用多聚赖氨酸作载体制备IVM人工抗原的研究
mRNA疫苗体外合成完整解决方案
mRNA疫苗体外合成完整解决方案空降姑苏，最全mRNA药物&疫苗/小核酸药物的核心技术、最新成果、产业化案例尽在NID 2021！“以下材料来自网络，专业介绍了mRNA疫苗生产的基本流程和常用酶制剂的用途，供对mRNA疫苗感兴趣的同行参考。
”（--编者）随着生命科学的不断进步，mRNA作为药物被应用到疾病治疗、疫苗等领域。
从1990年体外合成的mRNA第一次在细胞内表达，到2020年的mRNA疫苗在对抗新冠疫苗发挥重要作用。
以mRNA为基础的治疗方式已经在医药领域引起了一场革命。
mRNA（Messenger RNA、信使RNA）是将DNA中的基因信息传递到蛋白的中间信使。
mRNA疫苗治疗（见下图）是指在体外合成mRNA，将其导入体内，mRNA进入细胞后翻译表达出抗原蛋白，抗原刺激体内免疫系统，激活体液免疫和细胞免疫，当机体再次接触同种抗原（细胞/病毒），可产生快速免疫应答反应，自我保护。
mRNA疫苗研发-生产-治疗流程图片引用于 Novoprotein Scientific Inc.mRNA疫苗具有研发速度快、灵活、生产工艺简单、平台化、容易扩充产能，可以用于精准化和个性化治疗，一次可呈递多种抗原等优点。
mRNA疫苗属于第三代疫苗技术（见下图），相比于传统疫苗需要通过将病原微生物及其代谢产物通过人工灭毒﹑减活﹑基因工程的方法制成的繁杂工序，第三代疫苗特异性更强，有效性更高，并且研发周期较快。
它的结构简单、可人工批量合成，并且可以在研发阶段进行高通量筛选，大大节省研发时间。
而且相较于DNA疫苗，mRNA疫苗没有导入外源基因的遗传风险，起效更快，效果更强。
mRNA疫苗相对于其他疫苗的优势图片引用于网络mRNA疫苗具有工艺通用性好，研发速度快，能够活化细胞免疫，刺激效果好，递送效果好等特性。
高的mRNA产量需要高效的mRNA 体外合成方法，大规模生产选择T7 RNA聚合酶体外转录。
增强mRNA的稳定性，降低免疫原性并提升翻译效率，最有效的解决方案是：使用加帽酶对mRNA进行加帽，使其在细胞内外稳定，降低免疫原性，并且使mRNA可以被核糖体识别，启动翻译程序。
五聚赖氨酸β-羰基酞菁锌：光动力疗法中一种有效的肿瘤靶向光敏剂
五聚赖氨酸β-羰基酞菁锌：光动力疗法中一种有效的肿瘤靶向光敏剂介绍作为一种潜在的抗癌方法，光动力学疗法正日益受到人们的关注。
在各种光敏剂中，酞菁由于它优越光敏特点而被广泛的研究：在670nm处的强吸收（此处光的组织穿透深度是卟吩姆钠630nm处的两倍)，选择性地被肿瘤细胞摄取，具有低毒性，高化学和光化学稳定性的特点。
然而，未被取代的酞菁是疏水的，在体液中难溶。
在一些实验研究中发现，大部分的两亲性光敏剂比相同类型的疏水或亲水分子具有更高的光学动力。
酞菁外周的磺基取代是个很好的方法增加酞菁的水溶性，因而它们更适合在生理系统中使用，CAUCHON等人发现将酞菁用三个磺酸集团和一个疏水的乙炔基取代大大增加了细胞摄取，优先定位在线粒体膜，对emt-6L老鼠乳腺的肿瘤细胞产生光学动力效应。
邻二磺酸酞菁比对二磺酸酞菁有更好的活性。
他们在培养的细胞和实验动物的肿瘤细胞中可以有效的穿透细胞并显示出高效的光动力学效应。
新近的研究表明ZnPc-S2P2可在体外有效杀灭肿瘤细胞，而体内使肿瘤凋亡。
此种两性光敏剂的临床一期实验正在进行。
另一种二磺酸盐衍生物，AlPcS2，也证实主要通过杀灭肿瘤细胞而非损害血管来引起肿瘤衰亡。
在光敏剂中引入正电荷取代基不仅可增加酞菁环的极性和溶解性，还可以增加细胞摄取并提高对肿瘤细胞及细胞内位点的靶向性。
观察发现，阳离子吡啶酞菁锌比阴离子及中性酞菁锌有更强的细菌光毒性。
另外，研究还发现，N-甲基吡啶氧基酞菁和多聚L-精氨酸氯e6？可使革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌失活。
将取代酞菁纯化为单一异构体面临着很大困难。
非对称性取代酞菁则由于存在多种异构体难度更大。
我们开发了一种可实现大规模制备单取代β-羰基酞菁锌的合成与纯化方案。
在此化合物的基础上，我们合成了一非对称酞菁锌共轭体系，ZnPc-(Lys)5。
该共轭化合物的定量细胞摄取及光毒性都与ZnPc-S2P2及ZnPc-S4做了比较。
光动力活性评估方面，体外引入三种细胞株（人源胃癌细胞，人源慢性髓性白血病细胞及人胚肺成纤维细胞），而体内实验对象为昆明鼠皮下植入的S180肿瘤。
ε-聚赖氨酸抑菌机制及其在肉类保鲜中的应用
肉制品营养丰富、水分含量高，在加工、运输和贮存过程中极易受到微生物的污染，引起腐败变质，不仅降低其感官品质和营养价值，带来巨大经济损失；还易引发食物中毒，危害人体健康。
