分子发光分析
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(3) 自熄灭/自吸收
低浓度！
自熄：浓度高时，激发态之间相互碰撞
自吸：荧光曲线与吸收曲线重叠时，被基态分子吸收
2.1.4 定量关系
A lg( I0 I ) I I0 •10 A
I f f Ia f (I0 I ) f I0 (110A )
泰勒级数展开 ex 1 x x2 x3 ... 1 x
2! 3!
I A lg(I0 I ) f
2.30 f I0 A 2.30 f I0kbc Kc
I f Kc 常A<0.05
If
If与A 的关系 A与c正比，低浓度
0
0
0.1
A
0.2
0.3
2.1.5 激发光谱与发射光谱 ➢ 变入射光波长，本荧质光：最吸强收处光测谱If ➢ 固定激发光，本测I质f～：t 关荧系光发射光谱
15:53:04
2.1.1 产生 去吸 驰活收豫化演示
e
e
e
e
15:53:04
2.1.1 产生 去内 荧活部光化转演换示
e
e
e
15:53:04
2.1.1 产生：过程
吸收激发
内振 部动 转驰 换豫
S1最低
辐荧 射光
S0各振动能级
荧光的产生
e e
e e
2.1.2 荧光效率
➢ 辐射跃迁概率的大小：
try
3
2
1
0
2.1.1 产生 去活化
不论开始处于哪个激发S态 最后到达S1最低振动能级
(3) 内部转换 internal conversion
相同多重态间的无辐射跃迁(S1与S2振动能级有重叠时) 10-13-10-11s
(4) 体系间跨越 intersystem corssing
不同多重态间的无辐射跃迁: S1→ T1 10-2-10-6s，自旋反转
2.1.3 影响因素
➢猝灭效应
(1) 碰撞猝灭及能量转移：主要/外部转换热效应
溶剂或溶质分子间发生物理或化学作用导致荧光强度下降。
与熄灭剂碰撞：M* +Q →M+Q+热 激发熄灭剂： A lg(I0 I) M* +Q →M+Q*
粘度大 ↓ 温度高 ↑
(2) 氧熄灭：
顺磁性氧分子，促系间跨跃成三重态
φf＝发荧光的分子数/激发态分子总数
f
kf
kf
ki
➢提高kf，降低ki 都可增强荧光 ➢分析应用价值φf>0.1；荧光素的φf～1
15:53:04
2.1.3 影响因素
➢ 分子结构
首要条件有吸收，含共轭双键，通常>1个苯环
有利因素 增大共轭 奈φf=0.29， λf=310nm
增大共蒽轭φf=0.46， λf=400nm 刚性结构 刚性平面结构 芴φf＝1.0； 联二苯φf＝0.2 给电子基团 减少振动和碰撞去活；鳌合物荧光的原理 ，见p138
2.1 荧光Fluorescence
2.1.1 产生
激发态
分子的电子能态：基态→激发态 则: 能力增加/分子的多重性可能改变
多重度M=2S+1
泡利不相容原理
S为自旋量子数的代数和 含偶数电子的分子, 电子成对，S=1 2 1 2 0
15:53:0单4 重态singlet state: 在磁场中无能级分裂
改 变
自
➢ Mg的基态与第一激发态
旋
//
3p
1
1
3s 2
2
基态
1 2
1
1
2
2
1st激发态
1禁 2阻
磷 光
2S+1=1 2S+1=1 2S+1=3
L= 内量031子(S用0数SJ表有示2)S+1个311取P(1用值P表3示3P)2 33P1 133P0
J= (L+0S),(光L+S谱-1),…项,(|L-nS2|S)11LJ
15:53:04
2.1.7 实验技术与应用
② 同步扫描技术
➢ 固定波长差，简化荧光光谱，提高选择性。
➢丁省酪－氨普酸通和荧色光氨酸：荧光光谱严丁重省重－同叠步荧光 Δλ<15nm, 仅显示酪氨酸光谱
Δλ激>发60nm,
则显示色氨酸光谱
发射
15:53:04
k /(103 mg-1 L)
5
4
phe
tyr
15:53:04
2.1.1 产生 去活化
室
(5) 磷光发射
温
无 T1最低振动能级→ S0时产生磷光辐射 磷
10-2-10s，寿命长多了！能量更低！
光
(6) 外部转换 external conversion
激发态分子和溶剂等能量转换 荧光/磷光 消失，称熄灭或猝灭
