大豆盐胁迫相关GmNAC基因的鉴定、表达及变异分析
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1
Crop Research Institute, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250131, China; 2 Key Laboratory of Soybean Biology of Ministry of
Education, Northeast Agricultural University, Harbin 150001, China
Identification, Expression and Variation Analysis of Salt Tolerance Related GmNAC Genes in Soybean
ZHANG Yan-Wei1,2, ZHANG Li-Feng1, LI Wei1, WANG Cai-Jie1, ZHANG Jun1, and XU Ran1,
Hale Waihona Puke Baidu
高温、低温、干旱和盐碱等非生物逆境胁迫严 重影响作物的生长 , 造成作物大幅度减产 。 NAC 蛋白是一类植物特异的参与多种植物生理生化过程 的转录因子 [2], 广泛参与植物生长发育以及逆境应 答。 NAC (NAM, ATAF1-2, CUC2) 最初起源于 NAM
[1]
(no apical meristem), ATAF1-2 和 CUC2 (cup-shaped cotyledon)
第7期
张彦威等 : 大豆盐胁迫相关 GmNAC 基因的鉴定、表达及变异分析
991
通路的关键基因 , AtNAC072的表达受高盐、脱落酸 (ABA)、生长素、乙烯、茉莉酸 (JA)、脱水、损伤等 多种因素诱导并参与植物的信号传导[5], AtNAC019的 表达 受ABA、 热、 高盐、 JA、 干旱应答等因素诱导, 并 调节植物生长发育[6-8]。AtNAC055是拟南芥JA信号通 路的关键基因, 调控JA的生物合成, 并能对高盐、 真菌 等多种逆境应答 [7-8]。 AtNAC102能够参与拟南芥的洪 涝 胁 迫 应 答 [9] 。 OsNAC002[10-13] 、 OsNAC048[14-15] 和 OsNAC068[16]参与水稻的耐旱、耐盐等多种逆境胁迫。 随着对大豆 NAC 基因家族研究的深入 , 越来越 多的大豆 NAC 类转录因子得到了鉴定。孟庆长等首 次在大豆中克隆得到 6 个 GmNAC 基因 [17-18]; 韩巧玲 等 [19]利用 NTT (核蛋白筛选系统 )从大豆耐盐品种铁 丰 8 号中克隆得到 GmNAC2a 基因 , 该基因对干旱、 高温、低温、高盐、 ABA、乙烯等多种途径均有响 应 ; 金 杭 霞 等 [20] 发 现 GmNAC2 参 与 逆 境 调 控 , GmNAC5 参与大豆发育调控 ; 才华等 [21]利用酵母单 杂交的方法从野生大豆中克隆得到能与耐逆相关顺 式元件 MYB1AT 特异结合的 GsNAC20 基因 , 该基因 能够响应高盐、干旱和低温胁迫 , 并且在根和叶中 具有不同的表达模式 , 超量表达 GsNAC20 的拟南芥 提高盐胁迫的敏感性 ; Tran 等 [22]在大豆中克隆了 31 个 GmNAC 基因 , 发现 9 个 NAC 基因能同时响应干 旱、高盐、冷、 ABA 等胁迫应答 , 聚类分析发现 9 个 GmNAC 基因与前人报道的逆境相关 NAC 基因位 于同一分支 ; Le 等
大豆盐胁迫相关 GmNAC 基因的鉴定、表达及变异分析
张彦威 1,2
1
张礼凤 1
李
伟1
王彩洁 1
张
军1
徐
冉 1,
山东省农业科学院作物研究所 , 山东济南 250131; 2 东北农业大学大豆生物学教育部重点实验室 , 黑龙江哈尔滨 150001
摘
要 : NAC 基因在植物的逆境胁迫中发挥着重要作用。本研究参照水稻和拟南芥的逆境相关 NAC 基因 , 采用生物
Abstract: NAC genes play an important role in plant stress tolerance. In this study, bioinformatic method was used to identify the stress related GmNAC gene in soybean. The expression of candidated GmNAC genes in root and leaf was analyzed in soybean with NaCl treatment by Real-time PCR. Reverse transcription PCR was performed to clone genes with significant difference in expression. The results showed that there