浅谈动物克隆技术

浅谈动物克隆技术

摘要：世界上第一只体细胞克隆动物——多莉的降生，打破了人们的一个传统观念，那就是多少年来人们一直认为植物体细胞具有全能性而动物体细胞则没有全能性。克隆技术是目前生物技术领域研究的热点之一，其科学意义和应用价值重大，本文全面综述了动物克隆技术及其原理，发展历史，现状以及展望与应用前景。

关键词：克隆技术，进程，现状，展望

前言

克隆动物是人类千百年来的梦想，科学家们曾在这方面做过许多探索，直到近20年来随着科技的发展，克隆技术日趋完善，使这一目标逐渐成为现实。世界上首只由成年动物体细胞经无性繁殖方式获得的完整个体的哺乳动物——多利一经公开报道，立即在全球引起轩然大波，它说明了在一定条件下，业已经历分化过程的体细胞仍然是可逆的，高等生物的体细胞也具有全能性，这样就使人的克隆在理论上成为可能，所以由多利带来了一场“克隆风暴”，并引起了一场有关于克隆动物的全球性讨论。

1克隆技术及其原理

“克隆”(clone )，即无性繁殖系(asexual reproduction )。无性繁殖的手段有多种，包括孤雌生殖、卵裂球的分离与培养、胚胎切割和细胞核移植等。而产生克隆动物的方法则称之为动物克隆技术[1]。在《中国大百科全书·生物学卷》中，对“克隆”的解释是:克隆又称无性繁殖细胞系和无性繁殖系，是一个细胞或个体以无性方式重复分裂或繁殖所产生的一群细胞或一群个体，在不发生突变的情况下，具有完全相同的遗传结构。同整个生物界的进程一样，克隆技术也是由低级到高级、由简单到复杂不断发展和进步的。它由单个细胞获得2个以上细胞、细胞群或生物体，发展到生物体内部的生物大分子的自我复制，在DNA复制酶的作用下，DNA分子可以复制生成两个一模一样的DNA分子。所以，克隆技术从细胞到分子、从植物到动物不断向前发展，特别是高等哺乳动物的克隆成功，标志着生命高科技水平已经进入一个崭新的阶段。动物克隆技术是通过显微操作技术把细胞核(供体)移人去除遗传物质的成熟卵母细胞(受体)中，细胞核在移人的细胞质的支持下，发生发育程序重编(reprogramming )，形成重组胚，使得核质重组体与正常受精卵一样，经细胞分裂、分化、并在母体内发育成一个新的动物个体称为细胞核移植技术[2]。在高等哺乳动物中，细胞核移植技术是生产克隆动物最为有效的克隆技术，因此，动物克隆技术实际上是指细胞核移植技术。

2 动物克隆的发展历史

1938年，诺贝尔奖获得者、德国胚胎学家提出了动物克隆的最早设想。经过近百年的发展，动物克隆技术已实现并取得了许多突破性的成果。据报道，动物克隆研究可分为3个主要发展阶段[3]。

2.1 胚胎细胞克隆阶段

胚胎细胞克隆是指所用供核细胞为发育至不同阶段的胚胎细胞进行克隆的技术。1952年，美国研究所的科学家将分化程度较高的囊胚细胞注入去核的卵中，得到重构胚卵裂并发育到蝌蚪，后证明经变态变成幼蛙，这是较早的成果之一。但直到1983年，美国科学家利用核移植技术结合细胞融合方法获得了克隆小鼠才真正拉开了哺乳动物克隆的序幕。此后，其他科学家也相继成功地克隆出小鼠、绵羊、牛、兔等

2.2 同种体细胞克隆阶段

在此阶段，所用供核细胞均属同物种的高度分化的体细胞。1997年2月，英国罗斯林研究所用成年羊高度分化的乳腺细胞进行了核移植获得了克隆羊“多莉”。这是第一次用成年体细胞作为供核细胞，说明高度分化的成年动物的体细胞可在适当条件下发生逆转恢复全能性，是生物技术史上具划时代意义的重大突破，是克隆技术的一个里程碑。

2.3 异种体细胞克隆阶段

濒危物种数量日益减少，很难提供用于克隆的卵母细胞和代孕受体，促使科学家提出了异种克隆的设想:将一种动物的体细胞核移植到另一种动物的去核(遗传物质)卵母细胞中，来得以实现克隆的技术。但此阶段技术还处在实验探究阶段，还没有完全成熟。

3 现状

自克隆出现后，人类对克隆的研究逐渐加深。一部分是面对家畜的生产的研究。例如，凋亡对转基因克隆囊胚的影响。

细胞凋亡在着床前胚胎发育过程中发挥着重要作用,胚胎凋亡检测能为获得高质量的体细胞克隆胚胎提供有益信息,进而有助于提高克隆效率.用原位末端标记法对牛的转基因克隆和转基因再克隆囊胚进行了细胞凋亡检测,再克隆囊胚是利用转基因克隆牛的体细胞作为供体细胞进行体细胞核移植后获得的第二代克隆胚胎.结果表明转基因克隆胚胎的囊胚发育率显著低于非转基因克隆胚胎的囊胚发育率,而转基因克隆囊胚的细胞凋亡指数显著高于非转基因克隆胚胎的细胞凋亡指数.此外,转基因再克隆胚胎的囊胚发育率和胚胎细胞凋亡指数与非转基因克隆胚胎的囊胚发育率和胚胎细胞凋亡指数相比差异性不显著.结果表明早期的转基因克隆胚胎发育能力的减弱可能是由于供体细胞的基因转染和药物筛选过程导致的,而再克隆对其早期胚胎的发育能力没有负面影响。【自然科学进展09年03期】

