发酵优化与控制

发酵过程的优化与控制

1.举例说明反馈控制系统是如何工作、间接优化发酵性能的。

答：以《应用溶氧反馈控制高密度培养重组大肠杆菌过程中乙酸的产生》为例简介如下：

在供氧充足的条件下，当大肠杆菌比摄糖速率q g≥临界值q g crit时(图1A)，就会产生乙酸，溶氧信号pO2在产生乙酸时为图1B中的2，不产生乙酸为图1B中的1；

在葡萄糖限制培养的条件下，脉冲补入葡萄糖，当q g≤q g crit时，大肠杆菌比摄氧速率q o升高，pO2值降低。

脉冲过后，葡萄糖浓度的下降，q g下降，pO2值也逐渐回升(图1B)。

当脉冲补入的葡萄糖过多，大肠杆菌的摄糖速率超过临界值时，大肠杆菌的摄氧能力处于饱和状态，pO2值的响应就不会随着葡萄糖的脉冲补入而产生振荡变化(图1B)。

如图：在补料的前阶段(15~28h)，以对数增加的流速补入葡萄糖时，pO2值随着葡萄糖脉冲补入而上下振荡；加入IPTG开始诱导(26h)重组大肠杆菌表达人表皮生长因子后，在接近30h时，振荡的幅度变小，这标志着重组菌的比摄糖速率逐渐接近产生乙酸的临界比摄糖糖速率(q g crit)，而此后降低补料速率则又使pO2的振荡幅度有所增加。根据pO2值的振荡变化来控制葡萄糖的补料速率(30~44h)，能使重组大肠杆菌继续保持较高的生长速率，同时发酵液中的乙酸和葡萄糖的浓度也维持在较低的水平，大肠杆菌的细胞干重在44h时达到48g/L，人表皮生长因子的表达量比第二批提高45％。

2、实现发酵过程优化的目标有哪些？如何根据发酵过程的特点实现这些目标

的相对统一？举一例进行表述。

答：

⑴实现发酵过程优化的目标：

使细胞生理调节、细胞环境、反应器特性、工艺操作条件与反应器控制之间这种复杂的相互作用尽可能的简化，并对这些条件和相互关系进行优化，使之最适于特定发酵过程的进行，以达到高产量（提高设备利用率；降低产品提取费用），高转化率（降低原料成本；减少环境污染），高生产强度（缩短生产周期；降低设备投资）的目的。

⑵举例说明实现发酵目标相对统一：《L-组氨酸发酵优化》

①L-组氨酸测定方法的研究

产物的快速测定，可以帮助生产者及时知道发酵过程进行的水平。快速测定方法的建立不仅给生产带来方便，也节约了生产成本。

本研究中应用“Paully试剂比色法”对发酵液中L-组氨酸进行了定量分析研究，确立了L-组氨酸定量测定条件和计算方法，并对其精确度进行研究，证明Paully试剂比色法能够快速，准确的测定发酵液中L-组氨酸含量。

②L-组氨酸发酵条件的优化

组氨酸工业优生产的关键是发酵，发酵水平的高低是决定产品成本的主要因素。提离发酵水平的途径有二条：一是选育适合工业化生产的优良菌种，二是获得与生产菌种相匹配的最佳发酵工艺条件和控制手段。前者是建立在代谢控制发酵研究基础上的现代菌种选育技术，后者是建立在生化反应工程基础上的发酵过程技术。只有二者紧密结合才能最终实现发酵生产的高水平。

本研究中进行了分批发酵和补料分批发酵的条件优化，通过研究培养方式、营养条件控制、无机盐影响、生长因子影响以及环境条件控制对于L-组氨酸发酵的影响，从而提高了组氨酸的产量。

如图3-1所示为不同碳源对种子培养基的影响，从种子活力分析，以葡萄糖和果糖作为碳源，菌体浓度较高，而蔗糖作为碳源时种子活力最低。从产酸角度看，蔗糖产酸最高，葡

萄糖次之，而果糖和麦芽糖的L-组氨酸产量相比之下较低。

图3-2为不同氮源对于种子培养基的影响，得到以氯化铵为无机氮源，菌种的L-组氨酸产量提高幅度最大，因此以氯化铵为种子培养基氮源。

通过种子培养基正交实验，得到图3-4的方差分析表，按照对菌体产酸影响作用大小排序为：蔗糖> MgSO4·7H20>氯化铵> KH2P04，从而得到最适种子培养基配方(g/L)：蔗糖30，氯化铵26，酵母膏5，MgSO4·7H20 1，KH2P040.5，K2HP040.5，NaHP040.5，CaC0320，pH 7．6～7．8。

随后又通过实验确定种子培养基的最适培养条件，包括最适pH，最佳装液量，种子培养时间，如图3-5为黄色短杆菌生长曲线，可以看出。黄色短杆菌LGS4在培养6h左右开始进入对数生长期，在18h左右结束对数生长，转入稳定期。故选取最佳种子培养时间为18h。

文章的第四部分介绍了L-组氨酸分批发酵条件的研究。通过研究不同初糖浓度和不同补糖方式对L-组氨酸积累的影响以及不同初铵浓度和不用补铵方式的影响，得出根据耗糖速度补加糖，使残糖浓度基本维持在10-20g／L之间，少量多次补铵方式效果最好。最后对不同发酵方式的试验结果进行分析比较得知：补料发酵比分批发酵效果好；而5L罐发酵没有摇瓶发酵效果好；分析原因可能为5L发酵罐发酵条件未达到最优所至。如表4-13为不同发酵方式的实验结果比较。

从以上的研究可以看出，其研究思路是从种子培养，发酵过程以及检测方式三个方面进行研究，这是通过种子培养基优化，培养时间确定，发酵优化以及检测快速准确方面考虑的，部分实现了高产、高转化率、高生产强度的统一，要想更好的实现三者的统一，还需要从种子选育、发酵机制、技术手段更先进等方面进行考虑，这需要涉及多个学科多种技术的综合。

3、用于发酵过程的优化技术主要有哪些？试详细叙述之，并举例说明。

答：

⑴基于微生物反应原理的培养环境优化技术

培养环境优化技术的基本思想是基于微生物反应原理(包括底物的运输、胞内生化反应和产物的排出过程)，研究微生物从培养基中摄取营养物质的情况和营养物质通过代谢途径转化后的去向，确定不同环境条件对微生物生长和代谢产物分布的影响，进而优化微生物生长的物理和化学环境，保证微生物生长处于最适的环境条件下，为进一步的发酵过程优化奠定基础。主要包括两个方面：①培养基组成的优化技术，包括尽可能地简化培养基的组成，研究一些关键物质，如碳、氮源的种类、维生素等在发酵过程中的关键作用，并对这些关键物质的浓度及其供给方式进行优化等；②发酵环境条件的优化技术，包括温度，pH 值、搅拌速率和供氧等。

如《一株产抗灰霉病菌株的发酵优化研究》一文中，作者以顺丁烯二酸酐为基础碳源，