用多聚赖氨酸作载体制备IVM人工抗原的研究

兽医科技

收稿日期:2008-12-21;修回日期:2008-10-31

基金项目:中国农科院兰州畜牧与兽药研究所基金项目(MY JJ05-3)

作者简介:魏小娟(1976-),女,助理研究员,硕士.

用多聚赖氨酸作载体制备I VM 人工抗原的研究

魏小娟,张继瑜,张 梅,李剑勇,周绪正,李金善,牛建荣

(中国农业科学研究院兰州畜牧与兽药研究所中国农业科学院新兽药重点开放实验室,甘肃兰州730050)中图分类号:S852.4+

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文献标识码:B 文章编号:1004-7034(2009)01-0065-02

关键词:伊维菌素;人工抗原;多聚-L-赖氨酸

摘 要:采用N -羟基琥珀酰亚胺活性酯法和混合酸酐法,将伊维菌素(I V M )分别与多聚-L-赖氨酸(PLL)和卵清蛋白(OVA )连接制备人工免疫原5-O -(单)琥珀酰I V M -PLL 和包被原5-O -(单)琥珀酰I VM -OVA,经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析证实人工抗原合成成功。 伊维菌素(Lver m ecti n ,I V M )是大环内酯类杀虫、杀螨剂,由于其具有杀菌活性强以及杀菌谱广等特点已被广泛地应用于畜禽及水产养殖业,也是农业生产上广泛使用的一种杀虫剂。但此类药物在动物性产品中的残留严重影响到我国农产品的国际竞争力,同时也对人及环境存在潜在的威胁。

随着人们对I VM 残留的毒性及环境风险的日益关注,迫切需要简单、快速、高效的I V M 残留检测方法,但目前常用的H PLC 法检测的灵敏度较低,无法满足农产品中I V M 及其有毒代谢物的残留分析要求。为此,笔者根据I V M 的结构特点,采用N -羟基琥珀酰亚胺活性酯法和混合酸酐法将伊维菌素与载体蛋白偶联,成功地制备了伊维菌素完全抗原,为畜禽产品中伊维菌素残留的ELISA 检测奠定了基础。1 材料与方法1.1 试验材料1.1.1 伊维菌素 白色粉末,有效成分含量>98%(其中B 1a 含量约为92%,B 1b 含量约为18%),浙江海正药业有限公司提供。1.1.2 主要试剂 牛血清白蛋白(BSA )、卵清蛋白(OVA )、多聚-L -赖氨酸(PLL)、乙基二甲氨基碳化二亚胺盐酸盐(EDC ),Sig m a 公司产品;二甲基甲酰胺(DMF )、咪唑、琥珀酸酐、吡啶,北京化工厂生产;N -羟基琥珀酰亚胺(NH S)、叔丁基二甲基氯硅烷(t-Bu M e 2S i-C l),天津化学试剂公司生产;硅胶GF254(200~400目),青岛海洋化工厂生产;羊抗兔I gG-HRP ,北京鼎国生物公司生产。1.1.3 主要仪器 透析膜(Sig m a)、Sartorious 电子天平、95-1型磁力恒温搅拌器、DDY -6B 型电泳

仪、凝胶成像系统及分析软件(Syngene 公司)。1.1.4 试验动物 新西兰成年白兔,体重1.7~2.0kg ,购自中牧集团兰州生物制药厂。1.2 试验方法1.2.1 半抗原5-O -(单)琥珀酰I V M 的合成 以C 5-OH 为反应位点,在无水吡啶的催化下进行反应。取0.1g I VM 加2.0m L 无水吡啶溶解,加入0.05g 琥珀酸酐,45e 、磁力搅拌下避光反应12h ,反应物在3.6%HC l 和乙酸乙酯间分配,收集酯层减压浓缩;用二氯甲烷复溶残留物,TLC 分离产物(GF 254,展开剂C H 2C 12B TH F B HAC (90B 9.5B 0.5),共有4个条带,Rf 分别为1.0,0.5,0.3,0.2;分别刮取4条带,以乙酸乙酯淋洗,收集洗脱液,减压浓缩,真空干燥。1.2.2 人工抗原的合成 免疫抗原5-O -(单)琥珀酰I V M -PLL 的合成(NH S 法):取12m g 半抗原5-O-(单)琥珀酰I V M,加0.4mL D M F 溶解,再依次加入2.7m g NH S 和4.7m g EDC -HC l 混合,20e 避光搅拌10h ,将上述反应液逐滴加至6mL 含20m g PLL 的硼酸盐缓冲液(0.2mm ol/L ,p H 值为9.4)-10%DM F ;溶液开始略显混浊,最后有少量沉淀出现,继续搅拌1h ,再转至4e 条件下搅拌12h,产物经PBS (0.01m o l/L ,p H 值为7.2)透析72h,Sephdex G -200纯化。