were 175 genes in soybean GmNAC gene family. There were 11 GmNAC proteins with highly conserved NAC located on the same evolutionary branch with the stress related NAC proteins in rice and Arabidopsis. The expression of 11 GmNAC genes in soybean root was higher than that in leaf. The GmNAC genes were all induced by NaCl stress, but part of the GmNAC genes showed different expression levels between root and leaf in soybean varieties with different salt tolerances. There were three synonymous mutations and one non-synonymous mutation on the CDS region of Glyma06g11970.1 and one synonymous mutation on the CDS region of Glyma06g16440.2 in Qihuang 34, Xudou 10, and Fendou 95. Keywords: Soybean; GmNAC; Phylogenetic tree; NaCl treatment; Expression analysis; Sequence variation
信息学方法鉴定了大豆逆境相关 GmNAC 基因 , 利用荧光定量 PCR 技术分析了 GmNAC 基因在耐盐差异的大豆品种 根部、 叶片的表达及其对 NaCl 胁迫的应答 , 采用反转录 PCR 技术克隆了表达差异显著的 GmNAC 基因。 结果表明 , 大 豆 GmNAC 基因家族包含 175 个基因 , 其中 11 个基因所编码的 GmNAC 蛋白与水稻和拟南芥的逆境相关 NAC 蛋白 位于同一进化分支 , 这些蛋白具有高度保守的 NAC 结构域 ; 这 11 个 GmNAC 基因在大豆根部的表达均高于在叶片 , 而且在叶片和根部均受 NaCl 诱导 , 部分基因在根部和叶片以及品种间表现出不同的表达规律 ; 在大豆品种齐黄 34、 徐豆 10 和汾豆 95 中 , Glyma06g11970.1 存在 3 个同义突变和 1 个非同义突变 , Glyma06g16440.2 存在 1 个同义突变。 关键词 : 大豆 ; GmNAC; 进化树 ; NaCl 处理 ; 表达分析 ; 序列变异
1.3
获得的 NAC 蛋白进行序列比对 ; 根据多重序列比对 结 果 , 使 用 MEGA 5.05 软 件 采 用 最 大 似 然 法 (maximum likelihood, ML)构建系统进化树。
1.4
大豆 GmNAC 基因的表达分析
选取与拟南芥和水稻的逆境胁迫相关 NAC 蛋
白位于同一进化分支的大豆 GmNAC 蛋白 , 查询文 献或利用 Primer 5 设计引物进行荧光定量分析 (表 1)。将大豆种子播种于装有细沙的育苗盘中 , 用 1/4 MS 培养液浇灌至大豆第一片三出复叶全展 , TRIzol 法提取大豆根部和叶片 RNA, 利用 Roche Lightcycler 480II 进行荧光定量 PCR, 利用 2–ΔΔCt 数据分析 该基因在根叶中的表达情况 ; 将大豆种子播种于细 沙的育苗盘中 , 用 1/4 MS 培养液浇灌至大豆第 1 片 三出复叶全展 , 移至水培 , 添加 150 mmol L–1 NaCl 的 1/4 MS 培养液处理 , 1/4 MS 培养液处理作为空白 处理 , 分别采集处理 1、 3、 6 和 12 h 的叶片和根提 取 RNA 并定量分析表达情况。
[23-24]
1
1.1
材料与方法
试验材料
选用本课题组前期鉴定的耐盐品种徐豆 10、齐
黄 34 和盐敏感品种汾豆 95。
1.2
NAC 蛋白质序列的获得 从 植 物 转 录 因 子 数 据 库 PlantTFDB (http:// planttfdb.cbi.pku.edu.cn/)下载大豆 NAC 转录因子序 列 , 对去冗余后的蛋白序列根据 Phytozome (http:// phytozome.org/) 的 功 能 注 释 并 利 用 SMART (http:// smart.embl-heidelberg.de/) 分 析 氨 基 酸 结 构 域 , 获 得 具有 NAC 保守结构域的候选基因 ; 查询文献获得拟 南芥和水稻逆境胁迫相关的 NAC 蛋白质序列。 NAC 蛋白家族系统进化树分析 利用 MEGA 5.05 软件内置的 Clustal W 程序对
[3]
