中国人Y染色体微缺失分子诊断指南(草案)
Y染色体微缺失检测
Y染色体微缺失检测试剂盒背景介绍根据国际卫生组织调查数据，约15%育龄夫妇存在生育障碍，其中男性因素引起的生育障碍约占一半。
在已知的导致男性不育的遗传学因素中，发病率最高的两种是Y染色体的微缺失和克氏综合症。
Y染色体具有大量重复基因序列及回文结构，这些结构在维持Y染色体进化稳定性的同时也使回文结构内部基因易于丢失，进而导致不育。
缺失率最高的三个影响精子发生的区域被命名为AZFa，AZFb和AZFc，它们之中任何一个出现缺失都有可能导致育性下降或不育。
Y染色体微缺失在无精症或少精症患者中发病率在10-15%，已成为男性不育患者的常规检查项目。
图1，Y染色体AZF区结构示意图（AZFa区两端有两段原病毒序列、AZFb/c区内部有5个序列高度一致的大的回文结构，这些序列和结构导致相应染色体片段易发生同源重组，造成缺失或复制。
）欧洲男科学协会和欧洲分子遗传实验质控协作网（EAA/EMQN）2004年发表“Y染色体微缺失分子诊断指导意见”建议通过对各AZF区的共6个STS位点和两个对照位点检测Y染色体微缺失。
产品简介本剂盒通过“多重定量荧光PCR技术”（Multiplex Quantitative Fluorescent PCR），以一个高度复合的扩增体系中扩增至少15个Y染色体微缺失检测相关的位点，并根据各位点有无扩增产物及扩增产物剂量判断缺失类型。
对于Y染色体微缺失，由于各AZF区片段相对较小，常规核型分析等方法难以发现其缺失。
本项目采用的检测方法是：在各AZF区上分别选择具有序列特异性的多个位点，通过多重定量荧光PCR方法检测各位点。
根据有无扩增产物判定样本染色体是否包含所检测的序列特异性位点，进而推断样本染色体是否在位点所在AZF区域发生缺失；通过部分位点扩增产物相对剂量确定相关位点拷贝数比例，根据拷贝数比例推断相关位点对应区域是否发生缺失或复制，并对于AZFb和/或AZFc区部分缺失或复制，实现了首次检测。
欧洲男科学协会欧洲分子遗传质量协作网
欧洲男科学协会/欧洲分子遗传实验质控协作网Y染色体微缺失分子诊断操作指南 2004版（简要版）翻译：王毅1郭安亮1姚见儿1校阅：李铮21 上海透景生命科技有限公司2 上海第二医科大学附属仁济医院摘要在精子发生障碍引起的男性不育患者中，Y染色体微缺失的发生率仅次于Klinefelter 综合征（克氏综合征），是居于第二位的遗传因素。
Y染色体微缺失已成为无精子症和寡精子症不育患者的常规检查项目。
从1999年开始，欧洲男科学协会和欧洲分子遗传实验质控协作网为提高诊断质量，出版了Y染色体微缺失分子诊断指南，并提供了客观的质量评价实验方法。
最新版的实验室指南是根据2003年10月在佛罗伦萨举行的“Best Practice Meeting”的成果，在1999年版的基础上修订而成。
对于Y染色体微缺失的筛查，1999年版的指南被证明是准确、灵敏和易于操作的。
根据Y 染色体序列和微缺失机制的最新研究进展，1999年版的指南能够满足准确诊断的需要，实践证明是非常有效和合适的。
基因型与表型的关系整个AZFa区域缺失通常导致支持细胞综合征（SCO综合征）和无精子症。
如果整个AZFa 区域缺失，若想从睾丸中获得精子进行ICSI已不大可能。
整个AZFb和AZFb+c（P5/P1近端、P5/P1远端、P4/P1远端）缺失的典型特征是SCO 综合征或导致无精子症的精子发生阻滞。
研究显示，整个AZFa区域缺失的情况类似，这种病人在睾丸穿刺时也找不到精子。
与整个AZFa区域缺失情况一样，若整个AZFb或AZFb+c 缺失也不适宜睾丸穿刺获得精子。
因此，不推荐给这类病人施行ICSI。
AZFc缺失（b2/b4）的临床和睾丸组织学表型多种多样。
一般说来，AZFc缺失病人尚残存精子生成能力。
AZFc缺失见于无精子症或严重寡精子症患者，罕见情况下，也可以在自然状态下遗传给其男性后代。
在无精子症患者中，AZFc缺失者通过TESE获得精子的机会要好大得多，也可以进行ICSI受孕。
Y染色体微缺失检测指导
丫染色体微缺失是严重少精子或无精子症的重要原因，是导致男性不育的第二大遗传因素，其发生率仅次于Klinefelter综合征（克氏综合征）。
从1999年开始，欧洲男科学协会和欧洲分子遗传实验质控网（EAA/EMQN为提高诊断质量，出版了丫染色体微缺失分子诊断指南，并提供了客观的实验质量评价方法。
最新版的实验室指南是2013年9月EAA/EMQN根据12年的临床积累和专家共识，在1999版和2004版的基础上修订而成。
