实验四细菌的分离培养及培养性状的观察
细菌的分离培养
细菌的分离培养实验目的：掌握在各种培养基上的接种方法并观察生长现象。
实验材料：菌种、普通琼脂平板、肉汤培养基、半固体培养基、斜面培养基、接种环、接种针、酒精灯。
实验内容：一、平板划线接种法（分离培养法）原理：通过在平板上划线，将混杂的细菌在琼脂平板表面充分的分散开，使单个细菌能固定在一点上生长繁殖，形成单个菌落，以达到分离纯种的目的。
若需从平板上获取纯种，则挑取一个单个菌落作纯培养。
用途：分离出纯种细菌，以利作纯培养。
操作方法（三区划线法）：1、右手拿接种环，烧灼冷却后，取菌液一环。
2、左手抓握琼脂平板（让皿盖留于桌上），在酒精灯火焰左前上方，使平板面向火焰，以免空中杂菌落入，右手将已沾菌的接种环在琼脂表面密集而不重叠的来回划线，面积约占整个平板的1/5-1/6，此为第一区。
划线时接种环与琼脂呈30-40度角轻轻接触，利用腕力滑动，切忌划破琼脂。
3、接种环上多余的细菌可烧灼（每划完一个区域是否需要烧灼灭菌视标本中含菌量多少而定），待冷后，在划线末端重复2-3根线后，再划下一区域（约占1/4面积），此为第二区。
4、第二区划完后可不烧灼接种环，用同样方法划第三区，划满整个平皿。
5、划线完毕，将平板扣入皿盖并作好标记，置37°C温箱孵育18-24小时观察琼脂表面菌落分布情况，注意是否分离出单个菌落，并记录菌落特征（如大小、形状、透明度、色素等）。
二、液体培养基接种法用途：凡肉汤、蛋白胨水，各种单糖发酵均用此法接种。
可以观察细菌不同的生长性状、生化特性以供鉴别之用。
操作方法：右手执笔式握住接种环，灭菌冷却后取单个菌落。
1、左手拇指、食指、中指托住液体培养基之下端，右手小指和无名指（或手掌）拔取试管塞，将管口移至火焰上旋转烧灼。
2、将沾菌的接种环移入培养基管中，在液体偏少侧接近液面的管壁上轻轻研磨，沾取少许液体与之调和，使菌液混合于培养基中（图5）。
3、管口通过火焰，塞好试管塞，将接种环灭菌后放下，经37C温箱孵育18-24小时，取出观察生长情况。
细菌的分离培养及培养性状的观察
实验四 细菌的分离培养及培养性状的观察在细菌学检验中，细菌的分离培养是重要的基本技术之一。
从混杂微生物中获得单一菌株纯培养的方法称为分离；纯培养是指一株菌种或一个培养物中所有的细菌都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代。
分离培养的目的在于从被检材料中，或者从污染的众多杂菌中分离出纯的病原菌。
细菌分离培养应先从被检材料或病料中分离培养单个菌落，然后钓取可疑菌落进行纯培养，再将纯培养物移植培养。
目的要求1．学习、掌握需氧菌和厌氧菌分离培养的基本要领和技术。
2．了解细菌的菌落形态及其在各种培养基上的培养性状。
3．了解培养性状对细菌鉴别的重要意义。
4．掌握钓菌、纯培养及移植技术。
操作步骤一．需氧性细菌分离培养法1. 平板划线分离法菌种被其他杂菌污染时或混合菌悬液常用平板划线法进行纯种分离，此法是借助将蘸有混合菌悬液的接种环在平板表面多方向连续划线，使混杂的微生物细胞在平板表面分散，经培养得到分散的由单个微生物细胞繁殖而成的菌落，从而达到纯化目的。
但划线分离的培养基必须事先倾倒好，需充分冷凝待平板稍干后才可使用；为便于划线，一般培养基不宜太薄，每皿约倾倒20 ml 培养基，培养基应厚薄均匀，平板表面光滑。
划线分离主要有连续划线法（图4-1）和分区划线法（图4-2）两种。
划线法示意图见图4-3。
（1）连续划线法以无菌操作用接种环直接取平板上待分离纯化的菌落。
将菌种点种在平板边缘一处，取出接种环，烧去多余菌体。
将接种环再次通过稍打开皿盖的缝隙伸入平板，在平板边缘空白处接触一下使接种环冷却，然后从接种细菌的部位在平板上自左向右轻轻划线，划线时平板面与接种环面成30～40度角，以手腕力量在平板表面轻巧滑动划线，接种环不要嵌入培养基内划破培养基，线条要平行密集，充分利用平板表面积，注意勿使前后两条线重叠。
划线完毕，关上皿盖。
灼烧接种环，待冷却后放置接种架上。
培 养皿倒置于适宜的恒温箱内培养。
培养后在划线平板上观察沿划线处长出的菌落形态，涂片镜检为纯种后再接种斜面。
实验四细菌的划线分离与培养
实验四细菌的划线分离与培养一、实验前要说明的几点问题点名,查看学生出勤情况;总结上次作业,提出作业中出现的问题并讲解; 二、板书部分一目的要求1.掌握需氧菌分离培养的基本要领;2.了解厌氧菌的分离培养原则及方法;二实验内容1.用普通琼脂平板做一次划线分离培养;2.用普通肉汤做一管大肠杆菌的移植培养;3.用普通琼脂斜面做一管金黄葡萄球菌的移植培养;4.用划线法进行真菌的分离培养示教三作业1.为什么要进行细菌的分离培养2.进行分离培养应注意哪些事项3.细菌分离培养的方法有哪些重点叙述平板划线法4.叙述真菌的划线分离方法;三、实验内容主要内容有分离培养及目的、注意事项、分离培养的方法、真菌的培养方法、患病动物病料中分离培养、钓菌、移植;1.什么是分离培养及目的：分离培养是细菌学检验的基本技术之一;分离培养之目的,在于从被检材料中由多种细菌里分离出一种细菌;2.注意事项：1分离培养前应考虑所分离的细菌的特性,选择适合其生长需要的培养基需氧还是厌氧、营养的要求高还是不高、培养温度等等;例如：链球菌在普通琼脂不长,要加血清或血液;大肠杆菌和葡萄球菌要求较低,普通的培养基即可生长;2防止污染;分离培养的整个过程要严格无菌操作;培养基和一切用具必须彻底灭菌；操作时必须靠近火焰；操作完毕后,禁止再让培养基接触外界空气;3防止接种器械过热,很容易杀死分离培养的细菌,如接种环在烧灼灭菌后,不能立即钓取细菌材料,应在酒精灯旁凉凉；另外还应注意防止已钓取菌料的接种环,不慎通过火焰而将细菌杀死;4初代分离时发现有多种细菌,观察找到目的菌落,再拿一肉汤培养基纯化培养;然后在接种实验动物,作成凝集抗原,做血清学鉴定,;还可以反过来做抹片染色观察;3.