呈阴性的样本，不能绝对保证样本中没有低浓度抗原的存在，不能完全排除HBV感染的可能。

12.15该免疫测试不能绝对排除非特异性反应的存在，如对检测结果有疑问，用相应的确认试剂或方法对检测样本进行结果确

认。

12.16试剂盒各组分在正确处理和保存的情况下至效期都保持