新指南重点阐明：在少精子症或无精子症男性中发现的丫染色体微缺失区域，主要是无精子因子（azoospermia factor，AZF）区域仅包含AZFa AZFb AZFbc AZFc和AZFabc区，独立的AZFd区并不存在；AZFc 区中gr/gr 缺失是影响精子生成的一个危险因素，但临床意义尚存争议，不作为常规检查指标；检测位点增加并不能提高检测灵敏度，反而可能使结果复杂化；基于两管多重PCR的检测方法仍适用于整个AZF缺失检测。
EAA/EMQN 12年国际质量评估计划（EQA计划）的实施表明，参与实验室通过规范实验操作，改善报告质量，可有效降低诊断错误率。
丫染色体微缺失在中国不育男性中的发生频率为11.5%，处于较高水平，我们建议将AZF检测作为男性严重少精子或无精子症的常规检测项目，呼吁国内AZF检测实验室加入EQA计划，完善中国丫染色体微缺失检测实验操作规范。
丫染色体微缺失分子检测在中国已开展多年，国内专家对AZF缺失模式、检测序列标签位点（sequenee- tagged site, STS的数量、检测方法和内部质量控制等临床问题未达成共识。
各实验室的诊断操作方法有很大不同，导致不准确或错误诊断时有发生，迫切需要建立丫染色体微缺失诊断标准和质量控制标准。
EAA/EMQN 更新的2013版指南对以上问题都给出了明确的专家共识，对我国建立自己的检测指南有重要的指导意义。
一、丫染色体微缺失发生频率丫染色体微缺失在健康人群中发生率约为1/4 000，但在不育男性中显着升高，微缺失发生频率为2%〜10%（甚至更高）。
中国人Y染色体微缺失分子诊断指南(草案)
中国人Y染色体微缺失分子诊断指南（草案）2005.4 上海前言在精子发生障碍引起的男性不育患者中，Y染色体微缺失的发生率仅次于Klinefelter’s syndrome(克氏综合征)，是居于第二位的遗传因素。
Y染色体微缺失已成为男性不育患者的常规检查项目。
欧洲男科学协会和欧洲分子遗传实验质控协作网为提高诊断质量，在1999年和2004年先后发布了第一版和第二版Y染色体微缺失分子诊断指南。
经过多年的临床实践证明该指南准确、灵敏和易于操作。
2005年4月在上海召开了中国人Y 染色体微缺失分子诊断的研讨会，成立了Y染色体微缺失分子诊断协作网。
会议在欧洲指南的基础上起草了符合目前我国男性不育诊疗现状，并反应最新生物技术发展的中国人Y染色体微缺失分子诊断指南。
本指南重点讨论Y染色体微缺失分子诊断具体实施时的标准化和规范化，推荐的相关方法和设计是根据欧洲指南和我国已有的实验研究基础上综合而成。
对机理研究和背景知识介绍部分在本指南中不再详细讨论。
男性不育症患者Y染色体微缺失分子筛查适应症常规检测的适应症：1、男性不育症患者选择单精子卵泡浆内注射（ICSI）或体外受精（IVF）生育子代前；2、非梗阻性无精子症患者；3、严重少精子症患者（精子数目少于5×106/ml）；4、无精子症患者进行睾丸活检术前；5、男性不育症患者（如精索静脉曲张）手术前；6、原因不明的男性不育症患者用药前。
推荐检测的适应症：1、少精子症患者（精子数目少于20×106/ml）；2、精子密度正常，但原因不明的男性不育症患者；3、男性不育伴隐睾和精索静脉曲张的患者；4、妻子有不明原因习惯性流产的患者。
诊断实验指南Y染色体上存在影响精子发生的无精子因子（AZF）区域，进一步可分为AZFa,AZFb和AZFc三个区域。
Y染色体微缺失分子诊断实验利用多重聚合酶链反应（multiplex－PCR）特异性扩增Y染色体AZF区域的序列标签位点（STS），扩增产物用电泳或杂交等方法进行检测。
Y染色体微缺失
精选课件ppt
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• 但进一步的统计分析表明只有高的 EGFR基
因拷贝数对应较高的存活率。
• 因此说明 , EGFR基因扩增可作为筛选 TKIs
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五 染色体微缺失相关基因研究的 意义
1 用于原发性无精或少弱精症的遗传咨询。 通过遗传病因诊断， 找到男性不育的遗传 病因， 则可避免不必要的药物及手术治疗。
2 进行辅助生育之前对其进行遗传病因诊断， 可尽量避免将不良基因传递给下一代
3 辅助生育精子质量筛选 4 为未来的基因治疗提供理论依据。
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四 Ｙ 染色体微缺失的检测方法
• 选择位于 Y染色体短臂 ( Y p ) 的睾丸决定基因( S RY ) 和
锌指蛋白基因( Z F X ／ Z F Y ) 为对照。Z F X ／ Z F Y 既存在于 x染色体短臂， 也存在于 Y p ， 其与 S R Y一 起构成2个 目前推荐使用 的参照基因。每个 A Z F区域至 少设置2个 S T S位点 才能正确有效.
