同位素稀释气相色谱_串联质谱法定量测定人体尿液中的硫二甘醇
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2 结果与讨论
2． 1 吸附剂与洗脱剂的选择 通常尿液中含有蛋白质、盐、尿素和尿酸等多种
成分，严重污染质谱的离子源系统，形成很高的检测 背景，使得微量目标化合物难以检出。固相萃取是 样品前处理的常用方法之一，选择适宜的固相萃取 操作步骤，不但可以祛除杂质干扰，而且可以使微量 的目标化 合 物 得 以 富 集，提 高 方 法 的 检 出 灵 敏 度。 由于 TDG 极性较大，用非极性吸附剂（ 如C18） 难以 将其从尿液中提取出来。考察了不同类型固相萃取 柱如 SAX（ 树脂基） 、SAX（ 硅胶基） 、HLB 及不同洗 脱条件（ 以乙酸乙酯、乙腈、甲醇等为洗脱剂） 对样 品中 TDG 富集净化效果的影响。研究表明，采用 HLB 固相萃取柱提取和甲醇洗脱时可获得较好的 回收率，并且在 TDG 和 D8 -TDG 的色谱峰出峰位置 无杂质干扰。结果见图 1。
［作者简介］ 冯建林，男，高级实验师，研究方向： 毒物分析 ［作者单位］ 军事医学科学院毒物药物研究所，北京 100850 ［通讯作者］ 刘 勤，Tel： 010-66930621，E-mail： Liuq@ yahoo． com． cn
等。鉴于溯源核查的需要，国际禁止化学武器组织 （ OPCW） 近年来已组织了两次生物医学样品分析的 国际实验室间盲样比对测试。硫二甘醇 （ TDG） 是 芥子气在体内的主要代谢产物之一，也是芥子气溯 源检测的重要目标化合物［1，2］。由于 TDG 极性大， 在水性基质中的分析难度也较大［3］，需要将 TDG 从 尿液或血液中提取并衍生化后用气相色谱 － 质谱分 析。Akubowski 等［4］分析尿样中的 TDG 时，将尿样 浓缩至近干后，用七氟丁酸醇（ HFBA） 衍生化，检测 限为 1 μg / L，此处理过程费时，残留的水分干扰衍 生化效果，但用HFBA衍生化的产物也可以用 PCI -
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军事医学 2013 年 2 月 第 37 卷 第 2 期 Mil Med Sci，Vol 37，No 2，Feb，2013
GC / MS 进行分析［5］。随着分析技术的快速发展，测 定尿液中芥子气代谢产物的方法也在不断被完善和 建立［6 ～ 8］。本文建立了定量测定人尿液中芥子气代 谢产物 TDG 的同位素稀释气相色谱 － 串联质谱法 （ GC-MS / MS） ，并应用于 OPCW 组织的两次生物医 学样品分析国际实验室间的盲样比对测试，取得了 良好的定性定量结果。
准偏差小于 10% 。结论 所建方法专属性强、灵敏度高。该法曾在国际禁止化学武器组织( OPCW) 举办的两次生
物医学样品分析国际实验室间的盲样比对测试中，取得了良好的定性定量结果。
ห้องสมุดไป่ตู้
［关键词］ 硫二甘醇; 同位素稀释; 气相色谱 － 串联质谱; 固相萃取; 生物医学样品
［中图分类号］ Q657． 63
虽然《禁止化学武器公约》（ 简称《公约》） 已经 签署了十余年，但是化学武器的危害仍将长期存在， 特别是日军在华遗留的大量化学武器，以芥子气居 多，它们将长期危害我国人民的身体健康，而且污染 环境。在对《公约》限定化合物的核查分析中，分析 检测的重点不仅包括毒剂原型及其相关物，而且还 包括中毒后其体内的代谢产物和生物大分子加合物
法( GC-MS / MS) 。方法 样品中的 TDG，经过 HLB 柱固相萃取( SPE) ，五氟苯甲酰氯( PFBC) 衍生化后，采用 GC-
MS / MS 选择反应监测模式分析，以氘代硫二甘醇( D8 -TDG) 为内标进行定量测定。结果 方法在 1 ～ 150 μg / L 范 围内线型关系良好( r = 0． 9997) ，最低检出限和定量限分别为 0． 1、0． 5 μg / L，回收率为 99． 5% ～ 108． 8% ，相对标
军事医学 2013 年 2 月 第 37 卷 第 2 期 Mil Med Sci，Vol 37，No 2，Feb，2013
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同位素稀释气相色谱 － 串联质谱法定量测定人体尿液中的硫二甘醇
冯建林，白海红，林 缨，陈 佳，刘 勤，李春正，唐吉军，吴弼东，谢剑炜
［摘要］ 目的 建立定量测定人体尿液中芥子气生物标志物硫二甘醇( TDG) 的同位素稀释气相色谱 － 串联质谱
色谱柱： DB-5 MS（ 30 m × 0． 25 mm × 0． 25 μm） ； 载 气： 氦气； 恒 流 模 式，流 速 0． 8 ml / min； 程 序 升 温： 100℃ 保持 1 min，以 25℃ / min 的速率升温至 280℃ ， 保持 5 min； 进样量： 1 μl； 进样口温度： 240℃ ； 传输线 温度： 260℃ 。 1． 3 质谱条件
