硅酸盐细菌的选育与解钾性能研究

文章编号:1008-7524(2005)02-0025-03

硅酸盐细菌的选育与解钾性能研究

王康林,韩效钊,张雪琴,张愿成

(合肥工业大学化工学院,安徽合肥 230009)

摘要:从合肥郊区玉米地里分离出菌株经生化实验初步鉴定为硅酸盐细菌,在室温下,以钾长石为底物,用未驯化硅酸盐细菌浸出8、16、24天后测水溶性钾离子平均浸出率分别为0.31%、0.51%、0.58%;而第二次驯化硅酸盐细菌浸出时在同样条件下水溶性钾离子平均浸出率分别为0.69%、1.17%、1.49%,驯化后细菌浸出比未驯化细菌浸出时细菌解钾能力提高了2倍以上。

关键词:硅酸盐细菌;钾长石;细菌浸出

中图分类号:TD925.5 文献标识码:A

0 引言

目前,在生物肥料上广泛应用的菌种主要是硅酸盐细菌。第一次从土壤中分离出硅酸盐细菌的是前苏联学者亚历山大罗夫[1],他发现该细菌能分解硅酸盐类矿物如正长石和磷灰石释放出钾、磷。硅酸盐细菌一般认为属环状胶质芽胞杆菌,也有认为属邻单胞菌属[2]。硅酸盐细菌是一种化能异养菌,能利用葡萄糖、淀粉碳源,也能在无氮培养基上生长[3,4]。

在硅酸盐细菌的应用方面,有许多文献对此作了专门报道[3,5]。各种应用都主要利用硅酸盐细菌能分解矿石,一方面来提取有价金属和矿石除杂脱硅;另一方面利用该菌分解含磷含钾的矿石。本文主要探讨了如何从土壤中分离出硅酸盐细菌及该菌对钾长石是否有解钾作用。研究发现,硅酸盐细菌的确有解钾作用,但未驯化的自然界中的硅酸盐细菌解钾能力很低,经过驯化后解钾能力可提高2倍多。

1 材料与方法

1.1 土样

采自合肥郊区玉米地土壤,用小铲子除去表土,取5~10cm深处的土若干克。

1.2 培养基[6,7]

分离培养基(g/L):蔗糖5.0,FeCl3(1%)数滴,Na2H PO42.0,MgSO4 7H2O0.5,钾长石(160 ~180目)1.0,水1000mL,琼脂20。

发酵培养基(g/L):K2HPO41.0,MgSO4 7H2O0.2,NaCl0.2,(NH4)2SO41.0,葡萄糖10. 0,NaMoO4(2%)0.2mL,CaCO35.0,水1000 mL。

1.3 菌种的分离

在无菌操作下,称取5g土样溶于45mL无菌水充分振荡并稀释后涂布于已制好的分离培养基的平板上。倒放于28~30 恒温箱中培养3 ~5天,用接种针挑起透明凸起富有弹性的菌落进一步分离、纯化。

1.4 菌种的鉴定[8]

革兰氏染色实验,菌液涂片后干燥并固定,结晶紫染色1m in后水洗再用碘液媒染。用乙醇脱色后再用蕃红液复染,吸干后镜检,观察细胞颜色。

过氧化氢酶实验,将待测细菌接种于斜面培养基,28 恒温培养24h。检测用接种环取一小环菌种涂抹于已滴5%过氧化氢的玻璃片上,如有气泡产生为阳性,无气泡则为阴性。

硝酸盐还原实验,挑取纯培养物接种于硝酸

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收稿日期:2004-09-06

基金项目:安徽省自然科学基金资助(03045103),合肥工业大学化工材料院士基金。

盐胨水培养基中,置37 恒温箱内培养24h观察结果。在硝酸盐胨水培养基内的小倒管中若有气体产生者,即为产气试验阳性,表明该菌能还原硝酸盐并将亚硝酸分解产生氮气,否则为阴性。

淀粉水解实验,准备好淀粉培养基平板,用接种环取少量的待测细菌点接在培养基表面。将接种后的平皿置于37 恒温箱中培养48h。取出平板,滴加少量的碘液于平板上,轻轻旋转,使碘液均匀铺满整个平板。菌落周围如出现无色透明圈,则说明淀粉已经被水解,表示该细菌具有分解淀粉的能力,为阳性,菌落周围不出现无色透明圈则为阴性。

V.P.实验,接种该菌于装有葡萄糖蛋白胨培养液的试管中,置于37 恒温培养24h。取出试管,在培养基中加入40%的KOH溶液20滴,再加入等量的 -萘酚振荡,再放入37 恒温箱中15~30min,观察颜色变化。

1.5 细菌解钾实验方法

钾长石来自安徽宁国某矿山,经化学分析总钾含量为9.22%。称取5g已磨细至180~200目的钾长石矿粉,将矿粉入150mL锥形瓶中,添加灭菌后的发酵培养基90mL,另加10mL菌液。置于振荡器中振荡,振荡速度为120r/min。每隔一天定时称锥形瓶与浸出液质量,添加无菌水弥补自然蒸发损失的水份。为了消除实验操作中可能产生的误差,每组实验都在同样的条件下进行。

1.6 钾离子的测定方法[9]

将浸矿锥形瓶取下静置待澄清,用移液管吸取上层清液注入杯中,加入柠檬酸溶液(10%),搅拌后再加甲基橙指示剂溶液(0.1%)2滴,再用氢氧化钠溶液(8%)滴定至刚变黄色,用水稀释。搅拌下滴加四苯硼酸钠溶液,盖上表面皿静置沉淀15min。用已在恒温箱中干燥1.5h并事先称量的玻璃坩锅抽滤。用饱和的四苯硼酸钾洗液(pH =4)洗涤沉淀3次,最后用蒸馏水洗涤沉淀2次。待抽干后置坩锅于160 干燥箱干燥1h,取出冷却干燥至恒质量并称量。

2 结果与讨论2.1 菌株的分离筛选

对采集的土样采用常规系列稀释法分离,经多次划线分离后在分离培养基的平板上可观察到圆形、凸起、透明、粘稠的菌落,培养3~5d后菌落直径约为6~9mm。若修改分离培养基中成份,不添加钾长石矿粉,则在平板上观察不到有上述形态特征的菌落。说明该菌种必须以含钾矿物为营养成份才能很好地生长。

2.2 菌种鉴定结果

该菌革兰氏染色呈阴性,过氧化氢酶呈阳性,淀粉水解呈阳性,硝酸盐还原呈阴性,V.P.反应呈阴性。菌落特征圆形、凸起、透明、粘稠。初步鉴定该细菌为硅酸盐细菌。

2.3 细菌解钾效果

将从土壤获得的菌株用发酵培养基培养5d,连续培养两次后使用。每组试验用7个浸矿锥形瓶,第一、二、三组的浸出条件完全相同,由于四苯硼酸法测钾时会消耗大量的浸出液,两个做对照实验(只加灭过菌的培养基,不添加菌液)。实验结果见表1。将第一次浸出的菌液重新用发酵培养基培养5d,用此菌液作用于钾长石,再用同样的方法测定解钾效果,结果见表2。

表1 未驯化的硅酸盐细菌

对钾长石解钾效果%

时间/d

81624第一组

10.32

20.29

第二组

30.49

40.53

第三组

50.56

60.61

第四组(无菌)7000.00% 从表1知,直接从土壤中分离出来的硅酸盐细菌对钾长石确有解钾作用,可将钾长石中难溶性的钾变成可溶性的钾。而无菌对照实验说明培养基成份对解钾无任何作用。随着浸出时间的延长,钾的浸出率逐渐增高。

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