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EGFR基因突变与 TKIs治疗敏感性
• 文献报道：肺癌细胞中 EGFR酪氨酸激酶编
码区基因突变是靶向药物奏效的一个必要 前提条件,研究结果显示,对 EGFR突变型 NSCLC, Gefitinib的有效率高达80%以上 ,而 对野生型肿瘤则基本无效。这一研究随后 被相继其它研究所证实。
• 近年来随着分子生物学技术的提高 ,产生了一些针对分子
靶点的抗肿瘤药物。这些药物针对性强 ,能特异性地杀伤 肿瘤细胞。
• 其中以表皮生长因子受体 ( epidermal growth factor
Y染色体微缺失及其检测方法
Y染色体微缺失及其检测方法高云;陈嘉昌;彭焕玉;朱振宇【摘要】全世界大约有15％的夫妇不育,其中男性不育约占50％.Y染色体长臂上的AZF缺失是导致男性不育的重要因素.AZF进一步分为AZFa、AZFb和AZFc 3个区域,不同区域的微缺失引起不同程度的精子发生障碍.因此Y染色体微缺失的检测对男性不育的诊治有很重要的指导意义.目前Y染色体微缺失常用的检测方法有多重定性PCR法、实时荧光PCR法、基因芯片法和荧光原位杂交法.【期刊名称】《分子诊断与治疗杂志》【年(卷),期】2011(003)005【总页数】4页(P326-329)【关键词】Y染色体微缺失;男性不育;AZF【作者】高云;陈嘉昌;彭焕玉;朱振宇【作者单位】中山大学中山医学院,广东,广州510080;中山大学达安基因诊断中心,广东,广州510665;中山大学达安基因诊断中心,广东,广州510665;中山大学中山医学院,广东,广州510080【正文语种】中文目前全世界大约有15%的夫妇不育，其中男性不育约占50%[1]。
引起男性不育的因素有很多，其中由Y染色体微缺失引起的生精障碍是导致男性不育的重要原因，表现为原发性无精子症（Azoospermia）或少精子症（Oligospermia）。
研究表明男性原发无精和少精症患者中大约有10%～15%存在Y染色体微缺失[2,3]。
1 Y染色体微缺失与男性不育1976年，Tiepolo等在1170例男性不育患者中发现6例无精子症患者存在显微镜下可见的Y染色体长臂缺失，于是提出Y染色体长臂上可能存在着控制精子生成的基因，并将其称为无精子症因子（azoospermia factor，AZF）。
1996年Vogot将 AZF 划分为AZFa、AZFb、AZFc 3个相互独立的区域（见图1[4]）。
各区域内包括若干AZF候选基因并主导精子形成过程中的不同阶段，它们的缺失或突变可能导致精子发生障碍，引起少精子症或无精子症。
Y染色体微缺失检测指导
Y染色体微缺失分子检测在中国已开展多年，国内专家对AZF缺失模式、检测序列标签位点(sequence–tagged site, STS)的数量、检测方法和内部质量控制等临床问题未达成共识。
各实验室的诊断操作方法有很大不同，导致不准确或错误诊断时有发生，迫切需要建立Y染色体微缺失诊断标准和质量控制标准。
EAA/EMQN更新的2013版指南对以上问题都给出了明确的专家共识，对我国建立自己的检测指南有重要的指导意义。
一、Y染色体微缺失发生频率Y染色体微缺失在健康人群中发生率约为1/4 000，但在不育男性中显着升高，微缺失发生频率为2%～10%(甚至更高)。
2013版指南指出Y染色体微缺失在中国不育男性中发生频率为11.5%，处于较高水平。
2006年朱晓斌等[1]针对中国不育男性染色体的研究表明AZF微缺失在非梗阻性无精子症患者中的发生率为9.94%，严重少精子症患者中发生率为5.82%，与国内外其他学者的研究基本一致。
随着微缺失分子机制的阐明和Y染色体男性特异区域的结构(MSY)测序完成，结合十多年临床数据分析，EAA专家总结沿用Repping等[2]对Y染色体微缺失区域的定义模式，分为：AZFa区缺失、AZFb区缺失、AZFbc区缺失和AZFc区缺失，认为只有该微缺失模式有明确的临床表现。
