谷氨酸发酵实验

影响因素1：生物素

由以上分析可知，当生物素缺乏时，异柠檬酸裂解酶的活 性减弱。 当生物素丰富时，异柠檬酸裂解酶的活性必然加强，则乙 醛酸循环正常进行，乙醛酸循环的进行，一方面提供了大 量的“中间性产物”，另一方面，菌体的能和水平得到提 高。前者是菌体增殖的物质基础，后者则是菌体增殖的能 量的保证。这样的结果是，有利于菌体的增殖和生长，则 • 以上分析说明，谷氨酸发酵过程中，前期，菌 谷氨酸的生物合成就会受到影响，甚至停止，这在生产上， 体的增殖期，一定量的生物素是菌体增殖所必需 就是通常我们说的“只长菌，不产酸”的现象。

消泡方法有机械消泡(耙式、离心式、刮板式、 蝶式消泡器)和化学消泡(天然油脂、聚酯类、 醇类、硅酮等化学消泡剂)两种方法。
影响因素9：发酵时间的控制

不同的谷氨酸产生菌对糖的浓度要求也不一
样，其发酵时间也有所差异。

低糖(10%～12%)发酵，其发酵时间为36～
38h，

中糖(14%)发酵，其发酵时间为45h。
(2) 泡沫过多，发酵液会外溢，造成浪费和污染； (3) 泡沫过多，易冲上罐顶，造成染菌。因此，在 谷氨酸的发酵过程中控制好过多的泡沫是发酵成败 的关键。
影响因素8： 泡沫

在发酵过程中由于强烈的通风和菌体代谢产 生的CO2，使培养液产生大量的泡沫，不仅使 氧在发酵液中的扩散受阻，影响菌体的呼吸 和代谢。给发酵带来危害，必须加以消泡。
我国使用的生产菌株：
北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense) AS1.299 北京棒杆菌D110 钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum) AS1.542 棒杆菌(Corynebacterium sp.)S-914 黄色短杆菌T6~13
生产菌株特点
在己报道的谷氨酸生产菌中，除芽孢杆菌外， 虽然它们在分类学上属于不同的属种，但都有一 些共同特点: 革兰氏阳性 菌体为球形、短杆至棒状 不形成芽孢 没有鞭毛，不能运动 需要生物素作为生长因子 在通气条件下才能产生谷氨酸。
pH：前期pH（7.5～8.0），中后期pH（7.0～7.6）。 通过采用流加尿素，氨水或液氨等办法调节pH，补 充氮源。

影响因wenku.baidu.com8： 泡沫
谷氨酸发酵是好气性发酵，因通风和搅拌产生 泡沫是正常的，但泡沫过多会带来一系列问题：
(1) 泡沫形成泡盖时，代谢产生的气体不能及时排 出，妨碍菌体呼吸作用，影响菌体的正常代谢；
1.
2.
3. 4. 5. 6.
生产原料
发酵生产谷氨酸的原料有

淀粉质原料：玉米、小麦、甘薯、大米等。其中甘薯和淀粉
最为常用；
大米进行浸泡磨浆，再调成15Bx，调pH6.0，加细菌a-淀粉酶进行液
化，85 ℃30min，加糖化酶60 ℃糖化24h，过滤后可供配制培养基。

糖蜜原料：甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜；
积累大量的乳酸，使发酵液的pH值下降，不利于 谷氨酸的产生，同时，一部分葡萄糖转成了乳酸，影 响了糖酸转化率，降低了产物的提出率。 α-酮戊二酸
L-谷氨酸脱氢酶
NADPH NADP
谷氨酸
影响因素2：供氧浓度（通风量）
控制
？？
在谷氨酸发酵过程中,通风必须适度。在谷氨酸发酵过
程中，发酵前期以低通风量为宜；发酵中、后期以高通 风量为宜。

的；而在产物合成期，则要限制生物素的浓度， 以保证产物的正常合成。
影响因素1：生物素

生物素对菌体细胞膜通透性的影响
菌体进入产物合成期时，有谷氨酸产生， 如果能够大量的把产物及时的排泄到细胞膜外， 可以解除谷氨酸对L-谷氨酸脱氢酶活性的抑制 作用，从而使由葡萄糖→谷氨酸的高效率转化， 反之，如果……。可见，改善细胞膜通透性的 重要性
影响因素1：生物素

控制 ？？

第1阶段是菌体生长阶段
保证生物素充足，使菌体快速生长；

第2阶段是产酸阶段
控制生物素亚适量(5-10μg/L)，使谷氨酸大量积累。
影响因素2：供氧浓度（通气量）

过量：
NADPH的再氧化能力会加强，使α -酮戊二酸的还 原氨基化受到影响，不利于谷氨酸的生成。

供氧不足：

下列关于谷氨酸产生菌的描述，哪些是正确 的？
A：-酮戊二酸氧化能力微弱， B：谷氨酸脱氢酶活性强， C：具有向胞外分泌谷氨酸的能力， D：在菌体生长期乙醛酸循环弱， E：在产酸期乙醛酸循环弱， F：CO2固定能力弱。
第二节 影响谷氨酸产量的因素及发酵条件控制 相关知识点回顾

