实验三 病原菌的分离培养

高压灭菌锅操作过程
加水装锅盖盖加热当压力升为
0.5kg/cm2时排放冷空气正式升压保压
（1.1kg/cm2，121℃，保持20-30min）停止加热
自然降压至零排放余汽开盖取出灭菌物品
趁热摆斜面检验灭菌效果。
（三）平板固体培养基制作 1.称取一定量的营养琼脂到250ml的三角瓶中. 2. 加入100mL水. 3.塞上硅胶塞,用牛皮纸包扎好; 4.高压蒸汽灭菌
(4) 将病组织放人70％酒精中浸3—5s后，按无菌操作法将 病组织移人0．1％升汞液中分别表面消毒0．5、1、2、3、 5rain(也可使用其他表面消毒剂)，如植物组织柔嫩，则表 面消毒时间宜短；反之则可长些。然后放入灭菌水中连续 漂洗三次，除去残留的消毒剂。 提示：先用70％的酒精浸2、3s是为了消除寄主表面 的气泡，减少表面张力，70％的酒精亦用于表面消毒，处 理的时间较短(一般数秒至lmin)。升汞溶液消毒的时间因 材料而异，可自30s至30min不等，一般情况下，需时间3， 5min。

(5) 用无菌操作法将病组织移至平板培养基上，每皿内放4--6块。 提示：在将病组织小块移放到平板表面之前，应将其在无菌吸 水纸上吸去多余的水，以大大减少病组织附近出现细菌污染。
(6) 将培养皿倒臵放人25。C左右恒温箱内培养。一般3—4d 后观察待分离菌生长结果。 (7) 若病组织小块上均长出较为一致的菌落，则多半为要 分离的病原菌。在无菌条件下，用接种针(铲)自菌落边缘 挑取小块移入斜面培养基上，在25℃左右恒温箱内培养， 数日后，观察菌落生长情况，如无杂菌生长，即得该分离 病菌纯菌种，便可臵于冰箱中保存。 提示：除根据菌落的一致性初步确定长出的菌落是否 目标菌外，还要在显微镜下检查，进一步确定。如果是对 未知病原菌的组织分离，则要将长出的菌落分别转出，通 过进一步的接种实验明确哪一种为其病原菌。在组织分离 工作中，如果植物材料体积较大且较软(如患灰霉病的番 茄果实)，在分离过程中可直接挖取内部患病组织移人平 板培养基上，完成分离工作。
5.灭菌后,当培养基冷却至50℃左右时,倾注平
皿(每100ml可制备5-6个平皿)
6.凝固后放冰箱备用
倒平板
约50℃ 灼烧灭菌， 防止瓶口的微生物污染培养基
防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染
（四）斜面培养基制作
1.称取一定量的营养琼脂到100ml的三角瓶中.
2. 加入100mL水.
3. 放入水浴锅内溶解.
2.
三、试剂与仪器

1、马铃薯
2、仪器：培养皿、高压蒸汽灭菌锅、可调式电炉、
铝锅、搅拌棒、三角瓶、烧杯、量筒、纱布、棉花、
天平、超净工作台、培养箱、吸管、吸水纸、解剖 刀、酒精灯、火柴、记号笔

3、试剂：葡萄糖、琼脂、 70％酒精、乳酸 4、材料：病斑
四、实验步骤
（一） PDA培养基的配制 配方：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，水1000mL， pH值自然。 1、称量和熬煮 药品实际用量计算后，按培养基配方逐 一称取去皮土豆。土豆切成小块放入锅中，加水1000ml， 在加热器上加热至沸腾，维持20－30min，用可用2层纱布 趁热在量杯上过滤，滤渣弃取。滤液补充水分到1000ml。 2、加热溶解 把滤液放入锅中，加入葡萄糖20g，琼脂 15～20g（提前搞碎），然后放在石棉网上，小火加热， 并用玻棒不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，待琼脂完全溶 解后，再补充水分至所需量。 3、分装 按实验要求，将配制的培养基分装入试管或 500ml三角瓶内。分装时可用三角漏斗以免使培养基沾在 管口或瓶口上造成污染。
(六)真菌、细菌培养性状观察 待培养2～3天后，观察培养皿中真菌的形态， 记载以下内容：菌落颜色、菌丛密集及繁茂程度、 菌落隆起情况、是否有色素分泌出来而渗透到培养 基中、菌落生长速度快慢等。同时要记载培养基种
菌落边缘形状、菌落表面是光亮还是粗糙或有皱折、
类和培养温度、光照条件。
作业
1、上交分离的病原真菌、细菌菌种。 2、写出病原真菌、细菌培养性状观察 的实验报告。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
（二）灭菌与消毒