国内外学者对AZFd区缺失是否存在一直存有争议。
尽管发现在AZFb与AZFc两区域之间存在新的缺失位点(一些学者认为的AZFd区缺失)，但是该区域缺失没有明确的临床意义，也并非独立存在的缺失模式。
所以第四区域AZFd区缺失仍存在较多争议。
Müslümanolu等[3]在2005年的一项研究中指出AZFd缺失可能与精子形成有关，但仍缺乏有力的临床证据。
2013年，陈科等[4]在精子正常和轻度少精子症患者中都发现了假定的AZFd区缺失。
然而，至今为止AZFd区域尚未发现与精子生成相关的候选基因，其缺失所对应的临床表型还需进一步确认。
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中国人Y染色体微缺失分子诊断指南（草案）
2005.4 上海
前言
在精子发生障碍引起的男性不育患者中，Y染色体微缺失的发生率仅次于Klinefelter’s syndrome(克氏综合征)，是居于第二位的遗传因素。
Y染色体微缺失已成为男性不育患者的常规检查项目。
欧洲男科学协会和欧洲分子遗传实验质控协作网为提高诊断质量，在1999年和2004年先后发布了第一版和第二版Y染色体微缺失分子诊断指南。
经过多年的临床实践证明该指南准确、灵敏和易于操作。
2005年4月在上海召开了中国人Y 染色体微缺失分子诊断的研讨会，成立了Y染色体微缺失分子诊断协作网。
会议在欧洲指南的基础上起草了符合目前我国男性不育诊疗现状，并反应最新生物技术发展的中国人Y染色体微缺失分子诊断指南。
本指南重点讨论Y染色体微缺失分子诊断具体实施时的标准化和规范化，推荐的相关方法和设计是根据欧洲指南和我国已有的实验研究基础上综合而成。
对机理研究和背景知识介绍部分在本指南中不再详细讨论。
男性不育症患者Y染色体微缺失分子筛查适应症
常规检测的适应症：
1、男性不育症患者选择单精子卵泡浆内注射（ICSI）或体外受精（IVF）生育子代前；
2、非梗阻性无精子症患者；
3、严重少精子症患者（精子数目少于5×106/ml）；
4、无精子症患者进行睾丸活检术前；
5、男性不育症患者（如精索静脉曲张）手术前；
6、原因不明的男性不育症患者用药前。
推荐检测的适应症：
1、少精子症患者（精子数目少于20×106/ml）；
2、精子密度正常，但原因不明的男性不育症患者；
3、男性不育伴隐睾和精索静脉曲张的患者；
4、妻子有不明原因习惯性流产的患者。
诊断实验指南
Y染色体上存在影响精子发生的无精子因子（AZF）区域，进一步可分为AZFa,AZFb和AZFc三个区域。
Y染色体微缺失分子诊断实验利用多重聚合酶链反应（multiplex－PCR）特异性扩增Y染色体AZF区域的序列标签位点（STS），扩增产物用电泳或杂交等方法进行检测。
STS位点和PCR对照引物的设计原则
1、STS位点设计
AZF每个区域应设置2个STS位点，推荐以下6个STS位点为必须包含位点。
增加更多的位点或许有更多的科学发现，但其对临床指导意义有待进一步的探讨。
AZFa： sY84,sY86；
AZFb： sY127,sY134；
AZFc： sY254,sY255；
2、内部对照位点推荐如下：
sY14(SRY)和ZFX/ZFY，也可以选择Globin或G6PDH等其他看家基因作为内对照。
PCR方法
本指南推荐使用多重PCR技术。
由于多重PCR技术有内部互相对照的效果，可以分析阴性结果是否由操作失误引起，并提高效率，减少操作次数，减少出错可能。
对某些标本多重PCR结果有疑问时可选择单项PCR的方法。
本指南推荐每次PCR检测分成A、B两组进行。
每组包含AZFa、AZFb、AZFc区域各一对引物和两对内对照引物。
每组内的引物组合如下：