。 NAC 蛋白包含一个保守的 N- 端 DNA
结合域和一个多样化的转录调控域 [4]。 NAC家族成员 能够激活植物的逆境应答基因 , 提高植物对逆境的 耐受性。 AtNAC072和 AtNAC019是拟南芥的 ABA信号
本研 究 由 东北 农业 大 学 大豆 生物 学 教 育部 重点 实 验 室开 放基 金 项 目 (SB14A04), 国 家现 代农 业 产 业技 术体 系 建 设专 项 (CARS-04CES18), 国家自然科学基金项目 (31501329)和山东省自然科学基金项目 (ZR2015YL070)资助。 The study was supported by the Open Foundation of Key Laboratory of Soybean Biology of Ministry of Education, Northeast Agricultural University (SB14A04), the China Agriculture Research System (CARS-04-CES18), the National Natural Science Foundation of China (31501329), and the Natural Science Foundation of Shandong Province (ZR2015YL070).
作物学报
ACTA AGRONOMICA SINICA 2016, 42(7): 990999 ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9
http://zwxb.chinacrops.org/ E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2016.00990
通讯作者 (Corresponding author): 徐冉 , E-mail: soybeanxu@126.com
第一作者联系方式： E-mail: 13854198480@163.com, Tel: 0531-83179348 Received(收稿日期 ): 2015-12-16; Accepted(接受日期 ): 2016-03-14; Published online(网络出版日期 ): 2016-03-28. URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160328.1116.008.html
Crop Research Institute, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250131, China; 2 Key Laboratory of Soybean Biology of Ministry of
Education, Northeast Agricultural University, Harbin 150001, China
Identification, Expression and Variation Analysis of Salt Tolerance Related GmNAC Genes in Soybean
ZHANG Yan-Wei1,2, ZHANG Li-Feng1, LI Wei1, WANG Cai-Jie1, ZHANG Jun1, and XU Ran1,
Hale Waihona Puke Baidu
高温、低温、干旱和盐碱等非生物逆境胁迫严 重影响作物的生长 , 造成作物大幅度减产 。 NAC 蛋白是一类植物特异的参与多种植物生理生化过程 的转录因子 [2], 广泛参与植物生长发育以及逆境应 答。 NAC (NAM, ATAF1-2, CUC2) 最初起源于 NAM
[1]
(no apical meristem), ATAF1-2 和 CUC2 (cup-shaped cotyledon)
第7期
张彦威等 : 大豆盐胁迫相关 GmNAC 基因的鉴定、表达及变异分析
991
通路的关键基因 , AtNAC072的表达受高盐、脱落酸 (ABA)、生长素、乙烯、茉莉酸 (JA)、脱水、损伤等 多种因素诱导并参与植物的信号传导[5], AtNAC019的 表达 受ABA、 热、 高盐、 JA、 干旱应答等因素诱导, 并 调节植物生长发育[6-8]。AtNAC055是拟南芥JA信号通 路的关键基因, 调控JA的生物合成, 并能对高盐、 真菌 等多种逆境应答 [7-8]。 AtNAC102能够参与拟南芥的洪 涝 胁 迫 应 答 [9] 。 OsNAC002[10-13] 、 OsNAC048[14-15] 和 OsNAC068[16]参与水稻的耐旱、耐盐等多种逆境胁迫。 随着对大豆 NAC 基因家族研究的深入 , 越来越 多的大豆 NAC 类转录因子得到了鉴定。