HPLC法同时检测猪盲肠中的DON(脱氧雪腐镰刀菌烯醇)和脱环氧DON

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2012年 第37卷 第10期

收稿日期：2012-04-16 *通讯作者

基金项目：国家自然科学基金项目(30871750)；公益性行业(农业)科研专项(201203037)。作者简介：崔莉(1983—)，女，山东聊城人，博士研究生，研究方向为食品质量与安全。

崔 莉，刘 阳*

(中国农业科学院农产品加工研究所，农业部农产品加工综合性重点实验室，

北京 100193)

摘要：以脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol ，DON)及其代谢产物脱环氧DON(DeepDON)为检测对象，建立了一种同时检测猪盲肠内容物中2种毒素的高效液相色谱分析方法。样品经乙腈提取后，分别采用吸附剂：木炭粉末+氧化铝+硅藻土(7+5+3，w+w+w)和Bond Elut Mycotoxin 多功能净化柱对DON 和DeepDON 进行净化，HPLC 检测，采用C 18色谱柱，乙腈/甲醇/水(5/5/90，v/v/v)为流动相，流速1.0 mL/min ，检测波长220 nm 。结果显示DON 和DeepDON 在0.5~10 μg/mL 范围内线性关系良好(R 2=0.9999，0.9998)。

关键词：猪盲肠；脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)；脱环氧DON

中图分类号：TS 207.5 文献标志码：A 文章编号：1005-9989(2012)10-0287-04

Detection of deoxynivalenol and de-epoxy DON in caecum of pig by

HPLC

CUI Li, LIU Yang *

(Institute of Agro-products Processing Science & Technology, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Key Laboratory of Agro-products Processing Comprehensive,

Ministry of Agriculture, Beijing 100193)

Abstract: The appropriate method of high performance liquid chromatography(HPLC) was built for detecting deoxynivalenol (DON) and de-epoxy metabolitesin in caecum of pig. The DON was extracted by acetonitrile, DON was cleaned up with mixture of charcoal power, alumina and celite (7+5+3, w+w+w), DeepDON was cleaned up by Varian Bond Elut Mycotoxin clean-up column, then detected by HPLC, adopting C 18 column and acetonitrile-methanol-water (5/5/90, v/v/v) mixture as mobile phase under the condition of flow rate 1.0 mL/min and detection wavelength 220 nm. The results showed that good linear correlations between the peak area and toxin concentration were found: the linear range for DON and DeepDON was 0.5~10 µg/mL(R²=0.9999, 0.9998).

Key words: caecum of pig; deoxynivalenol(DON); deepoxy-DON

HPLC法同时检测猪盲肠中的DON(脱氧雪腐镰刀菌烯醇)和

脱环氧DON

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脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)是单端孢霉烯族毒素，又名呕吐毒素(Vomitoxin)，广泛存在于受到镰刀菌污染的小麦、大麦、燕麦、黑麦、玉米等谷物及其制品中[1-2]，危害人畜健康。DON的毒性与动物的种属、年龄、性别、染毒途径等有关，猪比小鼠、家禽、反刍动物更敏感，肠道是DON吸收的主要部位[3]，体内体外实验均表明DON会影响肠道营养吸收，改变肠道细胞功能，危害肠道的屏障作用[4-6]。DON在体内经消化代谢，会在肠道和瘤胃内菌群的作用下脱去有致毒作用的环氧结构，生成毒性较小的产物脱环氧DON(Deepoxy deoxynivalenol，Deep-DON，DOM-1)[7]。DeepDON最早在鼠的尿液和粪便中发现，在猪的肠道和粪便中[8-9]、牛饲喂含DON的饲料后所产的奶中也检测到[10]。