分离培养的方法：主要分需氧菌的分离培养方法、厌氧菌的分离培养方法和需要CO菌的培养分离方法;1）需氧菌的分离培养法1平板划线法：划线后有单个菌落,便于观察菌落的形态、溶血性等;方法左手拿琼脂平板,使其与水平面成45;角；右手拿铂金耳,使之与水平面平行,靠近酒精灯火焰操作;将接种环于酒精灯火焰中灼烧灭菌,待其冷却后,蘸取欲检材料少许,注意不要划破琼脂,不要划得太疏,以免造成浪费,不要重复划线,以免形成菌苔;划线方法：方格划线、蛇形划线、区域划线、交叉划线,选择其中一种进行划线;划毕,将接种环烧灼灭菌,于皿底用蜡笔标记被检材料名称及日期,倒转置恒温箱中培养;思考题：方格划线哪个地方会长出单个菌落比较多2倾注法：不常用,这里不做介绍2厌氧菌的分离培养方法厌氧菌生长繁殖的环境不能有游离氧的存在;故在培养厌氧菌时,必须创造一个厌氧环境,一般以降低氧的张力或保持减低的氧张力为原则;目前应用于厌氧菌的分离方法颇多,现就其中较简便且常用的几种方法介绍如下：1焦性没食子酸法利用焦性没食子酸在碱性溶液内能大量地吸收氧的原理进行厌氧培养;通常100cm3空间用焦性没食子酸1g,10%氢氧化钠或氢氧化钾10ml;具体方法有下列有平板培养法、干燥器培养法;平板培养法是将厌氧菌划线接种于适宜的琼脂平板,取一小团直径约2cm的脱脂棉,置于平皿盖的内面中央,其上滴加10%氢氧化钠溶液约5ml；在靠近脱脂棉的一侧放置焦性没食子酸约0.5g,注意暂勿使两者接触,立即将已接种好的平板覆盖于平皿盖上,迅速用融化的石蜡密封平皿边缘周围;封毕,轻轻摇动平皿,使被氢氧化钠溶液浸湿的脱脂棉与焦性没食子酸接触,然后置37℃恒温箱中培养之;干燥器培养法是于干燥器底部放入氢氧化钠溶液适量,然后再放入2-3个略高于液面的玻璃圆柱如链霉素小瓶,将适量焦性没食子酸用纸或纱布包好,放置于圆柱上面,使暂勿与氢氧化钠接触,然后放下隔板,将已接种的培养皿或试管置于隔板上,待一切准备好后,将盖盖好密封,并轻轻摇动干燥器,使焦性没食子酸落入氢氧化钠溶液中;2高层琼脂柱摇震培养分离法取长约15cm,直径约5mm的玻璃棒一支,一端塞以小木塞,另一端塞以棉花塞,高压灭菌备用；加热融化一管适合分离厌氧菌用的琼脂培养基,待冷却至50℃左右,接入少许经适当稀释的待分离的培养物或含菌材料,充分摇震均匀；在琼脂凝固前,迅速以无菌滴管吸取上述已接种的琼脂培养基,注入上述1准备好的玻璃管内,置恒温箱中培养;3连二亚硫酸钠法将已接种的平板或斜面培养基,置于一玻璃干燥器内预先测出体积,按每1000ml容积称取连二亚硫酸钠又称保险粉和无水碳酸钠各4g,并分别研细均匀,临用前混合置于一平皿内,放在培养基上层,然后将盖盖严,用凡士林密封,置37℃恒温箱中培养;2二氧化碳培养法少数细菌如布氏杆菌牛型,在含有10%二氧化碳的环境下生长良好;要创造这样的环境,常用的方法为烛缸法;将接种的培养基置玻璃干燥器或其他可以密闭的玻璃缸内,于其内点燃一小段蜡烛,加上盖盖边涂凡士林以防漏气,约一分钟左右蜡烛熄灭,此时缸内氧气已被耗尽,缸内所含二氧化碳约10%;注意蜡烛勿太长,而且不宜靠近缸壁,以免因局部玻璃过热而破裂;凡士林不能太多也不能太少,多了盖子滑落,少了则封口不严;4.真菌的分离培养法简单介绍应用细菌的平板分离法划线、倾注,能容易而满意地得到真菌的纯培养;划线法：2-5天长霉菌;1取琼脂培养基熔化,冷却至45℃,注入无菌平皿中,每皿15-20ml,作成平板待用;2取要分离的材料如田土、混杂的或污染的真菌培养物、真菌少许,投入盛无菌水之试管中,摇振,使分离菌悬浮水中;3将接种环经火焰灭菌并冷却后,蘸取上述悬浮液,进行平板划线;4划线完毕,置温箱中培养2-5天,待形成子实器官后,钓取单个菌落的部分,制片检查;若只有一种菌生长,即得纯种;另外,亦可在放大镜的观察下,用无菌镊子夹取一段待分离的真菌菌丝,直接放在平板上作分离培养,即可获得该种真菌的纯培养;5.自患病动物病料中分离病原菌方法简单介绍1琼脂斜面分离法取琼脂斜面三管,用接种环蘸取欲检病料少许如为脏器,现将表面灼烧后,用灭菌解剖刀切开,以接种环由切面钓取组织,混合于第一管的凝集水中,再做斜面划线；然后取出接种环,不经烧灼,继续在第二管、第三管斜面上作同样的划线;划毕,置温箱中培养;经此法分离培养后,第二管的菌落较第一管为少,第三管的菌落更少,如此较易得到单个菌落,达到纯培养之目的;2琼脂平板涂布分离法液体被检病料如血液、腹水等,可用灭菌毛细吸管或吸管吸取,置1-2滴于平板中央,用L形玻棒或玻璃刮铲作均匀涂布;如为脏器病料,可先做成乳剂再行涂布；或取其一小块,用镊子夹住,表面烧烙后,用灭菌刀切开,以其切面直接进行涂布;此法适用于含菌量较少的病料的分离;3通过试验动物分离法被检材料中疑有某种病原菌存在,可将病料接种于有易感性的动物体内,如疑有猪丹毒杆菌存在的病料,可注射于鸽体,鸽死后,再取其脾脏以分离猪丹毒杆菌,常可得到纯培养;四、钓菌和纯培养被检材料经分离培养后,选择欲分离的可疑菌落,用灭菌接种环针钓取少许,接种在新的培养基上,称为钓菌;钓取一个菌落培养出来的细菌培养物,称为纯培养;纯培养的目的在于进一步进行微生物学检验和其他试验研究;方法：首先用肉眼或放大镜观察并选择可疑的单个菌落,然后以蜡笔在可疑菌落下面的平皿底上作一记号,用灭菌的接种环针轻轻接触菌落,蘸取菌料少许,作抹片,染色,镜检;如其形态一致,即接种于适当的培养基上,置温箱中培养;6.细菌和真菌的移植方法简单介绍1接种环移植法:以左手持长有细菌或真菌的菌种和无菌的琼脂斜面各一管,管口并齐,管底握于掌中,以右手作握笔状紧执接种环,并进行火焰灭菌；以右手的小指和无名指扭开并夹住第一管的棉塞,无名指和中指扭开并夹住第二管的棉塞,或以小指和无名指同时扭开并夹住两管的棉塞;将管口通过火焰灭菌,然后用烧灼灭菌后的接种环插入菌种管内,钓取少许菌料,接种于无菌的琼脂斜面上;同样将管口通过火焰灭菌后,塞好棉塞,最后将接种环烧灼灭菌,用蜡笔在试管上标记菌名、日期,置温箱中培养;厌氧菌移植常用培养基和培养方法如上述钓菌项;2吸管或注射器移植法:移植定量的液体培养或表面有液体石蜡的厌氧菌培养物,一般也可以利用吸管或注射器移植,其操作方法系以无菌吸管或无菌注射器吸取培养物,代替接种环进行移植;四、示教1. 用普通琼脂平板做一次划线分离培养：点上酒精灯,取实验三所做好的普通琼脂平板,倒置,将培养基靠近酒精灯呈45度打开,然后用铂金耳钓取一环菌在培养基上划线,选四种方格划线、蛇形划线、区域划线、交叉划线画法中的一种;2. 用普通肉汤做一管大肠杆菌的移植培养：手拿大肠杆菌的培养试管和一管肉汤培养基,充分震荡;靠近酒精灯,灼烧管口,充分灼烧铂金耳,放到酒精灯旁边放凉,打开试管塞,灼烧试管口,将铂金耳钓取一环菌,然后将铂金耳放到肉汤培养基,摇晃;灼烧铂金耳,灼烧试管口,把试管塞上;充分灼烧铂金耳;将接好试管和铂金耳放到试管架;3.用普通琼脂斜面做一管金黄葡萄球菌的移植培养：用相同的方法接种,在斜边培养基上划线;放到温箱培养;4.用划线法进行真菌的分离培养示教：与细菌的划线培养相同,画好线后放如温箱培养30℃,2-5天,待形成子实器官后,钓取单个菌落的部分,制片检查;若只有一种菌生长,即得纯种;另外,亦可在放大镜的观察下,用无菌镊子夹取一段待分离的真菌菌丝,直接放在平板上作分离培养,即可获得该种真菌的纯培养;五、实验中应注意的问题1分离培养前应考虑所分离的细菌的特性,选择适合其生长需要的培养基需氧还是厌氧、营养的要求高还是不高、培养温度等等;例如：链球菌在普通琼脂不长,要加血清或血液;大肠杆菌和葡萄球菌要求较低,普通的培养基即可生长;2防止污染;分离培养的整个过程要严格无菌操作;培养基和一切用具必须彻底灭菌；操作时必须靠近火焰；操作完毕后,禁止再让培养基接触外界空气;3防止接种器械过热,很容易杀死分离培养的细菌,如接种环在烧灼灭菌后,不能立即钓取细菌材料,应在酒精灯旁凉凉；另外还应注意防止已钓取菌料的接种环,不慎通过火焰而将细菌杀死;4初代分离时发现有多种细菌,观察找到目的菌落,再拿一肉汤培养基纯化培养;然后在接种实验动物,作成凝集抗原,做血清学鉴定,;还可以反过来做抹片染色观察;六、作业1.