［文献标志码］ A
［文章编号］ 1674-9960( 2013) 02-0135-03
DOI: 10． 7644 / j． issn． 1674-9960． 2013． 02． 013
A method for quantification of sulfur mustard biomarker thiodiglycol in human urine by isotope dilution gas chromatography-tandem mass spectrometry
* Corresponding author，Tel： 010-66930621，E-mail： Liuq@ yahoo． com． cn
［Abstract］ Objective To establish a quantitative analysis method for determination of sulfur mustard biomarker thiodiglycol （ TDG） in human urine． Methods The analyte was purified and concentrated from urine on an HLB solid phase extraction（ SPE） cartridge，derivatized with pentafluorobenzoyl chloride（ PFBC） ，and analyzed by isotope dilution gas chromatography-tandem mass spectrometry （ GC-MS / MS） in the selected reaction monitoring mode． The quantitative analysis was performed using deuterated D8 -thiodiglycol（ D8 -TDG） as the internal standard． Results A good linear relationship was obtained within the quantitative concentration range of 1 to 150 g / L （ r = 0． 9997） ． The limit of detection （ LOD） and the limit of quantification （ LOQ） of TDG in urine were 0． 1 g / L and 0． 5 g / L，respectively． The recovery for TDG ranged from 99． 5% to 108． 8% in urine with RSD less than 10% ． Conclusion Such an GC-MS / MS established for the detection of TDG in human urine is highly specific and sensitive． The method is used in the first and the second confidence building exercise for biomedical sample analysis organized by the Organisation for the Prohibition of Chemical Weapons （ OPCW） and all quantitative results of TDG are very close to the actual spiking levels． ［Key words］ thiodiglycol； isotope dilution； GC-MS / MS； solid phase extraction； biomedical samples
三重四极杆质量分析器； 电离方式： EI； 电离能 量： 70 eV； 离子源温度： 220℃ ； 四极杆温度： 150℃ ； 碰撞气： 氩气； 碰撞能量： 15 V； 采用选择反应监测 （ SRM） 模式，TDG： m/ z 298→85，D8-TDG： m/ z 305→90。
1． 4 样品制备 取尿液 0． 5 ml，添加 200 ng D8 -TDG 作为内标，
图 1 TDG 和 D8 -TDG 五氟苯甲酰氯衍生物的色谱图 A． TDG 标准品； B． 尿液样品（ TDG 100 μg / L）
2． 2 标准曲线的建立及最低检出限的确定 配制 TDG 浓度分别为 1、5、10、50、100、150 μg / L