因此，寻求绿色、安全、有效的保鲜技术已成为肉制品加工领域的研究热点。
ε-聚赖氨酸（ε-PL）是一种天然抗菌肽，抑菌谱广、稳定性强，同时兼具生物可降解性高、安全性好等优势，且已被美国、日本、韩国和中国等多个国家批准为食品防腐剂，在食品保鲜和防腐领域极具开发潜力。
我国ε-PL的工业化生产已初具规模，但产品用途较为单一，存在开发不足、产品同质化等问题。
近年来，采用ε-PL与其他防腐抑菌剂及成膜材料复配制备复合膜已成为防腐保鲜技术的研究趋势，极有可能成为未来ε-PL应用研究的新方向。
本文主要针对ε-PL的抑菌保鲜应用研究进行综述，着重探讨ε-PL的抑菌机制及其多种复合膜在肉类保鲜领域的应用新进展，以期为ε-PL的高值化开发利用和肉制品的绿色、高效保鲜提供参考。
摘要：肉制品营养丰富，但极易腐败变质，亟需寻求绿色、高效的保鲜技术。
ε-聚赖氨酸是一种天然抗菌肽，具有抑菌活性高、稳定性强、生物降解性高、安全性好等优点，在食品保鲜和防腐领域极具开发潜力。
目前，基于ε-聚赖氨酸与成膜材料联合制备的复合膜已成为防腐保鲜技术的研究热点。
首先，综述了ε-聚赖氨酸的基本性质、抑菌活性及抑菌机制；其次，探讨了ε-聚赖氨酸对肉制品品质的系统影响；最后，重点介绍了ε-聚赖氨酸与蛋白质、多糖、聚乙烯醇等制备的复合膜特性及其在肉制品保鲜中的应用进展。
结论ε-PL作为天然、高效的抗菌肽，在肉制品的绿色加工及安全控制领域具有极大的开发利用潜力。
ε-PL能够通过破坏细胞膜结构与功能、抑制菌体能量代谢、引起DNA损伤等诱导致腐微生物死亡，进而有效抑制肉制品的腐败变质，延长货架期。
随着对ε-PL研究及应用的深入，基于ε-PL制备的食品包装膜已受到广泛关注。
相较于利用单一ε-PL作为保鲜剂，将其与蛋白、多糖、聚乙烯醇等联合制备的复合膜可以达到更为理想的肉制品保鲜效果。
多聚赖氨酸（Poly-L-Lysine）的配制、保留、应用总结[最新]
![多聚赖氨酸（Poly-L-Lysine）的配制、保留、应用总结[最新]](https://img.taocdn.com/s3/m/14811bc0185f312b3169a45177232f60ddcce7e5.png)
因为自己做PC12细胞培养，想在接种前将培育皿用多聚赖氨酸包被，到园子里搜索了下，关于多聚赖氨酸的帖子不少，看了一些帖子，将大部分收集在此。
个人觉得关于多聚赖氨酸的配置、保存、使用各方面问题，这些帖子里面都解释了。
注：我只是摘了一个帖子里某段或某句话。
一般一段话来自某一位战友。
一、常用的多聚赖氨酸包被可以用三蒸水，或者PBS，浓度一般为用0.1 mg/ml进行包被。
二、其他常用包被方法比较(以各种免疫分析为例)：49456826.snap三、我配成1mg/ml的储存液，用Mini-Q(超纯水)配制，放在－20℃储存，使用时稀释10倍（也用超纯水），即终浓度100ug/ ml，过滤后使用。
工作液过滤使用，如一次用不完，放在4℃储存。
多聚赖氨酸在水溶液中易分解，所以一次不要配太多工作液。
四、我现在要配多聚赖氨酸,书上写的用PBS配,但没写PH,浓度，向各位请教。
答：PH应该在7.0~7.4，PBS：取氯化钠7.650 g，无水磷酸氢二钠0.724 g，磷酸二氢钾0.210g 溶于蒸馏水1000 mL 中，以1N 氢氧化钠溶液调pH 值为7.0~7.4，经121℃灭菌15 分钟五、我准备用多聚赖氨酸涂片培养细胞,不知道多聚赖氨酸涂过的玻片如何灭菌？能否干烤灭菌？答：Sigma的产品说明书上写的很明白的。
另外，有本书上是这么写的，供参考：Poly-ly sine-coated tissue culture surf acesTo coat cov erslips: Prepare a stock solution by dissolv ing 25 mg/ml poly ly sine in 4.73 ml water (both poly-L-lysine an d poly-D-lysine are used to coat tissue culture surf aces; check specif ic protocol f or choice of isomer) and f ilter sterilize throu gh a 0.22-μm f ilter. Store in 100-μl aliquots at ?20°C. When ready to use, dilute one aliquot in 40 ml water to prepare 13 μg/ml working solution. Sterilize cov erslips