为什么要进行细菌的分离培养2.进行分离培养应注意哪些事项3.细菌分离培养的方法有哪些重点叙述平板划线法4.叙述真菌的划线分离方法;七、本次实验总结1.掌握划线法,熟悉四种划线方法;以及细菌的移植方法;2.在操作过程中要防止污染;分离培养的整个过程要严格无菌操作;培养基和一切用具必须彻底灭菌；操作时必须靠近火焰；操作完毕后,禁止再让培养基接触外界空气;3.操作的过程中要注意不要让接种器械过热;防止杀死细菌或真菌,如接种环在烧灼灭菌后,不能立即钓取细菌材料,应在酒精灯旁凉凉；另外还应注意防止已钓取菌料的接种环,不慎通过火焰而将细菌杀死;八、附：实验四：细菌的划线分离与培养实验所需物品一、试验材料名称组别数量合计备注1、酒精灯 5 2 10 火机柴2、接种环 5 2 103、培养基自备用前融解普通琼脂4、菌种大肠杆菌肉汤、金黄色葡萄球菌斜面每组各1管5、病料粪便6、霉菌菌种7、真菌培养基马铃薯－葡萄糖培养基,应提前制备平板每班2个8、9ml生理盐水试管4只9、5ml吸管10、吸球11、酒精棉球二、仪器设备名称1、干燥箱1台2、水浴锅1台3、培养箱1台表1、试验仪器设备统计表学院牧医工程实验室名称畜牧微生物实验名称实验四细菌的划线分离与培养表2、试验试剂消耗情况统计表学院牧医工程实验室名称畜牧微生物实验名称实验四细菌的划线分离与培养表3.实验用低值易耗品及实验动物统计表系别：牧医实验室名称：畜牧微生物实验名称：。
实验四 细菌接种培养法与生长现象观察
实验四细菌的接种培养法与生长现象的观察【目的和要求】1．掌握无菌技术，建立无菌观念；明确无菌操作时注意要点。
2．掌握细菌的接种、分离培养方法和接种环的制作方法。
3．熟悉细菌生长现象的观察方法。
【试剂与器材】1．菌种：葡萄球菌、链球菌、大肠埃希菌、枯草芽胞杆菌等。
2．培养基：固体、半固体、液体培养基。
3．其他：温箱、酒精灯、接种环、接种针、L形玻棒、打火机、记号笔等。
【实验内容】一、细菌的接种工具1．接种环和接种针：其结构包括环（针）、金属柄、绝缘柄三部分（见图4-1）。
其中环（针）部分最佳材料为白金丝，因其受热和散热速度快，硬度适宜，不易生锈且经久耐用，但因为价格昂贵而限制了其应用。
目前实验室常用的是经济实用的300~500W电热镍鉻丝。
一般要求接种环长5~8cm，直径为2~4mm，定量接种环的容量为0.001ml。
图4-1 接种环和接种针接种环（针）在使用之前需检查镍鉻丝是否呈直线，若有弯曲，需用吸管或接种环的另一端将其压直；若环不圆，可将镍鉻丝前端放在吸管尖部缠绕一圈，再将镍鉻丝突出的部分朝内压紧。
接种环用于固体、液体培养基的接种，接种针用于半固体培养基的接种。
2．L形玻棒：由直径2~3mm的玻璃棒弯曲成L形制成。
在使用之前用厚纸包扎后置高压蒸汽灭菌，或沾取无水乙醇后在火焰上烧灼灭菌。
主要用于液体标本涂布接种。
二、细菌的接种方法1．液体培养基的接种该法主要用于细菌的增菌培养或进行细菌的生化反应。
方法：（图4-2）（1）先将接种环在火焰上烧灼灭菌，待冷却后挑取少许细菌。
（2）左手拿试管，右手持接种环，用右手其余手指将试管塞打开，试管口通过火焰烧灼灭菌。
（3）将接种环在贴近液面的管壁上上下碾磨数次，使细菌均匀分布于培养基中。
（4）将试管口灭菌后加塞，接种环烧灼灭菌后放回原处。
（5）在试管上做好标记，经35℃培养18~24h后观察结果。
图4-2 液体培养基接种法2．半固体培养基的接种该法可用于保存菌种、观察细菌的动力或进行细菌的生化反应。
实验四病原性球菌的检验
1、标本采集：脓液
2、检验程序：
脓液
↓
↓
直接涂片
分离培养
革兰染色镜检 （操作）（血琼脂平板）
↓
↓ 37℃ 18～24h
初报 挑取可疑菌落（性状、色素、溶血）
↓
鉴定试验及药敏试验
↓
↓
↓
↓
革兰染色镜检 生化反应鉴定 其他鉴定 药敏试验
↓
↓
↓
↓
↓37℃ 18～24h
报告
三、葡萄球菌属生物化学反应：
（一）触酶试验（操作）
规定时间内出现清晰凝集者为阳性，不出现凝集 者为阴性。
主要用于风湿热的辅助诊断：
风湿热患者ASO大多在250单位；
活动性风湿热患者ASO一般≥400单位。
『实验报告』
绘出化脓性球菌镜下形态图。 记录脓液标本的分离培养与鉴定程序。
实验四 病原性球菌的检验
病原性球菌，又称化脓性球菌，根据革 兰染色性的不同，分为两类： G＋球菌： 葡萄球菌、链球菌、肺炎链 球菌等。 G- 球菌： 脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌 等。
『目的要求』
掌握：葡萄球菌、链球菌、肺炎链球菌、脑膜 炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌的形态及染色特点；葡 萄球菌、链球菌的菌落特点及链球菌在血琼脂 平板上的溶血性；血浆凝固酶试验、触酶试验 的试验方法、结果及意义。
四、抗链球菌溶血素“O”的测定（乳胶法，示教）
1、原理：ASO高滴度的血清被适量溶血素“O”中 和后，失去了正常水平量的抗体，多余的抗“O” 抗体与ASO乳胶试剂反应，出现肉眼可见的，清 晰均匀的凝集颗粒（ASO乳胶试剂系羧化聚苯乙 烯乳胶与溶血素“O”共价交联的产物）。
2、方法：（略）3、结Fra bibliotek及意义：1、原理：
病原菌的分离培养和纯化
普通植物病理学实验十七、病原菌的分离培养和纯化一、目的要求1了解分离与纯化微生物的基本原理及方法;2掌握倒平板的方法和组织分离、稀释分离、平板划线分离的基本操作技术;3掌握在平板、斜面及液体培养基上培养病原菌及观察其培养性状的方法;二、基本原理植物病原菌的分离培养,是植物病理实验室工作中的基本技能;为了获得某微生物的纯培养,一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气等条件要求不同,而供给它们适宜的生活条件,即让病原菌生活在适宜的培养基上,或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长,而抑制其他菌生长的环境,从而得到纯菌株;植物病原真菌的分离方法主要有组织分离法和稀释分离法两种;最常用的方法是组织分离法,而稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子的病原真菌的分离;病原细菌的分离方法以划线分离法为最常用,在有些情况下也采用稀释分离法;为了获得分离菌的纯培养,必须要进行分离菌的纯化,纯化的方法类似于分离工作中采用的稀释分离法或划线分离法;三、材料、仪器与用具1．