孟庆长等首 次在大豆中克隆得到 6 个 GmNAC 基因 [17-18]; 韩巧玲 等 [19]利用 NTT (核蛋白筛选系统 )从大豆耐盐品种铁 丰 8 号中克隆得到 GmNAC2a 基因 , 该基因对干旱、 高温、低温、高盐、 ABA、乙烯等多种途径均有响 应 ; 金 杭 霞 等 [20] 发 现 GmNAC2 参 与 逆 境 调 控 , GmNAC5 参与大豆发育调控 ; 才华等 [21]利用酵母单 杂交的方法从野生大豆中克隆得到能与耐逆相关顺 式元件 MYB1AT 特异结合的 GsNAC20 基因 , 该基因 能够响应高盐、干旱和低温胁迫 , 并且在根和叶中 具有不同的表达模式 , 超量表达 GsNAC20 的拟南芥 提高盐胁迫的敏感性 ; Tran 等 [22]在大豆中克隆了 31 个 GmNAC 基因 , 发现 9 个 NAC 基因能同时响应干 旱、高盐、冷、 ABA 等胁迫应答 , 聚类分析发现 9 个 GmNAC 基因与前人报道的逆境相关 NAC 基因位 于同一分支 ; Le 等
大豆盐胁迫相关 GmNAC 基因的鉴定、表达及变异分析
张彦威 1,2
1
张礼凤 1
李
伟1
王彩洁 1
张
军1
徐
冉 1,
山东省农业科学院作物研究所 , 山东济南 250131; 2 东北农业大学大豆生物学教育部重点实验室 , 黑龙江哈尔滨 150001
摘
要 : NAC 基因在植物的逆境胁迫中发挥着重要作用。本研究参照水稻和拟南芥的逆境相关 NAC 基因 , 采用生物
Abstract: NAC genes play an important role in plant stress tolerance. In this study, bioinformatic method was used to identify the stress related GmNAC gene in soybean. The expression of candidated GmNAC genes in root and leaf was analyzed in soybean with NaCl treatment by Real-time PCR. Reverse transcription PCR was performed to clone genes with significant difference in expression. The results showed that there were 175 genes in soybean GmNAC gene family. There were 11 GmNAC proteins with highly conserved NAC located on the same evolutionary branch with the stress related NAC proteins in rice and Arabidopsis. The expression of 11 GmNAC genes in soybean root was higher than that in leaf. The GmNAC genes were all induced by NaCl stress, but part of the GmNAC genes showed different expression levels between root and leaf in soybean varieties with different salt tolerances. There were three synonymous mutations and one non-synonymous mutation on the CDS region of Glyma06g11970.1 and one synonymous mutation on the CDS region of Glyma06g16440.2 in Qihuang 34, Xudou 10, and Fendou 95. Keywords: Soybean; GmNAC; Phylogenetic tree; NaCl treatment; Expression analysis; Sequence variation
信息学方法鉴定了大豆逆境相关 GmNAC 基因 , 利用荧光定量 PCR 技术分析了 GmNAC 基因在耐盐差异的大豆品种 根部、 叶片的表达及其对 NaCl 胁迫的应答 , 采用反转录 PCR 技术克隆了表达差异显著的 GmNAC 基因。 结果表明 , 大 豆 GmNAC 基因家族包含 175 个基因 , 其中 11 个基因所编码的 GmNAC 蛋白与水稻和拟南芥的逆境相关 NAC 蛋白 位于同一进化分支 , 这些蛋白具有高度保守的 NAC 结构域 ; 这 11 个 GmNAC 基因在大豆根部的表达均高于在叶片 , 而且在叶片和根部均受 NaCl 诱导 , 部分基因在根部和叶片以及品种间表现出不同的表达规律 ; 在大豆品种齐黄 34、 徐豆 10 和汾豆 95 中 , Glyma06g11970.1 存在 3 个同义突变和 1 个非同义突变 , Glyma06g16440.2 存在 1 个同义突变。 关键词 : 大豆 ; GmNAC; 进化树 ; NaCl 处理 ; 表达分析 ; 序列变异