by autoclav ing prior to coating. Dip cov erslips in the working solution, then inc ubate 15 min to sev eral hours in a humidif ied 37°C, 5% CO2 incubator. Allow surf ace to dry.To coat culture dishes or 8-well chamber slides: Prepare a stock solution by dissolv ing 100 mg poly-lysine in 100 ml water (both poly-L-lysine and poly-D-lysine are used to coat tissue culture surf aces; check specif ic protocol f or choice of isom er) and f ilter sterilize through a 0.22-μm f ilter. Store in 5-ml aliquots at ?20°C. When ready to use, dilute 1 part stock solutio n with 9 parts water to prepare 100 μg/ml working solution. Fill tissue culture dishes or slide wells with the working soluti on and incubate 1 hr in a humidif ied 37°C, 5% CO2 incubator, then remov e solution by v acuum aspiration and allow surf ace to dry.Store coated tissue culture ware up to 3 months at 4°C. Use diluted solutions only once, but unused diluted aliquots can be stored up to 3 months at 4°C.你可以配置好PLL后单独将其过滤除菌，分装，待用。
重组抗原的制备-概述说明以及解释
重组抗原的制备-概述说明以及解释1.引言1.1 概述重组抗原作为一种重要的生物医学研究工具，在免疫学、药物研发和诊断领域具有广泛的应用价值。
通过利用基因工程技术将DNA片段重新组合并在相关宿主细胞表达，可以有效地制备出与天然抗原结构相似甚至更优越的重组抗原。
这些重组抗原不仅可以用于疾病的诊断和治疗，还可以应用于疫苗研究以及抗体生产等方面。
本文将探讨重组抗原的定义和意义，介绍制备重组抗原的方法，以及重组抗原在不同领域的应用，旨在深入了解重组抗原的制备与应用，为相关领域的研究和应用提供参考和借鉴。
1.2 文章结构文章结构部分的内容应包括对整篇文章的组织和内容安排进行简要说明。
在这篇关于重组抗原制备的文章中，文章结构部分可以介绍以下内容：文章结构部分：本文分为引言、正文和结论三个部分。
在引言部分，我们将首先对重组抗原的定义和意义进行概述，然后介绍本文的结构和目的，为读者提供文章的整体框架。
在正文部分，我们将详细讨论重组抗原的定义和意义，介绍制备重组抗原的方法以及探讨重组抗原在不同应用领域中的作用和意义。
在结论部分，我们将总结重组抗原制备的重要性，展望未来发展方向，并以简短的结语作为全文的结束。
通过以上结构的安排，读者可以清晰地了解本文内容的组织和逻辑脉络，有助于更好地理解文章的主旨和深层次内涵。
1.3 目的本文旨在探讨重组抗原的制备方法及其在生物医学领域中的应用。
通过对重组抗原的定义和意义进行阐述，介绍制备重组抗原的方法和技术，以及重组抗原在疾病诊断、疫苗研究等领域的广泛应用，旨在帮助读者更全面地了解和认识重组抗原的重要性，促进相关领域的学术研究和技术发展。
同时，通过展望未来重组抗原制备领域的发展方向，以期为相关研究提供参考和借鉴，推动重组抗原制备技术的不断创新和完善。
愿本文能为广大读者提供有益的信息和启发，促进该领域的进一步发展和应用。
2.正文2.1 重组抗原的定义和意义重组抗原是指通过基因工程技术将目标抗原基因导入到表达系统中，使其在体外大量表达和纯化的抗原。
重组抗原的制备
重组抗原的制备全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：重组抗原是一种利用基因工程技术制备的蛋白质，它具有特定的抗原性质，可用于免疫学研究、疫苗开发和诊断试剂的制备。