材料依当地情况进行选择,下列材料供参考1稻瘟病叶、病节、病穗颈pyricularia orycae;2玉米大斑病叶exserohilum turcicum;3玉米弯孢菌叶斑病叶curvularia lunata;4玉米小斑病叶bipolaris maydis;5番茄灰霉病果botrytis cinefca;6黄瓜菌核病果sclerotinia sclerotiorum;7黄瓜细菌性角斑病叶pseudomonas syringaepv．1achrymans;8水稻白叶枯病叶xanthomonas campestms pv.oryeue;9大豆细菌性斑点病叶pseudomonas syringaepv．glycinea;10白菜软腐病叶erudnia carotovora subsp．carotovora;2．培养基pda培养基；肉膏蛋白胨培养基；加寄主组织煎汁的培养基等;3．仪器与用品超镜工作台、培养箱、培养皿、吸管、吸水纸、三角玻璃棒、剪刀、解剖刀、镊子、接种铲针、接种环铒、70％酒精、0．1％升汞、酒精灯、火柴、记号笔、橡皮筋套、可调式电炉、铝锅等;0．1％升汞溶液配制：升汞1e 浓盐酸2．5ml 蒸馏水1000ml;先将升汞溶于盐酸中,待充分溶解后,再加水稀释;升汞是剧毒药物,在操作时应特别小心;四、实验操作一病原真菌的分离1．组织分离法按照以下步骤进行：1取灭菌培养皿一个,置于湿纱布上,在皿盖上用玻璃铅笔注明分离日期、材料和分离人的姓名;提示：为了保证无菌操作,应注意下面几点：工作前最好将所需的物品都放在超净工作台内,工作中临时去取容易带来杂菌；保证工作人员自身的洁净,工作前用肥皂洗手；无菌操作前还要用70％酒精擦拭双手；工作中,特别在使用无菌操作间时,呼吸要轻,不要说话;2用无菌操作法向培养皿中加入25％乳酸1--2滴可减少细菌污染,然后将融化而冷至60c左右的pda培养基倒人培养皿中,每皿倒10--15ml,轻轻摇动使之成平面;凝固后即成平板培养基;提示：加入25％乳酸1～2滴,可基本保证平板上不出现污染细菌苗落;除乳酸外,在培养基中加入适当的抗菌素抑制细菌的生长,也是常用的方法;加青霉素20μg／ml可以抑制g+细菌生长；加多黏霉素b5．0μg／ml可以抑制g—细菌生长；加链霉素40μg／ml或氯霉素50μg／ml可以抑制大部分细菌的生长;除了氯霉素可在灭菌前加入外,其他抗菌素都应在灭菌后并冷却到45c左右以手背触三角瓶感到烫,但尚可以忍耐为宜’时加入;倒平板过程中只要遵循“稳、轻、快”要领,不必在火焰上方,一般很少污染;3取真菌叶斑病的新鲜病叶或其他分离材料,选择典型的单个病斑,用剪刀或解剖刀从病斑边缘病健交界处切取小块海边长3--4mm病组织数块;提示：选择新患病的组织作为分离的材料,可以减少腐生菌混入的机会;腐生菌一般在发病很久而已经枯死或腐败的部分滋生,因此,一般斑点病害应在临近健全组织的部分分离;4将病组织放人70％酒精中浸3—5s后,按无菌操作法将病组织移人0．1％升汞液中分别表面消毒0．5、1、2、3、5rain也可使用其他表面消毒剂,如植物组织柔嫩,则表面消毒时间宜短；反之则可长些;然后放入灭菌水中连续漂洗三次,除去残留的消毒剂;提示：先用70％的酒精浸2、3s是为了消除寄主表面的气泡,减少表面张力,70％的酒精亦用于表面消毒,处理的时间较短一般数秒至lmin;升汞溶液消毒的时间因材料而异,可自30s至30min不等,一般情况下,需时间3,5min;5用无菌操作法将病组织移至平板培养基上,每皿内放4--6块;提示：在将病组织小块移放到平板表面之前,应将其在无菌吸水纸上吸去多余的水,以大大减少病组织附近出现细菌污染; 6将培养皿倒置放人2512左右恒温箱内培养;一般3—4d后观察待分离菌生长结果;7若病组织小块上均长出较为一致的菌落,则多半为要分离的病原菌;在无菌条件下,用接种针铲自菌落边缘挑取小块移入斜面培养基上,在25℃左右恒温箱内培养,数日后,观察菌落生长情况,如无杂菌生长,即得该分离病菌纯菌种,便可置于冰箱中保存;提示：除根据菌落的一致性初步确定长出的菌落是否目标菌外,还要在显微镜下检查,进一步确定;如果是对未知病原菌的组织分离,则要将长出的蕾落分别转出,通过进一步的接种实验明确哪一种为其病原菌;在组织分离工作中,如果植物材料体积较大且较软如患灰霉病的番茄果实,在分离过程中可直接挖取内部患病组织移人平板培养基上,完成分离工作;2．稀释分离法1取灭菌培养皿三个,平放在湿纱布上,编号,并注明日期、分离材料及分离人姓名;2用灭菌吸管吸取灭菌水,在每一皿中分别注入0．5～1．0ml;3用移植环蘸一滴孢子悬浮液,与第一个培养皿中的灭菌水混合,再从第一个培养皿移三环到第二个培养皿中,混合后再移三环到第三个培养皿中;4将熔化开冷却到45～50c的培养基,分别倒在三个培养皿中为防止细菌污染,也可以向每个培养皿中事先加入1-2滴25％乳酸,摇匀,凝固,要使培养基与稀释的菌液充分混匀;提示：倒平板时的培养基温度一定要掌握好,过热易将病原菌烫死而使分离失败,过冷则倒入培养皿中后难以形成平板,而成为起伏不平的表面,不利于分离;为大体估计培养基温度,可将盛培养基的器皿靠在人手背上,如果手背感到烫但尚可以忍耐,则大体为45~50c;5将培养皿翻转后置恒温箱2513中培养,数日后观察菌落生长情况;6挑菌;将培养后长出较为整齐一致的单个菌落分别挑取,接种到斜面培养基上,置25℃左右培养;待菌长出后,检查菌是否单纯,若有其他菌混杂,就要再一次进行分离纯化,直到获得纯株培养;二病原细菌的分离病原细菌的分离方法以稀释分离法和划线分离法为最常用;在进行分离之前,首先应对病组织材料进行细菌学初步诊断,即经过镜检确认有喷菌现象以后,才对该病组织作分离工作;稀释分离法是最经典的标准分离法,方法同上述真菌分离;除去上述稀释分离法以外,较为方便的是划线分离法：1预先把熔化好的肉膏蛋白胨培养基倒在培养皿中,凝成平板后,翻转放在30c恒温箱中2—4h,使表面无水滴凝结;也可凝成平板后直接使用;2将病组织先用0．1％升汞表面消毒0．5--2min,再用无菌水换洗3次后,放在灭菌培养皿中的灭菌水中,用灭菌玻棒研碎,并让组织碎块在水中浸泡20—60min,让细菌释放到灭菌水中; 3用灭菌的接种铒接种环蘸取浸泡液在干燥的培养基平板表面划线,尽量不要把平板表面划破;划过第一批线后的接种环应放在火焰上烧灼．