A组：sY14(SRY)、ZFX/ZFY、sY86、sY127、sY254
B组：sY14(SRY)、ZFX/ZFY、sY84、sY134、sY255
PCR扩增后检测方法
PCR扩增产物最常见的检测方法是琼脂糖凝胶电泳，本指南也予以推荐。
由于每个泳道有5条扩增产物，若其分子量相差太小，电泳时间将延长至几个小时甚至过夜。
为了提高效率，选择引物时注意各产物条带之间的长度差别是否足够大，电泳时间控制在1时以内比较合适。
PCR质量控制
Y染色体微缺失分子诊断实验操作要求严格按照相应分子诊断实验室规范和质量控制
的基本原则进行，合理的内对照和外部对照是控制实验质量的关键。
PCR时必须同时做外部阳性和阴性对照。
选择正常男性DNA样品为阳性对照，正常女性DNA样品为阴性对照，灭菌蒸馏水为空白对照。
实验结果的判断与优化
AZFc缺失是临床最常见的缺失类型。
若AZFc区域的sY254和sY255出现单个缺失，通常是实验错误所致。
如试剂设计不合理、标本保存或DNA抽提有问题。
AZFa区域的两个STS位点出现单个缺失非常罕见，在排除实验操作失误后，判断为AZFa 区域的部分缺失，但得出结论前应仔细复核。
AZFb区域情况类同。
对于PCR扩增，每个实验室应该结合各自的设备条件和DNA质量进行优化。
如果结果不明确或者怀疑技术方面失误，则应该重新扩增。
如果针对某一个特殊DNA标本，多重PCR体系效果不好，建议做单项PCR扩增。
同时也可以降低退火温度重复进行PCR扩增，至于循环次数并没有常规建议。
实验应该不断优化，直到结果清晰并且可重复为止。
Y染色体微缺失分子检测的临床意义
Y染色体微缺失遗传型与表型的关系已进行了大量研究，对临床有非常好的指导意义。
AZFa、AZFb和AZFc三个区域全部缺失的患者，100％表现为无精子症。
不可能通过任何手段从睾丸中获得精子。
AZFa区域整段缺失通常导致唯支持细胞综合征（SCO综合征），临床表现为无精子症。
如果诊断为整段AZFa区域缺失，若想从睾丸中获得精子进行ICSI已不大可能。
AZFb和AZFb+c整段缺失的典型睾丸组织学特征是SCO综合征或生精阻滞。
与AZFa区域整段缺失的情况类似，这种病人在睾丸穿刺时也找不到精子。
因此，不推荐给这类病人施行ICSI。
AZFc缺失的临床和睾丸组织学表型多种多样。
一般说来，AZFc缺失患者尚残存精子生成能力。
AZFc缺失见于无精子症或严重少精子症患者，罕见情况下，也可以在自然状态下遗传给其男性后代。
在无精子症患者中，AZFc缺失者通过TESE获得精子的机会要大得多，也可以进行ICSI受孕。
但这些患者的男性子代将是AZFc缺失的携带者。
另外，有研究发现AZFc区域缺失的少精子症患者，其精子数目有进行性下降的趋势，最后发展为无精子症。
因此，对AZFc区域缺失的少精子症患者,应及早进行治疗或将其精液
进行冷冻保存。
报告
Y染色体微缺失分子诊断结果应出具标准格式的打印报告，报告应包括以下内容：
1．实验室名称；
2．送检日期和报告日期；
3．患者信息如：姓名、出生日期和标本编号；
4．临床初步诊断；
5．标本种类（如：血液、精液等）；
6．采用方法（如：多重PCR扩增法）；
7．分析结果：推荐以表格形式描述不同的STS位点检测结果，避免采用“+”“—”来描述，因为这样容易误解，推荐采用文字（如：存在/缺失）来描述某位点的结果；
8．为了使临床医生更简洁地了解实验结果，并形象化地向病人解释，推荐实验报告中附电泳图和Y染色体的模式图。
建立质控网络（室间质控）
开展Y染色体微缺失检测的实验室应该加入相应的室间质控网络。
从质控中心的组织者获取的DNA标本应该与患者标本完全相同的方式处理，并出报告。
由于国内尚没有相应的质控网络，建议先以本次会议建立的Y染色体微缺失分子诊断协作网作为基础，探索建立区域性或全国性的质控网络。
附件1：报告单参考格式
附件2：检测申请单参考格式。