在制备重组抗原的过程中，需要先确定目标蛋白的序列，然后将其克隆到适当的表达载体中，最终通过表达和纯化等步骤得到所需的重组抗原。
重组抗原的制备与传统抗原的制备方法有很大的差异，传统抗原的制备通常需要从病原体或动物组织中提取蛋白质，这样做不仅效率低、成本高，而且还会存在交叉反应和污染等问题。
而重组抗原的制备则可以通过基因工程技术精确地合成目标蛋白的基因序列，并利用表达系统高效地表达和纯化所需的蛋白质，从而避免了传统抗原制备过程中的诸多问题。
在制备重组抗原时，首先需要确定目标蛋白的氨基酸序列，这可以通过生物信息学方法从数据库中获取，也可以通过实验手段测定。
确定了目标蛋白的序列后，需要将其克隆到合适的表达载体中，表达载体通常含有启动子、终止子、选择标记等元件，可以在宿主细胞中高效地表达目标蛋白。
将目标蛋白克隆到表达载体中后，需要通过转染等方法将表达载体导入到宿主细胞中，宿主细胞可以是细菌、酵母、哺乳动物细胞等。
在宿主细胞中，表达载体会被转录和翻译成蛋白质，最终产生出目标蛋白的重组抗原。
一般来说，重组抗原的纯化过程比较复杂，需要利用各种色谱技术来分离和纯化目标蛋白。
常用的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等，这些方法可以根据目标蛋白的特性和所需纯度来选择合适的条件。
通过以上步骤，我们可以成功地制备出重组抗原，供免疫学研究、疫苗开发和诊断试剂制备等用途。
重组抗原具有较高的纯度和活性，可以替代传统抗原，在疫苗研究和临床诊断等领域具有重要的应用价值。
重组抗原的制备是一项复杂而关键的技朮工作，需要结合基因工程、细胞生物学和蛋白化学等多种学科知识，只有掌握了这些技术，才能高效地制备出高质量的重组抗原，为科学研究和医学应用提供有力支持。
希望今后在这方面的研究和应用能够取得更多的突破和进展，为人类健康和生活质量的提升做出更大的贡献。
ε-聚赖氨酸及培养基影响其生物合成的研究进展
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人工抗原在中药注射剂过敏反应研究中的应用与进展
人工抗原在中药注射剂过敏反应研究中的应用与进展作者：刘筱清,冯宇飞,吕邵娃,邢希旺,李永吉来源：《中国中药杂志》2013年第03期[摘要] 中药注射剂中存在一些具有潜在致敏性的小分子物质，因相对分子质量太小而缺乏免疫原性，当其与合适的载体偶联后可导致过敏反应。
因此，如何将小分子半抗原与载体偶联制备具有免疫原性和反应原性的完全抗原，是中药注射剂小分子致敏物质筛选的关键。
作者从中药注射剂半抗原的特点、载体的选择和使用、偶联方法、完全抗原的纯化鉴定等方面论述了人工抗原抗体制备技术的最新研究情况及其在中药注射剂致敏物质筛选中的实验研究进展，以及免疫芯片技术在中药注射剂致敏物质研究中的应用前景，旨在为中药注射剂安全性控制提供新的实验研究思路和方法。
[关键词] 中药注射剂；半抗原；人工抗原；致敏物质；安全性中药注射剂是指以中医药理论为指导，采用现代科学技术和方法，从中药或天然药物的单方或复方中提取的有效物质制成的无菌溶液、混悬液或临用前配成液体的灭菌粉末供注入人体内的制剂。
与传统剂型相比，中药注射剂生物利用度高、起效快、作用强等特点在急重症的治疗中显示了独特的优势。
随着中药注射剂的广泛应用，其不良反应和不良事件也频频发生，严重危害了广大患者的身体健康和生命安全。
筛选并去除中药注射剂的致敏物质、提高其质量迫在眉睫。
在免疫学中，具有免疫原性和反应原性的物质称为完全抗原，只有反应原性而无免疫原性的物质为半抗原[1]。
中药注射剂中的小分子致敏物质仅具有反应原性，但是由于相对分子质量过小而不具有免疫原性，缺乏T细胞表位无法直接诱导机体产生特异性免疫反应，如果将其在体外与载体（如蛋白）偶联制成人工抗原，则可借助T细胞表位间接诱导B细胞的增殖与分化，从而产生特异性抗体[2]。
因此，将小分子半抗原与载体偶联，制备具有免疫原性和反应原性的完全抗原，是中药注射剂致敏物质筛选的关键。
本文就人工抗原的合成在中药注射剂致敏物质筛选中的应用及发展前景进行综述。
氨苄青霉素人工抗原的合成及单克隆抗体的制备
SHI Lei1 ，CHENG Hua2* ，YAN Jinghui2 ，WU Meng2 ，LIU Jingze1 （ 1． College of Life Science，Hebei Normal University，Shijiazhuang 050024，China； 2． Institute of Biology，Hebei Academy of Sciences，Shijiazhuang 050081，China）