冷却后直接在第一批划线的末端向另一方向划线;灭菌后再划第三次线;提示：划过第一批线后接种铒放在火焰上烧过这一步骤非常重要,这样做可以使第一批线和第二批线上的细菌数量相差很大;4用玻璃铅笔在培养皿上写上分离材料、日期和分离者姓名后,翻转培养皿,放在26～28c恒温箱中培养;1—3d后观察有无细菌生长,在哪些地方有单菌落生长出来其中的优势单菌落应为待分离菌形成的;5仔细挑取病原菌的单菌落,并移植到斜面培养基上;同时,再把单菌落用灭菌水稀释成悬浮液作第二次划线分离,经培养后出现的菌落在形态特征都趋于一致,并与典型描述的特征相一致时,即表明已获得纯培养;最好要经过连续三次单菌落的分离,才能确保纯化;三真菌、细菌培养性状观察1．真菌培养性状观察取已分离、纯化的某种真菌菌种,按前述稀释分离法中1--5步骤进行,待某培养皿中形成单个菌落后观察;记载以下内容：菌落颜色、菌丛密集及繁茂程度、是否有色素分泌出来而渗透到培养基中、菌落生长速度快慢等;同时要记载培养基种类成分及ph 和培养温度、光照条件;2．细菌培养性状观察1仿照上述真菌菌落形成步骤,观察记载以下内容：菌落颜色、菌落边缘形状、菌落表面是光亮还是粗糙或有皱折、菌落隆起情况、是否有色素分泌到培养基中,菌落生长速度快慢,是否有特殊气味形成等;同时要记载培养基种类成分及ph和培养温度、光照条件;2用接种铒环蘸细菌菌种后,通过无菌操作在肉膏蛋白胨等斜面培养基表面从下向上划一直线,过2～3d后长出的细菌群体称为菌苔,可仿照观察记载细菌菌落的记载内容,记载菌苔颜色、边缘形状、表面是光亮还是粗糙有皱折、隆起情况、是否有色素分泌到培养基中,是否有特殊气味生成,生长速度快慢等;也要记载培养基种类成分及ph和培养温度、光照条件;3用接种铒环蘸取细菌菌种后,通过无菌操作,将其接种在某种液体培养基中,数日后观察记载培养基中是否变混浊、是否有色素、气体、沉淀生成,培养液表面是否可生成菌膜等;也要记载培养基种类成分及ph和培养温度、光照条件;五、所需时间流程1．病原真菌分离组织分离：切取病组织,表面消毒,无菌水洗移人平板：1h;稀释分离：配孢子悬液,倒平板il培养7--10d分离菌移人斜面30min培养7--10d检查斜面上分离菌产孢30min 保存菌种2．病原细菌分离划线分离：倒平板沾菌悬液划线,1h;稀释分离3．病原真菌、细菌菌落培养性状观察平板上形成单菌落1--3d观察迦些写报告4．病原细菌菌苔培养性状观察斜面上形成菌苔i-3d观察30min写报告5．病原细菌液体培养性状观察接菌于液体培养基30min培养2--3d观察30min写报告六、实验作业l.上交分离的病原真菌、细菌菌种;2．写出病原真菌、细菌培养性状观察的实验报告;七、思考题1．如果要分离的病原真菌是鞭毛菌中的腐霉菌、疫霉菌等应当如何进行才会获得更好的效果2．在分离病原真菌时,向平板培养基中加人乳酸为什么会大大减少细菌的污染3．如果要从土壤中分离某种病原菌,应当采取什么样的分离方法会更有效4．观察记载真菌及细菌的培养性状有何意义5．怎样才能知道你获得的病原真菌、细菌的菌种是否是纯培养附1 常用的几种典型的病原菌分离方法1．斑点病原菌的分离;从病斑部分切取每边3—5mm的小块组织,在70％酒精中浸数秒钟后,移人0．1％的升汞水溶液中处理3—5rain,以灭菌水冲洗3次,移置培养皿的培养基中,然后培养;2．维管束组织内病原菌的分离;从根茎维管束组织分离病菌,可先将寄主病部表面用70％酒精擦拭消毒,将表皮组织用灭菌的解剖刀削去,然后切取其中小块变色的维管束组织,用升汞或漂白粉液消毒后,用灭菌水冲洗几次,移置培养基面上;3．根腐病病原菌的分离;根腐或基腐病的分离,由材料的大小决定;材料小的可仿照斑点病的分离法,材料大的则可以用维管束组织内病原的分离法;4．肉质组织中病原菌的分离;多肉的根、茎及果实等,可以采用维管束组织内病菌分离法除去表面组织,切取小块病组织分离;如有杂菌感染可采用“直接接种”法,待出现症状后,用此法再行分离;5．种子内病原菌分离;将整个种子或者种子的一部分进行表面消毒升汞或漂白粉,用灭菌水洗涤后,移置培养基上;6．孢子分离法;能产生大量孢子的病菌如青霉素、链格孢等,则可配制成孢子悬浮液以稀释法或划线法分离之;7．土壤带菌分离法;为了研究一些真菌在土壤中存活和分布的情形,从有病的土壤中分离它们是必要的;分离方法是将土壤取出少许,配制成悬浮液,然后用稀释法或划线法分离;。
细菌的分离培养与培养性状观察
冷至约 ５ ０ ￣ Ｃ， 用接 种 环取 一环 培 养物 于 第 一管 内 ， 随
即用两手掌心搓转振荡 ， 由第一管取入第二管 ， 搓匀 又从第二管取出一环至第三管振荡后 ，分别倒入 ３ 个 灭 菌 空平 板 内 ， 摇 匀待 凝 固后 ， 倒 置于 ３ ７ ℃温箱 内 ‘ 培养 ， ２ ４小时后观察结果 。第一个平板菌落最多 ， 第 二个 、 第三个递减 ， 可得到单个菌落 。
约５ ０克置于密封容器内与接种的厌氧菌共 同培养。 焦 性 没食 子 酸 法是 利 用 焦 性 没食 子 酸与 碱作 用
板盖使 之 成 １ 条狭 缝 ， 并靠 近火 焰 旁 。右 手持 接种 环
克， １ ０ ％氢氧化钠或氢氧化钾 １ ０ 毫升。 常用方法有试 管培 养 法 ， 干 板 培养 法 ， 干燥器 培养 法 。 二 氧 化 碳 培 养 法 利 用 少 数 细 菌 如 牛 型 布 氏 杆
菌 ，在含 有 ５ ％～ １ ０ ％的二 氧化碳 环境 下生 长 良好 ， 常 用 的方 法 为 烛缸 法 。取 干燥 器 （ 盖 口抹 上 凡上 林 ） ， 将 接种 好 的平板 或 斜 面放 入 器 内 ，点 燃 燃烛 直 立 于 缸 的隔 板 上 ， 盖上盖子 ， 因器 内氧 气 耗 尽 蜡 烛 自灭 ，
１ ～ ２ 毫米者为小菌落 ； ２ ～ ４ 毫米者为 中等大菌落 ； ４ 毫 米或 更 大者 为大 菌 落或 巨大 菌落 。菌落外 形 有 圆形 、 不 规则 形 、 卷毛状 、 根 状 等 。隆 起 度呈 扩 散 、 台状 、 凸
起、 乳头 状 、 突脐 状 、 覆轮 状 等 。边缘 如整 齐 、 缺刻 状 、 圆锯齿 形 、 波 状 裂 片状 、 镀 边 等 。观察 菌 落 表 面是 否 光滑 、 皱褶 、 颗 粒状 、 同心环 状 、 龟 裂状 等 。表 面光 泽
实验四 细菌、真菌、放线菌的分离与培养
实验报告课程名称：环境微生物学实验实验类型：综合实验实验项目名称：微生物的分离与培养与菌落观察学生姓名：专业：环境工程学号：同组学生姓名：指导老师：实验地点：实验日期：2018 年 10月16日一、实验目的和要求1.掌握微生物接种培养技术2.掌握微生物分离纯化技术3.学习并掌握放菌落形态结构的观察方法，认识并理解它们的形态特征。
二、实验内容和原理土壤是微生物生活的大本营，是寻找和发现具有重要价值微生物的主要菌源。
在不同土壤中，各类微生物的数量千差万别。
为了分离获得某种微生物,需要预先制备不同稀释度的菌悬液，并添加相应的抗生素抑制不需要的微生物，例如，添加链霉素25~50U/mL抑制细菌;添加0.5%重铬酸钾液或制霉素50 U/mL 抑制霉菌。