目前DON毒素的检测方法研究主要集中在谷物及其制品等基质中，动物组织中同时检测DON 和DeepDON的方法较少，特别近年来尿液、粪便和血浆中研究较多[11-13]，肠道内研究较少。方法主要包括液相色谱、气相色谱、液质联用和气质联用[14-17]，质谱方法对设备要求较高，且DON毒素的检测最常用的是HPLC法[1]。因而本研究建立了一种同时检测猪盲肠内容物中DON和DeepDON 的HPLC方法，为进一步研究DON及其结合物的毒性和代谢提供方法支持。1 材料与方法1.1 材料

DON标准品：Sigma公司，纯度≥97.0%，配成0.1 mg/mL的乙腈工作液，-20 ℃保存；DeepDON标准品：Sigma公司，50 μg/mL乙腈溶液，-20 ℃保存；乙腈、甲醇：色谱纯，美国Fisher公司；乙腈：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；纯净水：杭州娃哈哈食品有限公司。

配制磷酸盐缓冲液[18](0.15 mol/L，pH6.4的PBS)：PBS缓冲液中加入0.0125%的微量元素溶液(0.66 g CaCl 2·2H 2O，0.5 g MnCl 2·4H 2O，0.05 g CoCl 2·6H 2O，0.4 g FeCl 3·6H 2O)和11.11%的Na 2S 溶液(2.88 g Na 2S加入到500 mL 0.037 mol/L的NaOH 中)，121 ℃灭菌15 min待用。1.2 仪器

Waters2695高效液相色谱系统、Waters2478紫外检测器、Waters-Empower色谱数据处理软件：美国Waters公司；氮气吹扫仪：杭州奥威仪器有

限公司；DGG-9053A型电热恒温鼓风干燥箱：上海森信实验仪器有限公司；SKY-1102c型全温度恒温摇床：上海苏坤实业有限公司；3K15型离心机：德国Sigma公司；Genius3涡旋混合器：德国IKA公司；Bond Elut Mycotoxin多功能净化柱：安捷伦公司；DONStar TM R免疫亲和柱：Romer公司。

1.3 肠道内容物稀释液的制备

新鲜猪盲肠取自北京第五肉联厂，猪宰杀后用棉线扎紧盲肠一端，马上割取盲肠，放入厌氧培养罐，以保证处在厌氧环境中。每个盲肠的内容物按一定体积比加入PBS缓冲液，过滤混合液，待用。等体积的滤液灭菌后作为基质对照。1.4 样品制备与净化

实验在充满CO 2的Sekuroka R 厌氧袋中进行，以保证与氧气完全隔离，模拟盲肠内环境，DON 标准品与盲肠内容物滤液在样品管中混合。

按照16:84的比例加入乙腈，振荡提取30 min，10000 r/min离心10 min，经净化处理后，1.5 mL流动相复溶，10000 r/min离心5 min，HPLC检测。

不同净化处理方法：(1)吸附剂净化：滤液按10 mL :1 g的比例，加入不同配比的木炭、氧化铝、硅藻土混合物，振荡30 min，过滤，滤液旋转蒸发浓缩。(2)多功能净化柱净化：旋转蒸发浓缩，乙腈/水(84:16)复溶，定容至50 mL，取6 mL 过多功能净化柱，净化液于氮吹管中，40 ℃条件下氮气流吹干。(3)免疫亲和柱净化：旋转蒸发浓缩，乙腈/水(84:16)复溶，定容至50 mL，4 mL滤液过Romer免疫亲和柱，10 mL PBS清洗后，6 mL甲醇洗脱于氮吹管中，氮气吹干。1.5 液相色谱条件设置

Waters2695高效液相色谱系统(Waters2478紫外检测器)；C 18色谱柱(3.9 mm×150 mm，5 μm)；流动相：乙腈/甲醇/水(5/5/90，v/v/v)；流速：1.0 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：10 μL；紫外检测波长：220 nm。2 结果与分析

2.1 DON及DeepDON净化方法的选择

由于肠道内容物基质复杂，样品检测时毒素的提取净化方法非常重要，如果净化不好，杂质过多，影响检测结果，如果净化处理步骤过多，会造成回收率过低。有关DON毒素的净化方