取 8 周龄左右的 BALB / c 小鼠，腹腔注射 0. 3 ～ 0. 5 mL 石蜡油，7 ～ 10 d 后腹腔注入 （ 5 ～ 10） × 105 个杂交瘤细胞，待小鼠腹部明显膨大，用针头刺入小 鼠腹部抽取腹水，采用 ProteinA 柱层析方法纯化单抗 腹水［7］。使用抗体亚型试剂盒鉴定抗体亚型。 1. 2. 6 抗 AMP 单抗的特性鉴定
将合成的 AMP － KLH 完全抗原对 6 ～ 8 周龄的 BALB / c 雌性小鼠进行免疫，免疫计量均为 25 μg / 只。将合成抗原与等量弗氏佐剂 （ 第一次免疫用弗 氏完全佐剂，以后用弗氏不完全佐剂） 乳化均匀， 采用背部多点注射法进行免疫，每隔 2 周免疫 1 次。
用间接 ELISA 检测血清效价及抑制结果。待血清效 价达到 1∶ 105 ，选择血清效价高且细胞的制备及筛选
抗原——精选推荐
抗原⼈⼯抗原⽤化学合成法或基因重组法制备含有已知化学结构决定簇的抗原，称之为⼈⼯抗原。
它可包括⼈⼯结合抗原、⼈⼯合成抗原和基因重组抗原。
⽆论对免疫学理论研究和分⼦疫苗的制备都具有重要意义。
（⼀）⼈⼯结合抗原将⽆免疫原性的简单化学基团与蛋⽩质载体偶联，或将⽆免疫原性的有机分⼦如⼆硝基苯（DNP）或三硝基苯（TNP）与蛋⽩质载体结合，形成载体-半抗原结合物，均属⼈⼯结合抗原。
应⽤此种抗原证明了抗原与抗体特异结合的化学基础，以及在抗体⽣成过程中T与B细胞的协同作⽤。
（⼆）⼈⼯合成抗原⽤化学⽅法将活化氨基酸聚合，使之成为合成多肽，只由⼀种氨基酸形成的聚合体称为同聚多肽，如由左旋赖氨酸形成的共同聚多肽（PLL）。
由⼆种或⼆种以上氨基酸形成的聚合多肽称为共聚多肽，如由酪氨酸、⾕氨酸与多聚丙氨酸和赖氨酸组成的聚合成多肽（T、G）-AL。
应⽤这种⼈⼯合成多肽可研究氨基酸种类、序列与蛋⽩质抗原性及免疫原性的关系，也可研究机体遗传性与免疫性的关系。
对天然蛋⽩质抗原性的研究证明，任何⼀个氨基酸⽚段，只要具有合适的构型，都有抗原性，甚⾄⼀⼩段合成的⼩肽与合适的载体相联接，也能诱导产⽣抗体，并能与其天然分⼦构型相结合，这就提⽰，可根据天然蛋⽩质抗原的免疫原性⽚段进⾏氨基酸序列分析，或由其编码DNA推导的氨基酸序列，进⾏构建⼈⼯合成多肽疫苗。
（三）基因⼯程抗原近年来由于分⼦⽣物学技术的进步，已有可能将编码免疫原性氨基酸序列的基因克隆化并与适当载体（如细菌粒或病毒）DNA分⼦相结合，然后引⼊受体细胞中（如原核细胞的⼤肠杆菌或真核细胞酵母菌及哺乳类动物细胞）使之表达，即能获得免疫原性之融合蛋⽩，经纯化后可做为疫苗，此即基因⼯程疫苗。
应⽤分⼦⽣物学技术制备基因重组疫苗的另⼀进展，是将⽬的抗原决定簇的DNA序列插⼊另⼀种⽐较安全的活病素基因组中（如⽜痘苗），制备所谓重组感染载体多价疫苗。
随着70年代分⼦病毒学的发展，特别是对病毒基因的结构、功能与复制⽅⾯知识的积累，为迅速研制病毒亚单位疫苗、合成多肽苗以及基因⼯程疫苗奠定了基础。
食品中阿维菌素类药物残留检测方法研究进展
食品中阿维菌素类药物残留检测方法研究进展廉慧锋;宋洁;张文娟;宋欢【摘要】Avermectins, as the family of macrocyelic lactones which had been widely used in agriculture, animal husbandry and aquaculture, belongs to highly toxic pesticide and it was listed as a highly toxic compound by WHO. Its residues in food should not be ignored. The author reviewed the avermectins residue determination technology in agriculture, animal husbandry and aquaculture.%阿维菌素类药物作为一种高效的抗生素类生物杀虫剂,被广泛应用于农业、畜牧业和水产业,属于高毒农药,被世界卫生组织列为高毒化合物,其在食品中的残留问题不容忽视.综述了阿维菌素类药物在农业、畜牧业和水产业中的残留检测技术.【期刊名称】《山西农业科学》【年(卷),期】2011(039)008【总页数】4页(P918-921)【关键词】阿维菌素类药物;残留;检测方法;研究进展【作者】廉慧锋;宋洁;张文娟;宋欢【作者单位】山西出入境检验检疫局,山西太原030024;山西出入境检验检疫局,山西太原030024;山西大学生命科学学院,山西太原030006;山西出入境检验检疫局,山西太原030024【正文语种】中文【中图分类】S481+.8阿维菌素类药物（Avermectins，AVMs）是由链霉素（streptomyces avermitilis）产生的一组类似于大环内酯类药物的物质，由于有杀虫活性强[1-2]、杀虫谱广的特点，成为现代农牧业上用量最大的抗寄生虫药物[3]。