通过10倍稀释以及平板分离、平板涂布和平板划线等操作，微生物可在平板上分散成单个的个体，经过适宜条件培养，单个个体可形成单个菌落。
挑取单个菌落转接至新鲜平板上，即可使目的菌种纯化。
1.菌种的分离纯化：从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。
在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“单一性”，防止其他微生物的混入。
2.平板涂布法：因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。
用途上，一般多用于从菌种的纯化;优点是可以观察菌落特征，对混合菌进行分离;但不能计数3.平板划线法：最简单的分离微生物的方法是平板划线法，其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。
划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。
用途一般多用于筛选菌株。
病原物的分离与培养
病原物的分离与培养病原物的分离与培养在植物病害的研究中具有重要意义，分离、培养病原菌的方法是植物病理学研究工作中最常应用的实验技术。
一方面，在一个新的病害研究中，通过分离与培养获得病原物的纯培养，完成柯氏法则，以明确该病病原；研究病原物的生物学特性和病害循环（侵染、病程等等）。
所谓病原物的分离，即把该病原菌从发病组织上与其他微生物分开；所谓病原物的培养，即将分离的病原菌移到可以让这种病原菌正常生长的营养基质即培养基上，从而获得其纯培养。
病原物的分离与培养，需经以以几个步骤:1.有关器皿的灭菌和消毒；2.制作培养基；3.病原菌的分离4.病原菌的培养。
－、灭菌与消毒灭菌与消毒是两个不同的概念。
灭菌则是指杀死一切微生物的营养体和孢子。
消毒一般是指消灭病原菌和有害微生物的营养体，在植物病理学实验中，需要进行纯培养，不能有任何杂菌污染，因此对所用器材、培养基和工作场所都要进行严格的消毒和灭菌。
消毒与灭菌的方法很多，一般可分为加热、过滤、辐射和使用化学药品等方法。
(一) 热力灭菌热力灭菌分干热灭菌和湿热灭菌两类。
1．干热灭菌干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。
细胞内的蛋白质疑固性与其本身的含水量有关。
在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越小，凝固越慢。
因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高(160～170℃)，时间长1～2 h。
但干热灭菌温度不能超过180 ℃，否则包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。
干热灭菌使用的仪器是烘箱。
干热灭菌有火焰烧灼灭菌和热空气灭菌两种。
火焰烧灼灭菌适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，无菌操作时酌试管口和瓶口也在火焰上作短暂烧灼灭菌。
涂布平板用的三角玻棒也可在蘸有乙醇后进行灼烧灭菌。
通常所说的干热灭菌是在烘箱内利用高温干燥空气(160～170℃)进行灭菌。
此法适用于玻璃器皿如吸管和培养皿等的灭菌。
进行干热灭菌要注意以下问题：物品不要摆得太挤，以免妨碍空气流通；灭菌物品不要接触烘箱内壁的铁板，以防包装纸烤焦起火；在升温过程中，如果红灯熄灭，绿灯亮，表示箱内停止加温；电烘箱内温度未降到70℃以前，切勿自行打开箱门以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂。
微生物实验中的接种分离和培养操作步骤
微生物实验中的接种、分离和培养操作步骤微生物实验中的接种、分离和培养操作步骤一、目的要求1、掌握各种分离、接种方法。
2、掌握无菌操作基本环节。
二、实验说明微生物在自然界中呈混杂状态存在，要获得所需菌种，必需从中把它们分离出来。
在保存菌种时不慎受到到污染也需予以分纯。
微生物分离和纯化的方法很多，但基本原理却是相似的，即将待分离的样品进行一定的稀释，并使微生物的细胞（或孢子）尽量以分散状态存在，然后使其长成一个个纯种单菌落。
然而上述工作又离不开接种，即将一种微生物移到另一灭过菌的培养基上的过程。
三、实验材料1、恒温培养箱。
2、接种环、玻璃棒、吸管、酒精灯。
3、培养基（上次实验配制的）。
4、大肠杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌。
四、方法步骤（一）接种的操作1、斜面接种（接金黄葡萄球菌）（1）操作前，先用75%酒精擦手，待酒精挥发后点燃酒精灯。
（2）将菌种管和斜面握在左手大姆指和其它四指之间，使斜面和有菌种的一面向上，并处于水平位置。
（3）先将菌种和斜面的棉塞旋转一下，以便接种时便于拔出。
（4）左手拿接种环（如握钢笔一样），以火焰上先将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管其余部位也过火灭菌。
（5）用右手的无名指、小指和手掌将菌种管和待接斜面试管的棉花塞或试管帽同时拔出，然后让试管口缓缓过火灭菌（切勿烧过烫）。
（6）将灼烧过的接种环伸入菌种管内，接种环在试管内壁或未长菌苔的培养基上接触一下，让其充分冷却，然后轻轻刮取少许菌苔，再从菌种管内抽出接种环。
（7）迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管。
从斜面底部向上作“Z”形来回密集划线。
有时也可用接种针仅在培养基的中央拉一条线来作斜面接种，以便观察菌种的生长特点。
（7）迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管。
从斜面底部向上作“Z”形来回密集划线。
有时也可用接种针仅在培养基的中央拉一条线来作斜面接种，以便观察菌种的生长特点。
（8）接种完毕后抽出接种环灼烧管口，塞上棉塞。
环境微生物学-实验四(五) 细菌的纯培养、分离
实验四（五）环境中微生物分离与培养一、实验目的1、掌握从环境（土壤、水体、活性污泥、垃圾堆肥等）中分离培养细菌的方法，获得若干种细菌纯种培养技能。
2、掌握几种接种技术。
3、了解菌种的保藏方法。
二、实验仪器和材料恒温箱、涂布器、细铁丝、接种环、酒精灯、吸耳球、棉花、记号笔；无菌培养皿（直径90毫米）、无菌移液管（1毫升和10毫升）；肉汤蛋白胨培养基、高氏１号培养基、马铃薯培养基；活性污泥或土壤10克、无菌水90毫升、9毫升无菌水（试管中）；酵母、大肠杆菌。