下列关于谷氨酸产生菌的描述，哪些是正确 的？
(2) 菌体细胞膜所带电荷发生改变，从而改变细胞膜的 渗透性，影响菌体对营养的吸收和代谢产物的排出；
(3) 影响培养基组分和中间代谢产物的离解，从而影响 菌体对这些物质的利用。
影响因素7： pH值

pH值对谷氨酸积累的影响
谷氨酸脱氢酶是合成谷氨酸的主要酶,它的最 适pH为7.0～7.2，当发酵液的pH值偏酸时(pH 5.05.8)，谷氨酸脱氢酶受到抑制，代谢向着生成谷氨 酰胺和乙酰谷氨酰胺的方向进行。

在发酵后期由于耗用大量NH4+，pH值下降，此时就 要进行pH值调节，以保证发酵的正常进行。
影响因素7： pH值

pH发生变化的主要原因是培养基中营养成分的利用 和代谢产物的积累。

如当谷氨酸棒状杆菌利用糖类物质不断生成谷氨酸 时，培养液的pH就会下降。而碱性物质的消耗和氨 的生成等则会导致培养液的pH上升。
如何进行呢？
生物素对菌体细胞膜通透性的影响

谷氨酸发酵采用的菌种都是生物素缺陷型，而生物
素又是菌体细胞膜合成的必须物质，因此，可以通
过控制生物素的浓度，来实现对菌体细胞膜通透性 的调节。

生物素对细胞膜合成的影响主要是通过对细胞膜的 主要成分——磷脂中的脂肪酸的生物合成来实现的，
当限制了菌体脂肪酸的合成时，细胞就会形成一个
在谷氨酸发酵过程中，应正确控制碳氮比。 一般在菌体生长期碳氮比应大一些(氮低）， 在产酸期,碳氮比应小些(氮高）。 在碳源和氮源的比为3∶1时，谷氨酸棒 状杆菌会大量合成谷氨酸，但当碳源和氮源 的比为4∶1时，谷氨酸棒状杆菌只生长而不 合成谷氨酸？。
影响因素6：发酵温度

谷氨酸发酵前期(0～12h)是菌体大量繁殖阶段， 在此阶段菌体利用培养基中的营养物质来合成核 酸、蛋白质等，供菌体繁殖用，而控制这些合成 反应的最适温度均在30～32℃。
细胞膜不完整的菌体。生物体内脂肪酸的合成途径 如下：
葡萄糖
丙酮酸 乙酰辅酶A
+
丙酮酸 乙酰辅酶Ａ
CO2
乙酰辅酶A羧化酶
CO2
丙二酰辅酶A C4 丙二酰辅酶A
CO2
C6

其中，将乙酰辅酶A羧化生成丙二酰辅酶A的酶是乙 酰辅酶A羧化酶，该酶的辅酶是生物素。当培养基中 生物素的浓度较低时，细胞膜的合成就会受影响。 培养基中生物素限量时，胞内AA 92% 胞外 培养基中生物素丰富时，胞内AA 12% 胞外

在发酵中、后期，是谷氨酸大量积累的阶段，而 催化谷氨酸合成的谷氨酸脱氢酶的最适温度在 32～36℃，故发酵中、后期适当提高罐温对积累 谷氨酸有利。
影响因素7： pH值

pH值对谷氨酸产生菌生长的影响
谷氨酸产生菌象其它微生物一样，有最适生长pH值 范围，当高于或低于这个值时： (1) 菌体内的酶受到抑制，菌体新陈代谢受阻，生长停 滞；
实际生产上，以气体转子流量计来检查通气量，即以每 分钟单位体积的通气量表示通风强度。另外发酵罐大小不同， 所需搅拌转速与通风量也不同。
影响因素3：NH4+浓度

（1）影响到发酵液的pH值，见pH值影响。
（2）与产物的形成有关： NH4+过量：菌体增殖阶段会抑制菌体生长，产 酸阶段谷氨酸会受谷氨酰胺合成酶作用转化为谷氨 酰胺； NH4+不足：不利于-酮戊二酸的还原氨基化， -酮戊二酸积累，引起反馈调节
影响因素5：碳氮比

氮源是合成菌体细胞蛋白质、核酸和谷氨酸的氨 基来源，大约85%的氮源被用于合成谷氨酸，另外 15%用于合成菌体。 谷氨酸发酵需要的氮源比一般发酵工业多得多， 一般发酵工业碳氮比为100:0.2～2.0，谷氨酸发 酵的碳氮比为100:15～21。