聚赖氨酸综述
天然食品防腐剂--聚赖氨酸的研究进展摘要：ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine,ε-PL)是通过白色链霉菌(S treptom yces albulus)发酵产生的一种由赖氨酸单体在α-羟基和ε-氨基之间形成酰胺键连接而成的均聚氨基酸,是一种安全、高效、耐高温、水溶性好、抗菌谱广的食品防腐剂。
在酸性和微酸性环境中,对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母菌、霉菌均有一定的抑菌效果,尤其对其它天然防腐剂不易抑制的革兰氏阴性的大肠杆菌、沙门氏菌抑菌效果非常好。
本文综述了ε-聚赖氨酸的结构性质、抑菌机理、应用以及其产生菌的筛选、目的产物的提取。
关键词：聚赖氨酸筛选抑菌机理应用食品的腐败变质一直是人们关心的一个问题,近年来,全世界农副产品、水产品、果蔬等食品腐烂变质而引起的经济损失十分巨大,如何防止食品腐败变质越来越引起人们的重视。
长期以来,由于受到经济环境和开发水平的制约,几乎所有的食品都采用化学合成防腐剂来延长食品的保质期。
随着人们生活水平的提高和健康意识的加强,对食品品质提出了更高的要求,这其中除了食品的营养、感官和外观装外,食品的食用安全性更为人们所关注[1]。
天然防腐剂具有抗菌性强、安全无毒、水溶性好、热稳定性好、作用范围广等合成防腐剂无法比拟的优点。
因此,近年来天然防腐剂的研究和开发利用成为了食品工业的一个热点。
目前,国外一些发达国家批准使用微生物食品防腐剂有乳酸链球菌素(Nisin)、纳他霉素(Natamycin)和ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine)。
我国分别于1990年和1996年批准上述前两种微生物防腐剂用于食品防腐保鲜。
ε-聚赖氨酸(简称ε-PL)是80年代由日本首先发现的一种新型食品抑菌剂,它具有广谱抑菌性,能够抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌和一些耐热性芽孢杆菌等。
由于耐高温、安全高效、抑菌谱广,可以应用于多种果蔬、食品、饮料和保健性药物的保鲜剂[13]。
一、聚赖氨酸的结构及性质聚-ε-赖氨酸(Poly-ε-lysine，简称ε-PL)最早发现是一种主要由自色链霉菌(Streptomyces albulus)产生的,由25-30个赖氨酸残基通过其a-羧基和ε-氨基形成的酰胺键连接而成的同型单体聚合物[1]。
半抗原免疫原的制备的载体选择
半抗原免疫原的制备的载体选择
多肽、甾族激素、药物、脂肪胺、核苷等小分子物质仅能与相应的抗
体发生特异性结合反应，而它们自己并不是免疫原，不能诱导抗体产生。
只有将这种半抗原与蛋白质或其他高聚物结合后才能刺激机体产
生抗体。
结合的方法有物理法和化学法。
物理吸附的载体有淀粉、聚
乙烯吡咯烷酮（PVP），硫酸葡聚糖、羧甲基纤维素等，是通过电荷和
微孔吸附半抗原。
化学法是利用功能团把半抗原以载体上。
载体选择
1．蛋白质类蛋白质是结构复杂的大分子胶体物质，是一种良好的
载体。
常用的有人血清白蛋白、牛血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白和血
蓝蛋白等。
其中以牛血清蛋白最为常用，因其溶解度大，免疫活性强，又容易获得。
蛋白质和半抗原结合是通过游离氧基、游离羧基、酚基、巯基、咪唑基、吲哚基和胍基等活性基团的缩合。
2．多肽类聚合物是人工合成的多肽聚合物，常用的是多聚赖氨酸（polylysine）。
这种多聚合物与半抗原结合后，可诱发动物产生高
滴度、高亲和力的抗体。
多聚赖氨酸的分子量可达十几万到几十万，
是良好的载体。
3．大分子聚合物和某些颗粒PVP、羧甲基纤维素和活性碳等皆可
与半抗原结合，加入福氏完全佐剂可诱发产生良好的抗体。
因半抗原种类、动物类别、载体种类及结合方法的不同，制得的
免疫原对动物免疫所产生的效果也不同。
实际应用时，应多采用几种
载体或方法。
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兽医科技
收稿日期:2008-12-21;修回日期:2008-10-31
基金项目:中国农科院兰州畜牧与兽药研究所基金项目(MY JJ05-3)
作者简介:魏小娟(1976-),女,助理研究员,硕士.