三、细菌纯种分离的操作方法细菌纯种分离的方法有两种：稀释平板法和平板划线法。
（一）稀释平板分离的方法1、取样用无菌锥形瓶到现场取一定数量的活性污泥或土壤，迅速带回实验室。
2、稀释水样将1瓶90毫升和5管9毫升的无菌水排列好，按10-1、10-2、10-3、10- 4、10-5、10-6依次编号。
在无菌操作条件下，将样品（10克）置于第一瓶90毫升无菌水中，用手摇10分钟，将颗粒状样品打散，即为10-1浓度的菌液。
用1毫升无菌移液管吸取1毫升10-1浓度的菌液于一管9毫微升无菌水中，同样方法，依次稀释到10-6。
每次稀释时，需用不同的无菌移液管，或将同一移液管用无菌水洗三次。
3、平板的制作取10套无菌培养皿编号，10-4、10-5、10-6各3个，另1个为空气对照。
取1支1毫升无菌移液管从浓度小的10-6菌液开始，以10-6、10-5、10-4为序分别吸取0.5毫升菌液于相应编号的培养皿内（注：每次吸取前，用移液管在菌液中吹泡使菌液充分混匀），加热熔化培养基，当培养基冷至45℃左右时，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拿培养皿，以中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖，靠近火焰，将皿盖掀开，倒入培养基后将培养皿平放在桌上，顺时针和逆时针来回转动培养皿，使培养基和菌液充分混匀，冷凝后即成平板，倒置于30℃恒温箱中培养48小时，然后观察结果。
取对照无菌培养皿，打开皿盖10分钟后盖上皿盖，倒置30℃恒温箱中培养48小时后，观察结果。
兽医微生物实验指导
兽医微生物实验教案实验一显微镜油浸系的使用及细菌基本形态构造的观察【目的要求】1.掌握正确使用及护理显微镜的方法，特别是油浸系的使用及护理。
2.正确认识细菌的基本形态和构造。
【油浸系的原理】油浸系是在油浸镜与标本之间加1滴香柏油，调整光源检查细菌标本的方法。
油浸镜是一种高倍放大的物镜，一般都刻有放大倍数，如95×、100×等。
其镜头标记国产镜多用“油”字表示，国外产品则用“Oil”(Oil Immersion)或HI(homogenmus Immersion)表示。
而且油镜的镜身较高倍镜和低倍镜为长，镜片最小，这也是识别的另一种标志。
其使用原理是由于香柏油与玻璃的折光率相似(香柏油为1.515，玻璃为1.52)。
镜检时，滴加香柏油的作用是使光源尽可能多的进入物镜中，避免光线通过折光率低的空气(折光率为1.O)而散失，因而能提高物镜的分辨率，使物像明亮清晰。
【器材及试剂】1.菌种：大肠杆菌、葡萄球菌、链球菌、炭疽杆菌、细菌的三型等标本片；2.仪器：普通光学显微镜；3.材料：香柏油，二甲苯，擦镜纸等。
【操作步骤】(一)细菌基本形态构造的观察1.准备安置显微镜?调节光源?调节双筒目镜间距?调节聚光器数值孔径值。
将光圈完全开放，升高聚光镜与载物台同高，置标本片于载物台上，在低倍镜下对光，用于转动反光镜以调节之，至视野最亮时为止。
若用天然光源宜用反光镜平面，较弱光源用凹面。
检查未染色标本，光不宜太强，染色标本需强光。
光线强弱可通过放大或缩小光圈、升降聚光镜、旋转反光镜调节之。
2.观察将香柏油一滴滴于标本片有颜色的观察区，并置于载物台上，用片夹固定好，用推进器将观察区置于物镜正下方，依次用高倍镜?油镜观察。
用油浸镜检查，使油镜头浸入油滴中，几乎与标本面接触为度。
然后由接目镜注视镜内，同时慢慢转动粗调节螺旋提起镜筒(绝对不能下降镜筒)至能模糊看到物像时，再转动细螺旋(细螺旋转动一般不超过1周)，直至物像清晰为止。
细菌划线分离与纯培养
第三区划线
灭菌接种环
实验 三
实验四
小结
连续划线法
斜面接种法及接种后菌 落生长示意图
实验 三
实验四
小结
细菌培养法
一般培养（需氧培养）：
★培养温度：37℃（采用恒温培 养箱）
★培养时间：18～24h
实验 三
实验四
小结
实验结果观察记录
细菌生长情况的观察
观察琼脂平板表面生长的各种 菌落，注意其大小、形 状、边 缘、表面结构、透明度、颜色 等性状。
”
实验 三
实验四
小结
“6 平板划线分离培养法 1、划线分离的培养基必须事先倒 好，需充分冷却待平板稍干后才可 使用。 2、为便于划线，一般培养基不宜 太薄，每一个平皿倾倒约20ml培养 基，培养基应厚薄均匀，平板表面 应光滑。 ” 3、划线分离主要有连续划线和分 区划线两种。
实验 三
实验四
小结
“6 平板划线分离培养法 分区划线法：适用于含菌量较多的 标本 连续划线法：适用于含菌量较少的 标本 穿刺接种法 :用于观察细菌动力 倾注培养法:用于细菌计数 液体培养基接种法 斜面接种法
实验 三
实验四
小结
“5 兼性厌氧性细菌分离培养法 细菌培养中，有少数细菌（如牛型 布氏杆菌）在含有5%--10%二氧化 碳的环境下才能生长。
”
实验 三
实验四
小结
“6 平板划线分离培养法 菌种被其他杂菌污染时或混合菌悬 液常用平板划线法进行纯种分离。 此方法是借助将蘸有混合菌悬液的 接种环在平板表面多方向连续划线， 使混杂的微生物在平板表面分散， 经培养得到分散的由单个微生物繁 殖而成的菌落，从而达到纯化目的。
”
实验 三
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实验四细菌的分离培养及培养性状的观察
在细菌学检验中，细菌的分离培养是重要的基本技术之一。
从混杂微生物中获得单一菌株纯培养的方法称为分离；纯培养是指一株菌种或一个培养物中所有的细菌都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代。
分离培养的目的在于从被检材料中，或者从污
1
2
连续划线，使混杂的微生物细胞在平板表面分散，经培养得到分散的由单个微生物细胞繁殖而成的菌落，从而达到纯化目的。
但划线分离的培养基必须事先倾倒好，需充分冷凝待平板稍干后才可使用；为便于划线，一般培养基不宜太薄，每皿约倾倒20ml培
养基，培养基应厚薄均匀，平板表面光滑。
划线分离主要有连续划线法（图4-1）和分区划线法（图4-2）两种。
划线法示意图见
图4-3。
（1）连续划线法
将菌
取出接
养后在划线平板上观察沿划线处长出的菌落形态，涂片镜检为纯
种后再接种斜面。
(2)分区划线法（四分区划线法）
取菌、接种、培养方法与“连续划线法”相似。
分区划线法
划线分离时平板分4个区，故又称四分区划线法。
其中第4区是单菌落的主要分布区，故其划线面积应最大。
为防止第4区内划线与1、2、3区线条相接触，应使4区线条与1区线条相平行，这样区与区间线条夹角最好保持120度左右。
先将接种环蘸取少量菌在平板上1区划3-5条平行线，取出接种环，左手关上皿盖，
2次平
.