15:53:04
2.1.1 产生 去活化示意图
2, 1, 0
2.1.1 产生 去活化
(1) 振动驰豫 vibrational relaxation
跃迁: 10-15s <分子振动周期 10-14-10-12s内，振动失活到激发态最低振动能级
(2) 荧光发射
S1→ S0 : 10-9-10-7s，发射一个光量子 能力小于吸收，驰豫损失部分
15:53:04
2.1.1 产生 激发态
单重态基态S0
单重态基态S0
辐吸 射收
通常自旋不变 激发态S1/ S2
激发后 S/T两态
S泡=利1 不2相 容1 原2理1
辐吸 射收
自旋改变 激发态T1/T2
规 则
Hund
M=2S+1 3 平行自旋
三重态triplet state
能量更低
15:53:04
单线态与三线态
n2S 1LJ
提高激发光强度，现代技术测弱光信号
15:53:04
2.1.6 荧光仪
➢ 试样来自百度文库：
四 面
光
四面光石英池
比 色
皿
固体试样架
➢ 色散系统：光栅
第一单色器选激发光波长
第二单色器选荧光波长
15:53:04
2.1.7 实验技术与应用 Th 0.01μg
① 时间分辨技术, 各发光体的发光衰减速率不同
➢ 光谱重叠，发光寿命不同的组分可分辨与测定。 ➢ 对门控时间扫描，测If～t，测定荧光寿命。 ➢ 根据不同发光体形成速率，消除干扰。
给/吸电子基增/减荧光，卤素重原子效应大减 p138表9-2
➢ 环境因素
溶剂：激发态比基态极性大，溶剂极性增，则荧光红移并增强
奎宁在苯:乙醇:水＝1:30:1000
温度：影响非常大。
辐射跃迁与T几乎无关，非辐射随T显著增大。 磷光影响更大。
pH： 本身为弱酸碱物质时影响大 p140 其他：表面活性剂增强，溶解氧(增大系间跨跃)降低
➢ 用于选择条件，可组成两维光谱
2.1.6 荧光仪
光源
放大
与
单色器1
记录
样品池
单色器2
15:53:04
垂直方向
检测器
2.1.6 荧光仪
➢ 与分光光度计的主要差别
① 垂直测量方式, 消除透射光影响 ② 两个单色器，激发和发射，常用光栅
➢ 光源：高发射强度。常用氙灯。
高灵敏度原因：测量I非A， 确定量子效率
低浓度！
自熄：浓度高时，激发态之间相互碰撞
自吸：荧光曲线与吸收曲线重叠时，被基态分子吸收
2.1.4 定量关系
A lg( I0 I ) I I0 •10 A
I f f Ia f (I0 I ) f I0 (110A )
泰勒级数展开 ex 1 x x2 x3 ... 1 x
2! 3!
I A lg(I0 I ) f
2.30 f I0 A 2.30 f I0kbc Kc
I f Kc 常A<0.05
If
If与A 的关系 A与c正比，低浓度
0
0
0.1
A
0.2
0.3
2.1.5 激发光谱与发射光谱 ➢ 变入射光波长，本荧质光：最吸强收处光测谱If ➢ 固定激发光，本测I质f～：t 关荧系光发射光谱
15:53:04
2.1.1 产生 去吸 驰活收豫化演示
e
e
e
e
15:53:04
2.1.1 产生 去内 荧活部光化转演换示
e
e
e
15:53:04
2.1.1 产生：过程
吸收激发
内振 部动 转驰 换豫
S1最低
辐荧 射光
S0各振动能级
荧光的产生
e e
e e
2.1.2 荧光效率
➢ 辐射跃迁概率的大小：
try
3
2
1
0
2.1.1 产生 去活化
不论开始处于哪个激发S态 最后到达S1最低振动能级
(3) 内部转换 internal conversion
相同多重态间的无辐射跃迁(S1与S2振动能级有重叠时) 10-13-10-11s
(4) 体系间跨越 intersystem corssing
不同多重态间的无辐射跃迁: S1→ T1 10-2-10-6s，自旋反转
2.1.3 影响因素
➢猝灭效应
(1) 碰撞猝灭及能量转移：主要/外部转换热效应
溶剂或溶质分子间发生物理或化学作用导致荧光强度下降。
与熄灭剂碰撞：M* +Q →M+Q+热 激发熄灭剂： A lg(I0 I) M* +Q →M+Q*
粘度大 ↓ 温度高 ↑
(2) 氧熄灭：
顺磁性氧分子，促系间跨跃成三重态
φf＝发荧光的分子数/激发态分子总数
f
kf
kf