的尿液样品，按照 1． 4 项方法处理后进行 GC-MS / MS 分 析。以 尿 样 中 TDG 的 浓 度 （ X） 为 横 坐 标， TDG 和内标 D8 -TDG 的 PFBC 衍生物的峰面积之比 （ Y） 为 纵 坐 标 绘 制 标 准 曲 线。结 果 表 明，TDG 在 1 ～ 150 μg / L 浓度范围内呈良好线性关系，线性方 程为 Y = 0． 021X － 0． 03 （ r = 0． 9997） 。方法最低检 出限为 0． 1 μg / L（ 信噪比为 5 ∶ 1 ） ，定量限为 0． 5
1 材料与方法
1． 1 仪器与试剂 Thermo TRACE GC Ultra-TSQ QUANTUM GC 气
相色谱 － 三重四极杆串联质谱仪 （ 美国 Thermo） ； BF-2000 型氮气吹干仪（ 八方世纪） ； Oasis HLB 固相 萃取柱（ 美国 Waters） ； TDG 和五氟苯甲酰氯（ PFBC， 美国 Sigma） ； 氘代硫二甘醇（ D8 -TDG） 购自美国坎 布里奇同位素实验室； 人工尿液（ 英国 Newtownards） 。 甲醇、乙腈、乙酸乙酯均为色谱纯（ J． T． Baker） ； 实 验用水由 Milli-Q 超纯水制备系统制得。 1． 2 色谱条件
FENG Jian-lin，BAI Hai-hong，LIN Ying，CHEN Jia，LIU Qin* ，LI Chun-zheng，TANG Ji-jun， WU Bi-dong，XIE Jian-wei
（ Institute of Pharmacology and Toxicology，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850，China）
涡旋混匀上样于 HLB 固相萃取柱（ 固相萃取柱在样 品上样前先依次用 5 ml 甲醇和 5 ml 去离子水活化， 抽干后备用） 。用 2 ml 去离子水淋洗，抽干； 再用 3 ml甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液于 5 ml 离心试 管 中，放入氮气吹干仪 50℃ 吹干； 向吹干后的样品中 依次加入 80 μl 甲苯∶ 三乙胺（ 50 ∶ 50） 溶液和 20 μl PFBC，涡 旋 混 匀，室 温 放 置 5 min （ 衍 生 化） ； 加 入 400 μl 甲苯及 1 ml 磷酸盐缓冲液（ 0． 5 mol / L，pH 10） ，涡旋混匀后离心（ 2000 r / min） 3 min； 移出有机 相，取 1 μl 进样分析。
2． 1 吸附剂与洗脱剂的选择 通常尿液中含有蛋白质、盐、尿素和尿酸等多种
成分，严重污染质谱的离子源系统，形成很高的检测 背景，使得微量目标化合物难以检出。固相萃取是 样品前处理的常用方法之一，选择适宜的固相萃取 操作步骤，不但可以祛除杂质干扰，而且可以使微量 的目标化 合 物 得 以 富 集，提 高 方 法 的 检 出 灵 敏 度。 由于 TDG 极性较大，用非极性吸附剂（ 如C18） 难以 将其从尿液中提取出来。考察了不同类型固相萃取 柱如 SAX（ 树脂基） 、SAX（ 硅胶基） 、HLB 及不同洗 脱条件（ 以乙酸乙酯、乙腈、甲醇等为洗脱剂） 对样 品中 TDG 富集净化效果的影响。研究表明，采用 HLB 固相萃取柱提取和甲醇洗脱时可获得较好的 回收率，并且在 TDG 和 D8 -TDG 的色谱峰出峰位置 无杂质干扰。结果见图 1。
［作者简介］ 冯建林，男，高级实验师，研究方向： 毒物分析 ［作者单位］ 军事医学科学院毒物药物研究所，北京 100850 ［通讯作者］ 刘 勤，Tel： 010-66930621，E-mail： Liuq@ yahoo． com． cn
等。鉴于溯源核查的需要，国际禁止化学武器组织 （ OPCW） 近年来已组织了两次生物医学样品分析的 国际实验室间盲样比对测试。硫二甘醇 （ TDG） 是 芥子气在体内的主要代谢产物之一，也是芥子气溯 源检测的重要目标化合物［1，2］。由于 TDG 极性大， 在水性基质中的分析难度也较大［3］，需要将 TDG 从 尿液或血液中提取并衍生化后用气相色谱 － 质谱分 析。Akubowski 等［4］分析尿样中的 TDG 时，将尿样 浓缩至近干后，用七氟丁酸醇（ HFBA） 衍生化，检测 限为 1 μg / L，此处理过程费时，残留的水分干扰衍 生化效果，但用HFBA衍生化的产物也可以用 PCI -
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军事医学 2013 年 2 月 第 37 卷 第 2 期 Mil Med Sci，Vol 37，No 2，Feb，2013
GC / MS 进行分析［5］。随着分析技术的快速发展，测 定尿液中芥子气代谢产物的方法也在不断被完善和 建立［6 ～ 8］。本文建立了定量测定人尿液中芥子气代 谢产物 TDG 的同位素稀释气相色谱 － 串联质谱法 （ GC-MS / MS） ，并应用于 OPCW 组织的两次生物医 学样品分析国际实验室间的盲样比对测试，取得了 良好的定性定量结果。