1.3
获得的 NAC 蛋白进行序列比对 ; 根据多重序列比对 结 果 , 使 用 MEGA 5.05 软 件 采 用 最 大 似 然 法 (maximum likelihood, ML)构建系统进化树。
1.4
大豆 GmNAC 基因的表达分析
选取与拟南芥和水稻的逆境胁迫相关 NAC 蛋
白位于同一进化分支的大豆 GmNAC 蛋白 , 查询文 献或利用 Primer 5 设计引物进行荧光定量分析 (表 1)。将大豆种子播种于装有细沙的育苗盘中 , 用 1/4 MS 培养液浇灌至大豆第一片三出复叶全展 , TRIzol 法提取大豆根部和叶片 RNA, 利用 Roche Lightcycler 480II 进行荧光定量 PCR, 利用 2–ΔΔCt 数据分析 该基因在根叶中的表达情况 ; 将大豆种子播种于细 沙的育苗盘中 , 用 1/4 MS 培养液浇灌至大豆第 1 片 三出复叶全展 , 移至水培 , 添加 150 mmol L–1 NaCl 的 1/4 MS 培养液处理 , 1/4 MS 培养液处理作为空白 处理 , 分别采集处理 1、 3、 6 和 12 h 的叶片和根提 取 RNA 并定量分析表达情况。
[23-24]
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1.1
材料与方法
试验材料
选用本课题组前期鉴定的耐盐品种徐豆 10、齐
黄 34 和盐敏感品种汾豆 95。
1.2
NAC 蛋白质序列的获得 从 植 物 转 录 因 子 数 据 库 PlantTFDB (http:// planttfdb.cbi.pku.edu.cn/)下载大豆 NAC 转录因子序 列 , 对去冗余后的蛋白序列根据 Phytozome (http:// phytozome.org/) 的 功 能 注 释 并 利 用 SMART (http:// smart.embl-heidelberg.de/) 分 析 氨 基 酸 结 构 域 , 获 得 具有 NAC 保守结构域的候选基因 ; 查询文献获得拟 南芥和水稻逆境胁迫相关的 NAC 蛋白质序列。 NAC 蛋白家族系统进化树分析 利用 MEGA 5.05 软件内置的 Clustal W 程序对
[3]
。 NAC 蛋白包含一个保守的 N- 端 DNA
结合域和一个多样化的转录调控域 [4]。 NAC家族成员 能够激活植物的逆境应答基因 , 提高植物对逆境的 耐受性。 AtNAC072和 AtNAC019是拟南芥的 ABA信号
本研 究 由 东北 农业 大 学 大豆 生物 学 教 育部 重点 实 验 室开 放基 金 项 目 (SB14A04), 国 家现 代农 业 产 业技 术体 系 建 设专 项 (CARS-04CES18), 国家自然科学基金项目 (31501329)和山东省自然科学基金项目 (ZR2015YL070)资助。 The study was supported by the Open Foundation of Key Laboratory of Soybean Biology of Ministry of Education, Northeast Agricultural University (SB14A04), the China Agriculture Research System (CARS-04-CES18), the National Natural Science Foundation of China (31501329), and the Natural Science Foundation of Shandong Province (ZR2015YL070).
作物学报
ACTA AGRONOMICA SINICA 2016, 42(7): 990999 ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9
http://zwxb.chinacrops.org/ E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2016.00990
通讯作者 (Corresponding author): 徐冉 , E-mail: soybeanxu@126.com
第一作者联系方式： E-mail: 13854198480@163.com, Tel: 0531-83179348 Received(收稿日期 ): 2015-12-16; Accepted(接受日期 ): 2016-03-14; Published online(网络出版日期 ): 2016-03-28. URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160328.1116.008.html