用多聚赖氨酸作载体制备I VM 人工抗原的研究
魏小娟,张继瑜,张 梅,李剑勇,周绪正,李金善,牛建荣
(中国农业科学研究院兰州畜牧与兽药研究所中国农业科学院新兽药重点开放实验室,甘肃兰州730050)中图分类号:S852.4+
3
文献标识码:B 文章编号:1004-7034(2009)01-0065-02
关键词:伊维菌素;人工抗原;多聚-L-赖氨酸
摘 要:采用N -羟基琥珀酰亚胺活性酯法和混合酸酐法,将伊维菌素(I V M )分别与多聚-L-赖氨酸(PLL)和卵清蛋白(OVA )连接制备人工免疫原5-O -(单)琥珀酰I V M -PLL 和包被原5-O -(单)琥珀酰I VM -OVA,经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析证实人工抗原合成成功。
伊维菌素(Lver m ecti n ,I V M )是大环内酯类杀虫、杀螨剂,由于其具有杀菌活性强以及杀菌谱广等特点已被广泛地应用于畜禽及水产养殖业,也是农业生产上广泛使用的一种杀虫剂。
但此类药物在动物性产品中的残留严重影响到我国农产品的国际竞争力,同时也对人及环境存在潜在的威胁。
随着人们对I VM 残留的毒性及环境风险的日益关注,迫切需要简单、快速、高效的I V M 残留检测方法,但目前常用的H PLC 法检测的灵敏度较低,无法满足农产品中I V M 及其有毒代谢物的残留分析要求。
为此,笔者根据I V M 的结构特点,采用N -羟基琥珀酰亚胺活性酯法和混合酸酐法将伊维菌素与载体蛋白偶联,成功地制备了伊维菌素完全抗原,为畜禽产品中伊维菌素残留的ELISA 检测奠定了基础。
1 材料与方法1.1 试验材料1.1.1 伊维菌素 白色粉末,有效成分含量>98%(其中B 1a 含量约为92%,B 1b 含量约为18%),浙江海正药业有限公司提供。
1.1.2 主要试剂 牛血清白蛋白(BSA )、卵清蛋白(OVA )、多聚-L -赖氨酸(PLL)、乙基二甲氨基碳化二亚胺盐酸盐(EDC ),Sig m a 公司产品;二甲基甲酰胺(DMF )、咪唑、琥珀酸酐、吡啶,北京化工厂生产;N -羟基琥珀酰亚胺(NH S)、叔丁基二甲基氯硅烷(t-Bu M e 2S i-C l),天津化学试剂公司生产;硅胶GF254(200~400目),青岛海洋化工厂生产;羊抗兔I gG-HRP ,北京鼎国生物公司生产。
1.1.3 主要仪器 透析膜(Sig m a)、Sartorious 电子天平、95-1型磁力恒温搅拌器、DDY -6B 型电泳
仪、凝胶成像系统及分析软件(Syngene 公司)。
1.1.4 试验动物 新西兰成年白兔,体重1.7~2.0kg ,购自中牧集团兰州生物制药厂。
1.2 试验方法1.2.1 半抗原5-O -(单)琥珀酰I V M 的合成 以C 5-OH 为反应位点,在无水吡啶的催化下进行反应。
取0.1g I VM 加2.0m L 无水吡啶溶解,加入0.05g 琥珀酸酐,45e 、磁力搅拌下避光反应12h ,反应物在3.6%HC l 和乙酸乙酯间分配,收集酯层减压浓缩;用二氯甲烷复溶残留物,TLC 分离产物(GF 254,展开剂C H 2C 12B TH F B HAC (90B 9.5B 0.5),共有4个条带,Rf 分别为1.0,0.5,0.3,0.2;分别刮取4条带,以乙酸乙酯淋洗,收集洗脱液,减压浓缩,真空干燥。
1.2.2 人工抗原的合成 免疫抗原5-O -(单)琥珀酰I V M -PLL 的合成(NH S 法):取12m g 半抗原5-O-(单)琥珀酰I V M,加0.4mL D M F 溶解,再依次加入2.7m g NH S 和4.7m g EDC -HC l 混合,20e 避光搅拌10h ,将上述反应液逐滴加至6mL 含20m g PLL 的硼酸盐缓冲液(0.2mm ol/L ,p H 值为9.4)-10%DM F ;溶液开始略显混浊,最后有少量沉淀出现,继续搅拌1h ,再转至4e 条件下搅拌12h,产物经PBS (0.01m o l/L ,p H 值为7.2)透析72h,Sephdex G -200纯化。
包被原5-O -(单)琥珀酰I V M -OVA 的合成(混合酸酐法):取10m g 5-O-(单)琥珀酰I V M,用1mL D M F 溶解,加入15L L 氯甲酸异丁酯,20e 搅拌45m i n ,制成A 液;称取30m g 的OVA 溶于10m L 0.2m ol/mL 硼酸盐缓冲液(pH 值为9.4)中制成B 液。
将A 液逐滴加入B 液,边加边搅拌,之后在4e 搅拌反应12h ,然后将混合物装入事先处理并在0.01m o l/m L PBS(p H 值为7.4)中浸泡过夜的透析袋中,在4e 、0.01m o l/mL PBS(p H 值7.4)中透析3d ,每天换2次透析液。