准偏差小于 10% 。结论 所建方法专属性强、灵敏度高。该法曾在国际禁止化学武器组织( OPCW) 举办的两次生
物医学样品分析国际实验室间的盲样比对测试中，取得了良好的定性定量结果。
ห้องสมุดไป่ตู้
［关键词］ 硫二甘醇; 同位素稀释; 气相色谱 － 串联质谱; 固相萃取; 生物医学样品
［中图分类号］ Q657． 63
虽然《禁止化学武器公约》（ 简称《公约》） 已经 签署了十余年，但是化学武器的危害仍将长期存在， 特别是日军在华遗留的大量化学武器，以芥子气居 多，它们将长期危害我国人民的身体健康，而且污染 环境。在对《公约》限定化合物的核查分析中，分析 检测的重点不仅包括毒剂原型及其相关物，而且还 包括中毒后其体内的代谢产物和生物大分子加合物
法( GC-MS / MS) 。方法 样品中的 TDG，经过 HLB 柱固相萃取( SPE) ，五氟苯甲酰氯( PFBC) 衍生化后，采用 GC-
MS / MS 选择反应监测模式分析，以氘代硫二甘醇( D8 -TDG) 为内标进行定量测定。结果 方法在 1 ～ 150 μg / L 范 围内线型关系良好( r = 0． 9997) ，最低检出限和定量限分别为 0． 1、0． 5 μg / L，回收率为 99． 5% ～ 108． 8% ，相对标
军事医学 2013 年 2 月 第 37 卷 第 2 期 Mil Med Sci，Vol 37，No 2，Feb，2013
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同位素稀释气相色谱 － 串联质谱法定量测定人体尿液中的硫二甘醇
冯建林，白海红，林 缨，陈 佳，刘 勤，李春正，唐吉军，吴弼东，谢剑炜
［摘要］ 目的 建立定量测定人体尿液中芥子气生物标志物硫二甘醇( TDG) 的同位素稀释气相色谱 － 串联质谱
色谱柱： DB-5 MS（ 30 m × 0． 25 mm × 0． 25 μm） ； 载 气： 氦气； 恒 流 模 式，流 速 0． 8 ml / min； 程 序 升 温： 100℃ 保持 1 min，以 25℃ / min 的速率升温至 280℃ ， 保持 5 min； 进样量： 1 μl； 进样口温度： 240℃ ； 传输线 温度： 260℃ 。 1． 3 质谱条件
［文献标志码］ A
［文章编号］ 1674-9960( 2013) 02-0135-03
DOI: 10． 7644 / j． issn． 1674-9960． 2013． 02． 013
A method for quantification of sulfur mustard biomarker thiodiglycol in human urine by isotope dilution gas chromatography-tandem mass spectrometry
* Corresponding author，Tel： 010-66930621，E-mail： Liuq@ yahoo． com． cn
［Abstract］ Objective To establish a quantitative analysis method for determination of sulfur mustard biomarker thiodiglycol （ TDG） in human urine． Methods The analyte was purified and concentrated from urine on an HLB solid phase extraction（ SPE） cartridge，derivatized with pentafluorobenzoyl chloride（ PFBC） ，and analyzed by isotope dilution gas chromatography-tandem mass spectrometry （ GC-MS / MS） in the selected reaction monitoring mode． The quantitative analysis was performed using deuterated D8 -thiodiglycol（ D8 -TDG） as the internal standard． Results A good linear relationship was obtained within the quantitative concentration range of 1 to 150 g / L （ r = 0． 9997） ． The limit of detection （ LOD） and the limit of quantification （ LOQ） of TDG in urine were 0． 