至约
分摇匀后，自第一管取一接种环内容物至第二管，以同样方法自第二管移种至第三管。
然后分别倾注一个已灭菌的平皿，凝固后倒转置于37℃温箱内培养24h。
结果多数细菌在琼脂内生长成菌落，仅少数菌落出现在表面，通常第一个平板内的菌落数较多而
密集，第二、三个平板则逐渐减少，可见单个菌落。
3.芽胞需氧菌分离培养法
如果被检材料中可疑有带芽孢的细菌，可先将被检材料加少量生理盐水或肉汤，置于80℃水浴箱中维持15～20分钟，或85℃加热10分钟，再进行培养。
材料中若有带芽孢的细菌仍可存活而
而对
放入灭菌乳钵或组织匀浆器内，加3～5倍量无菌生理盐水制成混悬液，吸取一定量混悬液注射（肌肉、腹腔、皮下或静脉）入易感实验动物,待实验动物死后，取其脏器，常可分离到纯的病原菌。
例如，疑有猪丹毒杆菌存在的病料，可注射于鸽体，鸽死后，再
取其脾脏以分离猪丹毒杆菌，可得到纯培养。
6.琼脂斜面分离法
取琼脂斜面3管，用接种环蘸取欲检病料少许（如为脏器，先将表面烧烙后，用灭菌解剖刀切开，以灭菌接种环由切口插入、转动、钓取组织），混合于第1管的凝集水中，再作斜面划线；然
2管的
1～2
斜面或平板分离法可能无菌落长出，这时可以无菌操作剪取一小块病料直接投入肉汤，经37℃培养，在肉汤中长出细菌后，再用
琼脂斜面或琼脂平板分离。
二、厌氧性细菌分离培养法
细菌接种后，直接放在恒温箱内培养，可以使需氧菌与兼性厌氧菌生长繁殖；但对厌氧菌，则需将培养环
境或培养基中的氧气除去，或将氧化型物质还原，降低其氧化还原电势，才能生长繁殖。
在有氧的环境下，培养基的氧化还原电势较高，不适于厌氧菌的生长。
为使培养基降低电势，降低培养环境的氧分压是十分必要的。
现有的厌氧培养法很多，主要有生物学法、化学法和物理学法，可根据各实验室的具体情况而选用。
（一）生物学方法
培养基中含有植物组织（马铃薯、燕麦、发芽谷物等）或动物组织（新鲜动物组织小片，或加热的肌肉、心脑等），因组织的
氧菌如灵杆菌、大肠杆菌、枯草杆菌等。
另一半接种厌氧菌，接种后将平皿倒扣在一块玻璃板上，并用石蜡密封，置37℃恒温箱中培养2～3d，即可观察到需氧菌和厌氧菌均先后生长。
（二）化学方法
利用还原能力强的化学物质，将环境或培养基内的氧气消耗，
或还原氧化型物质，降低氧化-还原电势。
1.焦性没食子酸法焦性没食子酸在碱性溶液内能大量地吸收氧而造成厌氧环境，有利于厌氧菌的生长繁殖。
通常100cm 3空间用焦性没食子酸1g 及10％氢氧化钠或氢氧化钾10m1。
具体方法
有下列几种：
取一℃恒温
（图
，立即
将试管口用橡皮塞塞紧，必要时周围用石蜡密封。
37℃培养24～
48h 后观察。
（3）瑞氏厌氧培养法（图4-5）将已接种细菌的培养管的脱脂棉棉塞在火焰中灼烧灭菌后，塞入管中离培养基1～1.5cm 处，
图
置适量焦性没食子酸于其上，加入10%NaOH 溶液2ml ，迅速用橡皮塞将管口塞紧，以胶泥或石蜡严密封闭置温箱中培养。
（4）史氏厌氧培养法用图4-6所示的厌氧培养皿，在皿底一边置焦性没食子酸，另一边置NaOH 溶液，将已接种的平皿翻盖于皿上，并将接合处用胶泥或石蜡密封，然后摇动底部，使氢氧化
2.李伏夫（）氏法此法是利用连二亚硫酸钠
（Sodiumhyerosulphite ）和碳酸钠以吸收空气中的氧气,释放二
氧化碳造成厌氧环境。
其反应式如下：
Na 2S 2O 4+Na 2CO 3+O 2→Na 2SO 4+Na 2SO 3+CO 2
图
取一有盖的玻璃罐，罐底垫一薄层棉花，将接种好的平皿重叠正放于罐内（如是液体培养基，则直立于罐内），最上端保留可容纳1～2个平皿的空间（视玻罐的体积而定），按玻罐的体积每1000cm 3
空间用连二亚硫酸钠及碳酸钠各30g ，在纸上混匀后，盛于上面的空平皿中，加水少许使混合物潮湿，但不可过湿，以免所
～48h
固体
培养
基倾
入皿
内。
待
图4-8李伏夫氏厌氧培养法图4-9Brewer 氏培养
琼脂冷凝后，将厌氧菌接种于培养基的中央部分。
盖上皿盖，使皿盖内缘与培养基外围部分相互紧密接触（图4-9）。
此时皿盖与培养基中央部分留在空隙间的氧气被硫乙醇酸钠还原，美兰指示剂逐渐褪色，而外缘部分，因与大气相通，仍呈蓝色。
将Brewer 氏培养皿于37℃恒温箱内24～48h后观察。
，驱
37℃培
养24～48h后观察。
4.高层琼脂柱法加热融化一管适合分离厌氧菌用的琼脂培养基，待冷至50℃左右，接入少许经适当稀释的待分离的培养物或含菌材料，充分摇震均匀。
在琼脂凝固前，迅速以无菌滴管吸取
上述已接种的琼脂培养基，注入准备好的玻璃管内（长约15cm ，一端塞小胶塞或小木塞，另一端塞棉花塞，高压灭菌备用），装至4／5左右之处，塞好棉花塞，放在大试管或玻璃筒内，置37℃恒温箱中培养。
长出菌落后，拔去胶塞和棉花塞，以无菌玻棒将琼脂柱推出于无菌平皿中，再用灭菌接种环钓取独立菌落作厌氧纯
)
5～10 1.接种环移植法两试管斜面移植时，左手斜持菌种管和新鲜空白琼脂斜
面各一管，使管口互相并齐，稍上斜，
管底握于手中，松动两管棉塞，以便接
种时容易拔出（图4-11）。
右手食指和拇
图4-11斜面接种
时试管的拿法
指执接种环，烧灼接种环，以右手小指扭开一管的棉塞，无名指扭开第二管的棉塞。
棉塞头向掌心内，将试管口通过酒精灯火焰灭菌，待冷却后将接种环插入菌种管中，钓取细菌少许取出接种环立即接种在新鲜空白琼脂斜面上，不要碰及管壁，直达斜面底部。
从斜面底部开始划曲线或直线，向上至斜面顶端为止，管口
37℃温
可以
其操
的是用接种针挑取菌落，垂直刺入培养基中。
要从培养基表面的中部一直刺入管底，然后按原方向退出即可。
六、细菌培养性状的检查
（一）细菌在固体培养基上的生长表现
1.琼脂平皿上的生长表现细菌于固体培养基表面生长繁殖，形成单个肉眼可见的细菌集落群体，称为菌落。
各种细菌的菌落，按其特征的不同，可以在一定程度上鉴别某种细菌。
如葡萄球菌在琼脂平皿上，由于产生色素的不同，形成各种颜色的圆形而突起的菌落；炭疽杆菌形成扁平干燥，边缘不整齐的火焰状菌落，
4-13，
1．4．圆形、
（1）大小菌落的大小，规定用毫米（mm）表示，一般不足lmm者为露滴状菌落；1～2mm者为小菌落；2～4mm者为中等大菌落；4～6mm或更大者称为大菌落或巨大菌落。
（2）形状菌落的外形有圆形、不规则形、根足形、葡萄叶形。
（3）边缘菌落边缘有整齐、锯齿状、网状、树叶状、虫蚀状、
放射状等。
（4）表面性状观察其是否平滑、粗糙、皱襞状、旋涡状、荷
包蛋状，甚至有子菌落等。
（5）隆起度表面有隆起、轻度隆起、中央隆起，也有陷凹或
堤状者。
取大肠杆菌、枯草杆菌和其他细菌分别以接种针穿刺接种于明胶柱，置22℃温箱中培养后观察其液化与否和液化的情况，不同细菌对明胶柱的液化作用各不相同，其形式如图4-17所示。
（三）细菌在液体培养基中的生长表现（如图4-18所示）将马腺疫链球菌、绿脓杆菌、葡萄球菌、大肠杆菌、炭疽杆菌等分别接种于肉汤中，培养后观察其生长情况，主要观察其混浊度、沉淀物、菌膜、菌环和颜色等。
1.混浊度细菌接种在液体培养基中经适当培养后其表现性状
,。