包被原5-O -(单)琥珀酰I V M -OVA 的合成(混合酸酐法):取10m g 5-O-(单)琥珀酰I V M,用1mL D M F 溶解,加入15L L 氯甲酸异丁酯,20e 搅拌45m i n ,制成A 液;称取30m g 的OVA 溶于10m L 0.2m ol/mL 硼酸盐缓冲液(pH 值为9.4)中制成B 液。将A 液逐滴加入B 液,边加边搅拌,之后在4e 搅拌反应12h ,然后将混合物装入事先处理并在0.01m o l/m L PBS(p H 值为7.4)中浸泡过夜的透析袋中,在4e 、0.01m o l/mL PBS(p H 值7.4)中透析3d ,每天换2次透析液。1.2.3 半抗原和人工抗原的结构鉴定 半抗原的结

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构鉴定:采用薄层色谱法点样,以I V M 的标准品作为对照,采用质谱法确证。

人工抗原的SDS-PAGE 鉴定:SDS-PAGE 所用浓缩胶浓度为5%,分离胶浓度为15%,浓缩胶电压为80V,分离胶电压为120V;电泳完毕后用考马斯亮蓝R-2502.5g /L 染色5h,用脱色液脱色至背景清晰为止,然后用凝胶成像系统软件计算载体蛋白与半抗原的结合比。2 结果2.1 半抗原的合成与鉴定

合成产物共有4条带,Rf 分别为1.0,0.5,0.3,0.2,进行质谱鉴定,Rf 0.3的分子质量(976bp)与目标产物分子质量(976.6bp)一致,见图1。质谱分析结果从分子质量上说明了反应产物为目标产物。

目标产物干燥后称重,最终得到75m g 白色粉末,计算其收率为67.63%

。

图1 5-O -(单)琥珀酰I VM 质谱图

2.2 人工抗原的SDS-PAGE

鉴定

.5-O-(单)琥珀酰I VM -OVA;2.5-O -(单)琥珀酰I V M -PLL ;

3.载体OVA;

4.载体PLL;M.低分子蛋白质量标准。

图2 人工抗原的SDS-PAGE

人工抗原及其载体的SDS-PAGE 结果显示,合成的人工抗原SDS -PAGE 条带的迁移率均比各自载体的迁移率略小(见图2),表明人工抗原的分子质量大于相应载体的分子质量,证明人工抗原合成成功。用凝胶成像系统软件分析得出5-O -(单)琥珀酰I V M -PLL 的分子质量为79.6ku,载体PLL 的分子质量为55.0ku ,PLL 与5-O -(单)琥珀酰I V M

的分子结合比为1B 25.3。5-O-(单)琥珀酰I V M -OVA 的分子质量为58.0ku ,载体OVA 的分子质量

为40.0ku ,OVA 与5-O -(单)琥珀酰I V M 的分子结合比为1B 18.6。3 讨论

目前,用于检测动物性食品I V M 残留的检测方法主要是H PLC 法,样品前处理复杂、耗时且设备昂贵,不适用于大批量样品的快速筛选、检测。而ELISA 法具有快速、特异性强、灵敏度高等优点,甚至可以制成试纸用于现场快速检测,已广泛应用于农药、激素、兽药及其他化学残留物的检测。

笔者以NH S 法合成了5-O -(单)琥珀酰I V M -PLL 人工免疫原,以混合酸酐法合成了5-O -(单)琥珀酰I V M -OVA 人工包被原,经SDS -PAGE 鉴定,表明人工抗原合成成功,经计算PLL 与5-O-(单)琥珀酰I VM 的偶联比为1B 25.3。

制备小分子化合物的人工抗原需要与载体进行交联,但小分子化合物必须具有或衍生出能与载体进行交联反应的功能基团(氨基、羧基、重氮盐等)才能与载体交联。对于羟基的半抗原,需要将其羟基衍生为羧基后才能与载体交联合成人工抗原。I V M 分子结构中有3个羟基,即C4d -OH 、C5-OH 和C7-OH,但7位羟基由于空间阻碍作用较难反应,本试验选用5位羟基与琥珀酸酐反应生成其衍生物I V M 的半琥珀酸酯,从而在5位羟基上引入了1个羧基,进而与载体交联合成了I V M 的人工抗原。

对于含有羧基半抗原与载体蛋白质偶联的方法有混合酸酐法、碳化二亚胺法和NH S 法。其中NH S 法首先利用NH S 和半抗原合成酯,在EDC 的作用下使产物与蛋白失水产生稳定的连接,偶联的效果较好,所以采用该方法制备免疫抗原。半抗原和载体蛋白连接免疫动物后,不可避免地会产生针对免疫部位的抗体,为了避免此现象,选用混合酸酐法制备包被原,以利于血清的筛选。

I V M 作为一种半抗原,本身并不具备免疫原性,必须将其与相应的载体结合后才具有免疫原性。常选用的载体有鸡卵清蛋白(OVA )、牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HAS)等。本试验首次选用多聚-L-赖氨酸作载体来合成I V M 的人工抗原,PLL 自身免疫原性很差,但可以增加半抗原的免疫性,有利于机体产生特异性更高的抗体,且具有比BSA 更多的自由氨基(与BSA 相当分子质量的自由氨基数约是BSA 所含数目的10倍),可以大大提高在提蛋白质与半抗原的偶联率。试验结果表明,以PLL 作载体的偶联比为1B 25.3,比BSA 作载体时的偶联率有所提高,且产物的收率也较高。

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