以及，胚胎移植方法和受体母猪因素对克隆猪生产效率的影响。【目的】建立高效的胚胎移植技术体系,以提高克隆猪的生产效率。【方法】比较不同移植方法和不同受体母猪状况的胚胎移植分娩率和克隆猪的出生效率,利用体外发育能力相似的不同品种和发育阶段的克隆胚胎混合移植确定最佳的受体母猪发情同期时间。【结果】克隆胚胎经由输卵管伞移植比输卵管打孔移植具有更高的移植分娩率和克隆猪效率(2.2%和0.4%,P<0.01),而胚胎移植后辅助人工授精会降低克隆效率(0.6%和2.2%,P<0.01)。利用经产母猪作为移植受体比青年猪受体具有更高的克隆效率(3.0%和0.8%,P<0.01)和平均窝产仔数((5.5±0.7)头和(2.7±0.3)头,P<0.05)。受体母猪发情时间比胚胎激活时间晚12—36 h组的克隆效率分别为显著(P<0.05)和极显著(P<0.01),高于晚0 h和早12—24 h组的克隆效率(2.0%、0.5%

和0%)。最佳的受体母猪发情时间为晚于克隆胚胎激活后24 h,克隆效率达3.0%。【结论】选择自然发情时间晚于克隆胚激活后24 h的经产母猪为受体,通过输卵管伞端移植胚胎,能够获得较高的克隆效率,是猪克隆胚胎移植的较理想方法【中国农业科学12年15期】

还有对克隆本身的研究。例如，基于软件多版本演化提取克隆谱系。针对单个版本克隆检测结果不足以体现克隆特征这一问题,从软件多版本中自动提取克隆谱系,获得克隆在软件演化过程中表现出的模式和特征。首先基于克隆代码Token表示及其所在文件名称、函数名称等位置属性,准确映射软件历时演化版本间的克隆代码,进而识别克隆演化模式;然后匹配克隆类ID号,合并所有相邻版本间的映射结果及演化模式信息,得到克隆谱系。同时开发了相应的克隆谱系自动提取工具FCG对6款开源软件进行了测试,发现当前版本中克隆代码平均生命周期占所研究版本总数的70%以上,且大部分没有发生变化,说明大部分克隆能被较好地维护,但也存在少量不稳定的克隆可能导致软件缺陷,需要修改或重构。实验结果表明FCG可高效提取克隆谱系,有助于更好地理解克隆及有针对性地管理克隆。【计算机应用15年第4期】

还有，量子点分子探针双标记技术研究癌细胞克隆生长行为。目的研究癌细胞的克隆生长行为,分析癌细胞的增殖特点。方法以乳腺癌MCF-7细胞、结肠癌SW480细胞和胃癌SGC7901细胞为研究对象,进行细胞克隆的形态学特点研究。用量子点分子探针双色标记技术,以绿色量子点标记癌细胞胞质,黄、红色量子点标记癌细胞胞核Ki67,观察癌细胞克隆的形成速度,克隆内细胞形态、离散趋势、Ki67表达分布情况。结果细胞克隆形成实验可见,乳腺癌MCF-7细胞生长6天形成克隆,结肠癌SW480细胞生长8天形成克隆,胃癌SGC7901细胞生长12天形成克隆。三种细胞均具有明显异型性特点;核质比大,易见病理性核分裂相;克隆周边细胞形成较多突触。部分克隆中,边缘细胞与克隆分离或呈分离趋势。量子点探针技术检测可见,大部分Ki67强阳性细胞分布于克隆周边或集中于一侧。结论Ki67广泛表达于MCF-7、SW480和SGC7901三种癌细胞,且在癌细胞克隆周边表达更强或集中于一侧,癌细胞克隆呈现明显的不对称生长行为。【肿瘤防治研究15年02】

同时还有因为克隆，人类所面临的伦理道德危机。克隆人立法的宪法规制。克隆羊多莉诞生以来,克隆技术迅猛发展,克隆人问题的现实性日益彰显。我国秉持禁止生殖性克隆、支持治疗性克隆的指导思想,出台了相关规章禁止克隆人。然而,目前我国克隆人的相关立法有违背宪法上的法律保留原则和比例原则之嫌,存在着合宪性问题。建议全国人大根据法律保留和比例原则制定专门的《克隆技术管理法》,明确界定克隆人的相关概念,禁止任何人从事生殖性克隆,并明确规定监管机关的监管职责以及违法应当承担的法律责任,同时将生殖性克隆入罪、明确立法的落日条款,以消解当前克隆人立法的合宪性问题,实现克隆人立法的宪法规制。【北方法学13年03期】

4 展望与应用前景

动物克隆技术是生命科学不断发展的产物,反过来,克隆技术的发展又为生命科学增添了许多内容,但也出现了许多问题。动物克隆研究是要重点解决克隆中的难题,寻找切人点,推动相应基础科研工作。克隆技术与不同领域的交叉是克隆技术的新增长点。