1.2.3 半抗原和人工抗原的结构鉴定 半抗原的结
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5黑龙江畜牧兽医62009年第1期
兽医科技
构鉴定:采用薄层色谱法点样,以I V M 的标准品作为对照,采用质谱法确证。
人工抗原的SDS-PAGE 鉴定:SDS-PAGE 所用浓缩胶浓度为5%,分离胶浓度为15%,浓缩胶电压为80V,分离胶电压为120V;电泳完毕后用考马斯亮蓝R-2502.5g /L 染色5h,用脱色液脱色至背景清晰为止,然后用凝胶成像系统软件计算载体蛋白与半抗原的结合比。
2 结果2.1 半抗原的合成与鉴定
合成产物共有4条带,Rf 分别为1.0,0.5,0.3,0.2,进行质谱鉴定,Rf 0.3的分子质量(976bp)与目标产物分子质量(976.6bp)一致,见图1。
质谱分析结果从分子质量上说明了反应产物为目标产物。
目标产物干燥后称重,最终得到75m g 白色粉末,计算其收率为67.63%。
图1 5-O -(单)琥珀酰I VM 质谱图
2.2 人工抗原的SDS-PAGE
鉴定
.5-O-(单)琥珀酰I VM -OVA;2.5-O -(单)琥珀酰I V M -PLL ;
3.载体OVA;
4.载体PLL;M.低分子蛋白质量标准。
图2 人工抗原的SDS-PAGE
人工抗原及其载体的SDS-PAGE 结果显示,合成的人工抗原SDS -PAGE 条带的迁移率均比各自载体的迁移率略小(见图2),表明人工抗原的分子质量大于相应载体的分子质量,证明人工抗原合成成功。
用凝胶成像系统软件分析得出5-O -(单)琥珀酰I V M -PLL 的分子质量为79.6ku,载体PLL 的分子质量为55.0ku ,PLL 与5-O -(单)琥珀酰I V M
的分子结合比为1B 25.3。
5-O-(单)琥珀酰I V M -OVA 的分子质量为58.0ku ,载体OVA 的分子质量
为40.0ku ,OVA 与5-O -(单)琥珀酰I V M 的分子结合比为1B 18.6。
3 讨论
目前,用于检测动物性食品I V M 残留的检测方法主要是H PLC 法,样品前处理复杂、耗时且设备昂贵,不适用于大批量样品的快速筛选、检测。
而ELISA 法具有快速、特异性强、灵敏度高等优点,甚至可以制成试纸用于现场快速检测,已广泛应用于农药、激素、兽药及其他化学残留物的检测。
笔者以NH S 法合成了5-O -(单)琥珀酰I V M -PLL 人工免疫原,以混合酸酐法合成了5-O -(单)琥珀酰I V M -OVA 人工包被原,经SDS -PAGE 鉴定,表明人工抗原合成成功,经计算PLL 与5-O-(单)琥珀酰I VM 的偶联比为1B 25.3。
制备小分子化合物的人工抗原需要与载体进行交联,但小分子化合物必须具有或衍生出能与载体进行交联反应的功能基团(氨基、羧基、重氮盐等)才能与载体交联。
对于羟基的半抗原,需要将其羟基衍生为羧基后才能与载体交联合成人工抗原。
I V M 分子结构中有3个羟基,即C4d -OH 、C5-OH 和C7-OH,但7位羟基由于空间阻碍作用较难反应,本试验选用5位羟基与琥珀酸酐反应生成其衍生物I V M 的半琥珀酸酯,从而在5位羟基上引入了1个羧基,进而与载体交联合成了I V M 的人工抗原。
对于含有羧基半抗原与载体蛋白质偶联的方法有混合酸酐法、碳化二亚胺法和NH S 法。
其中NH S 法首先利用NH S 和半抗原合成酯,在EDC 的作用下使产物与蛋白失水产生稳定的连接,偶联的效果较好,所以采用该方法制备免疫抗原。
半抗原和载体蛋白连接免疫动物后,不可避免地会产生针对免疫部位的抗体,为了避免此现象,选用混合酸酐法制备包被原,以利于血清的筛选。
I V M 作为一种半抗原,本身并不具备免疫原性,必须将其与相应的载体结合后才具有免疫原性。
常选用的载体有鸡卵清蛋白(OVA )、牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HAS)等。
本试验首次选用多聚-L-赖氨酸作载体来合成I V M 的人工抗原,PLL 自身免疫原性很差,但可以增加半抗原的免疫性,有利于机体产生特异性更高的抗体,且具有比BSA 更多的自由氨基(与BSA 相当分子质量的自由氨基数约是BSA 所含数目的10倍),可以大大提高在提蛋白质与半抗原的偶联率。
试验结果表明,以PLL 作载体的偶联比为1B 25.3,比BSA 作载体时的偶联率有所提高,且产物的收率也较高。
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and V e teri nary M edicine
l 12009。