ki
➢提高kf，降低ki 都可增强荧光 ➢分析应用价值φf>0.1；荧光素的φf～1
15:53:04
2.1.3 影响因素
➢ 分子结构
首要条件有吸收，含共轭双键，通常>1个苯环
有利因素 增大共轭 奈φf=0.29， λf=310nm
增大共蒽轭φf=0.46， λf=400nm 刚性结构 刚性平面结构 芴φf＝1.0； 联二苯φf＝0.2 给电子基团 减少振动和碰撞去活；鳌合物荧光的原理 ，见p138
2.1 荧光Fluorescence
2.1.1 产生
激发态
分子的电子能态：基态→激发态 则: 能力增加/分子的多重性可能改变
多重度M=2S+1
泡利不相容原理
S为自旋量子数的代数和 含偶数电子的分子, 电子成对，S=1 2 1 2 0
15:53:0单4 重态singlet state: 在磁场中无能级分裂
改 变
自
➢ Mg的基态与第一激发态
旋
//
3p
1
1
3s 2
2
基态
1 2
1
1
2
2
1st激发态
1禁 2阻
磷 光
2S+1=1 2S+1=1 2S+1=3
L= 内量031子(S用0数SJ表有示2)S+1个311取P(1用值P表3示3P)2 33P1 133P0
J= (L+0S),(光L+S谱-1),…项,(|L-nS2|S)11LJ
15:53:04
2.1.7 实验技术与应用
② 同步扫描技术
➢ 固定波长差，简化荧光光谱，提高选择性。
➢丁省酪－氨普酸通和荧色光氨酸：荧光光谱严丁重省重－同叠步荧光 Δλ<15nm, 仅显示酪氨酸光谱
Δλ激>发60nm,
则显示色氨酸光谱
发射
15:53:04
k /(103 mg-1 L)
5
4
phe
tyr
15:53:04
2.1.1 产生 去活化
室
(5) 磷光发射
温
无 T1最低振动能级→ S0时产生磷光辐射 磷
10-2-10s，寿命长多了！能量更低！
光
(6) 外部转换 external conversion
激发态分子和溶剂等能量转换 荧光/磷光 消失，称熄灭或猝灭
15:53:04
2.1.1 产生 去活化示意图
2, 1, 0
2.1.1 产生 去活化
(1) 振动驰豫 vibrational relaxation
跃迁: 10-15s <分子振动周期 10-14-10-12s内，振动失活到激发态最低振动能级
(2) 荧光发射
S1→ S0 : 10-9-10-7s，发射一个光量子 能力小于吸收，驰豫损失部分
15:53:04
2.1.1 产生 激发态
单重态基态S0
单重态基态S0
辐吸 射收
通常自旋不变 激发态S1/ S2
激发后 S/T两态
S泡=利1 不2相 容1 原2理1
辐吸 射收
自旋改变 激发态T1/T2
规 则
Hund
M=2S+1 3 平行自旋
三重态triplet state
能量更低
15:53:04
单线态与三线态
n2S 1LJ
提高激发光强度，现代技术测弱光信号
15:53:04
2.1.6 荧光仪
➢ 试样来自百度文库：
四 面
光
四面光石英池
比 色
皿
固体试样架
➢ 色散系统：光栅
第一单色器选激发光波长
第二单色器选荧光波长
15:53:04
2.1.7 实验技术与应用 Th 0.01μg
① 时间分辨技术, 各发光体的发光衰减速率不同
➢ 光谱重叠，发光寿命不同的组分可分辨与测定。 ➢ 对门控时间扫描，测If～t，测定荧光寿命。 ➢ 根据不同发光体形成速率，消除干扰。
给/吸电子基增/减荧光，卤素重原子效应大减 p138表9-2
➢ 环境因素
溶剂：激发态比基态极性大，溶剂极性增，则荧光红移并增强
奎宁在苯:乙醇:水＝1:30:1000
温度：影响非常大。
辐射跃迁与T几乎无关，非辐射随T显著增大。 磷光影响更大。
pH： 本身为弱酸碱物质时影响大 p140 其他：表面活性剂增强，溶解氧(增大系间跨跃)降低
➢ 用于选择条件，可组成两维光谱
2.1.6 荧光仪
光源
放大
与
单色器1
记录
样品池
单色器2
15:53:04
垂直方向
检测器
2.1.6 荧光仪
➢ 与分光光度计的主要差别
① 垂直测量方式, 消除透射光影响 ② 两个单色器，激发和发射，常用光栅
➢ 光源：高发射强度。常用氙灯。
高灵敏度原因：测量I非A， 确定量子效率