1 g / L and 0． 5 g / L，respectively． The recovery for TDG ranged from 99． 5% to 108． 8% in urine with RSD less than 10% ． Conclusion Such an GC-MS / MS established for the detection of TDG in human urine is highly specific and sensitive． The method is used in the first and the second confidence building exercise for biomedical sample analysis organized by the Organisation for the Prohibition of Chemical Weapons （ OPCW） and all quantitative results of TDG are very close to the actual spiking levels． ［Key words］ thiodiglycol； isotope dilution； GC-MS / MS； solid phase extraction； biomedical samples
三重四极杆质量分析器； 电离方式： EI； 电离能 量： 70 eV； 离子源温度： 220℃ ； 四极杆温度： 150℃ ； 碰撞气： 氩气； 碰撞能量： 15 V； 采用选择反应监测 （ SRM） 模式，TDG： m/ z 298→85，D8-TDG： m/ z 305→90。
1． 4 样品制备 取尿液 0． 5 ml，添加 200 ng D8 -TDG 作为内标，
图 1 TDG 和 D8 -TDG 五氟苯甲酰氯衍生物的色谱图 A． TDG 标准品； B． 尿液样品（ TDG 100 μg / L）
2． 2 标准曲线的建立及最低检出限的确定 配制 TDG 浓度分别为 1、5、10、50、100、150 μg / L
的尿液样品，按照 1． 4 项方法处理后进行 GC-MS / MS 分 析。以 尿 样 中 TDG 的 浓 度 （ X） 为 横 坐 标， TDG 和内标 D8 -TDG 的 PFBC 衍生物的峰面积之比 （ Y） 为 纵 坐 标 绘 制 标 准 曲 线。结 果 表 明，TDG 在 1 ～ 150 μg / L 浓度范围内呈良好线性关系，线性方 程为 Y = 0． 021X － 0． 03 （ r = 0． 9997） 。方法最低检 出限为 0． 1 μg / L（ 信噪比为 5 ∶ 1 ） ，定量限为 0． 5
1 材料与方法
1． 1 仪器与试剂 Thermo TRACE GC Ultra-TSQ QUANTUM GC 气
相色谱 － 三重四极杆串联质谱仪 （ 美国 Thermo） ； BF-2000 型氮气吹干仪（ 八方世纪） ； Oasis HLB 固相 萃取柱（ 美国 Waters） ； TDG 和五氟苯甲酰氯（ PFBC， 美国 Sigma） ； 氘代硫二甘醇（ D8 -TDG） 购自美国坎 布里奇同位素实验室； 人工尿液（ 英国 Newtownards） 。 甲醇、乙腈、乙酸乙酯均为色谱纯（ J． T． Baker） ； 实 验用水由 Milli-Q 超纯水制备系统制得。 1． 2 色谱条件
FENG Jian-lin，BAI Hai-hong，LIN Ying，CHEN Jia，LIU Qin* ，LI Chun-zheng，TANG Ji-jun， WU Bi-dong，XIE Jian-wei
（ Institute of Pharmacology and Toxicology，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850，China）
涡旋混匀上样于 HLB 固相萃取柱（ 固相萃取柱在样 品上样前先依次用 5 ml 甲醇和 5 ml 去离子水活化， 抽干后备用） 。用 2 ml 去离子水淋洗，抽干； 再用 3 ml甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液于 5 ml 离心试 管 中，放入氮气吹干仪 50℃ 吹干； 向吹干后的样品中 依次加入 80 μl 甲苯∶ 三乙胺（ 50 ∶ 50） 溶液和 20 μl PFBC，涡 旋 混 匀，室 温 放 置 5 min （ 衍 生 化） ； 加 入 400 μl 甲苯及 1 ml 磷酸盐缓冲液（ 0． 5 mol / L，pH 10） ，涡旋混匀后离心（ 2000 r / min） 3 min； 移出有机 相，取 1 μl 进样分析。