任何一种培养基一经制成就应及时彻底灭菌，以备纯培 养用。一般培养基的灭菌采用高压蒸汽灭菌。 常用的灭菌的方法有：干热灭菌、高压蒸汽灭菌、常压 蒸汽灭菌、常压间歇式灭菌超高温灭菌、过滤除菌、辐

射灭菌、化学药品灭菌等方法。

本实验培养基的灭菌常使用的是高压蒸汽灭菌，它是利 用高温湿热空气使菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的。
实验三 病原菌的分离培养
一、目的要求

1、了解培养基的配制原理，掌握培养基的制备方法； 2、学习灭菌与消毒的基本原理及应用范围，学习高压 蒸汽灭菌锅的操作方法；

3、了解分离和纯化微生物的基本原理及方法； 4、掌握倒平板的方法和组织分离、基本操作技术； 5、掌握在平板培养基上培养病原菌及观察其培养性状 的方法。
二、实验原理
1.
培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。不同微生物 对营养物质的要求各不相同，加之实验和研究的目的不同，所 以培养基的种类很多，使用的原料也各有差异，但从营养角度 分析，培养基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、无机盐、 生长素以及水分等。另外，培养基还应具有适宜的pH值、一定 的缓冲能力、一定的氧化还原电位及合适的渗透压。 培养基按成分可分为天然培养基、合成培养基和半合成培养基； 按物理状态可分为固体培养基、半固体培养基（0.2%～0.5%的 琼脂）和液体培养基；按用途可分为基础培养基、营养培养基、 鉴别培养基和选择培养基等。
注：试管加棉塞(最好)
培养基分装完毕以后，在管口
上加一个棉塞。棉塞能防止杂菌污染，保证通气良好。
加棉塞时，应使棉塞长度的2/3在试管口内，如下图所示。
（五）病原真菌的分离培养
1．组织分离法 按照以下步骤进行：
(1) 取灭菌培养皿一个，在皿盖上用玻璃铅笔注明分离日期、材料 和分离人的姓名。 提示：为了保证无菌操作，应注意下面几点：工作前最好将 所需的物品都放在超净工作台内，工作中临时去取容易带来杂菌； 保证工作人员自身的洁净，工作前用肥皂洗手；无菌操作前还要 用70％酒精擦拭双手；工作中，特别在使用无菌操作间时，呼吸 要轻，不要说话。 (2) 取真菌叶斑病的新鲜病叶(或其他分离材料)，选择典型的单个 病斑，用解剖刀从病斑边缘(病健交界处)切取小块(边长3--4mm)病 组织数块。 提示：选择新患病的组织作为分离的材料，可以减少腐生菌 混入的机会。腐生菌一般在发病很久而已经枯死或腐败的部分滋 生，因此，一般斑点病害应在临近健全组织的部分分离。
4. 在空试管内倒入2～3mL已经溶解好的培养基，
【注意尽量不要让培养基沾到试管口】塞好硅胶
塞. 5.放入烧杯中,高压蒸汽灭菌. 6.摆斜面,凝固后放冰箱备用.
用于活化菌种， 或培养菌种的斜面
用于保存菌种的斜面
搁置斜面
当培养基冷却至50℃左右时，将试管带棉塞的一
端搁在一根木棒上。搁置的长度要合适，使培养基形成的 斜面的长度不超过试管总长的一半。