影响因素5：碳氮比
控制
？？
谷氨酸发酵的影响因素及控制

谷氨酸发酵是典型的代谢控制发酵
发酵过程中，谷氨酸的大量积累不是
由于生物合成途径的特异，而是菌体代谢
调节控制和细胞膜通透性的特异调节以及
发酵条件的适合。

整个发酵过程可简单的分为2个阶段:
第1阶段是菌体生长阶段;
第2阶段是产酸阶段,谷氨酸得以大量积累。
第二节 影响谷氨酸产量的因素及发酵条件控制 相关知识点回顾

为醋酸诱导
受琥珀酸和葡萄糖阻遏
如何封闭乙醛酸循环呢？


当生物素缺乏时：
（1）丙酮酸的有氧氧化就会减弱(由于生物素对TCA循环 的促进作用)，则：乙酰辅酶A的生成量就会少，醋酸浓 度降低，它的诱导作用降低； （2）VH对TCA循环的促进作用的降低，使得其中间产物 琥珀酸的氧化速度降低，其浓度得到积累，这样它的阻 遏和抑制作用加强； 两者综合的作用使得，异柠檬酸裂解酶的活性丧失，乙 醛酸循环得到封闭。
酸时，应如何控制培养基中生物素的含量？
A：在发酵过程中始终保证生物素过量，
B：在发酵过程中始终控制生物素亚适量， C：在菌体生长期保证生物素充足，在产酸期控制生 物素亚适量， D：在菌体生长期控制生物素亚适量，在产酸期保证 生物素充足。

在利用生物素的营养缺陷型菌株发酵生产谷氨
酸时，应如何控制培养基中生物素的含量？
A：在发酵过程中始终保证生物素过量，
B：在发酵过程中始终控制生物素亚适量， C：在菌体生长期保证生物素充足，在产酸期控制生 物素亚适量， √ D：在菌体生长期控制生物素亚适量，在产酸期保证 生物素充足。
影响因素1：生物素
如何封闭乙醛酸循环呢
？
乙醛酸循环的关键酶是异柠檬酸裂解酶，研究表
明，该酶受以下几个因素的影响：
某谷氨酸发酵，发 酵过程中各种参数 的变化情况如图所 示。最后的发酵液 中谷氨酸的浓度很 低，发酵周期较长， 而这段时间却有大 量的葡萄糖被消耗， 那么，这些被消耗 的葡萄糖到哪里去 了？
谷氨酸产生菌的发酵条件与产物的关系
控制因子
发酵产品转换
氧气
NH4+ pH 磷酸 生物素
乳酸或琥珀酸（通气不足）←→谷氨酸（通气充足）
α -酮戊二酸（缺乏）←→谷氨酸（适量）←→谷氨酰胺（过量） N-乙酰谷氨酰胺（酸性）←→谷氨酸（中性或微碱性） 缬氨酸（高浓度）←→谷氨酸 乳酸或琥珀酸（丰富）←→谷氨酸（缺乏）
pH 温度 搅拌速度
还原糖的测定 发酵过程 参数测定 菌体形态观察 菌体浓度测定
发 酵 液
谷氨酸的测定
谷氨酸生产菌
谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum) 谷氨酸棒杆菌 乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermenturn) 黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)
A：-酮戊二酸氧化能力微弱， B：谷氨酸脱氢酶活性强， C：具有向胞外分泌谷氨酸的能力， D：在菌体生长期乙醛酸循环弱， E：在产酸期乙醛酸循环弱， F：CO2固定能力弱。 √ √ √ √
乙醛酸循环的控制
α-酮戊二酸氧化能力缺失或微弱
谷氨酸脱氢酶活力强

在利用生物素的营养缺陷型菌株发酵生产谷氨

影响因素3：NH4+浓度

NH4+的供给方式（流加）： （1）液氨 （2）0.8%尿素
影响因素4：碳源

发酵液中糖含量与谷氨酸的发酵有密切的关系。在
一定范围内，谷氨酸的产量随糖含量的增加而增加，
但糖含量过高，渗透压过大，对菌体生长不利，谷 氨酸对糖的转化率低。

发酵液中还原糖的含量一般应控制在10%～13%。
糖蜜原料：不宜直接用来作为谷氨酸发酵的碳源，因含丰富的生物素。 预处理方法：活性碳或树脂吸附法和亚硝酸法吸附或破坏生物素。也
可以在发酵液中加入表面活性剂吐温60或添加中青霉素。

氮源料：尿素或氨水。
谷氨酸发酵
例子

出现这种情况的原因是由于发酵 过程中感染了杂菌，造成了大量 的葡萄糖被消耗，但是并没有产 生谷氨酸??
谷氨酸发酵过程中，生产菌种的特性、 生物素、发酵温度、pH值、通风和发酵 产生的泡沫都是影响谷氨酸积累的主要 因素。在实际生产中，只有针对存在的 问题，严格控制工艺条件，才能达到稳
产、高产的目的。
谷氨酸发酵的工艺流程简图
培养基的配制 上罐实消 冷却接种 三角瓶培养 固体斜面培养 DO值
发
酵
发酵过程参数的控制