第3章抗体制备
3-第三章 第一节-免疫球蛋白
2019/10/10
浙中大 微免教研室 刘文洪
免疫球蛋白的结构
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2. 轻链（light chain, L链）
•根据恒定区氨基酸组成和排列顺序不同分为两型：(type) κ、λ （不同物种，比例有差异）
•正常人血清免疫球蛋白κ:λ =2:1 •小鼠κ:λ =20:1
构的差异，抗原表位亦不同，成为免疫球蛋白的异质性。
2. 异质性表现方面：
（1）同种型：异种诱导免疫应答 （2）同种异型：异种、同种不同个体间诱导免疫应答 （3）独特型：异种、同种不同个体、自身体内间诱导免疫应答
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三、免疫球蛋白的生物学活性
（一）中和效应
免疫球蛋白（immunoglobulin, Ig）: 具有抗体活
性或化学结构与抗体相似的球蛋白。
抗体（antibody, Ab）：是B淋巴细胞或记忆B细胞接
受抗原激活后增殖分化为浆细胞所产生的能与相应抗原特 异性结合的免疫球蛋白。
Ig
Ig
B
P
特异性结合（ Ig活性）
分布：血清、组织液、外分泌液及某些细胞膜表面
轻链包括VL和CL两个结构域,重链含有1个VH和34个CH结构域。
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结构域（功能区—图）
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（四）多聚体及其辅助结构
1.连接链（joining chain，J链)：富含半胱氨酸的多肽链，
第三章免疫分析法
二亚胺为连接剂实现药物和载体蛋白的连接
实验原理 双抗体夹心法
➢ 双抗体夹心法，属于非竞争结合测定。 它是检测抗原最常用ELISA，适用于检测分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原。
➢ 其基本工作原理是：利用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别及样品中被检测抗原分子上两个抗原决定簇 结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物。复合物的形成量与待测抗原的含量成正比。测定复合物中的酶 作用于加入的底物后生成的有色物质量(OD值)，即可确定待测抗原含量。
什么叫免疫分析？ ➢ 基于抗原和抗体的特异性反应进行检测的一种技术手段。抗原抗体反应是指抗原及相应的抗体之间发生的
特异性结合反应。它既可以发生在体内，也可以发生在体外。 ➢ 在体内发生的抗原抗体反应为体液免疫应答的效应作用。体外的抗原抗体结合反应主要用于抗原或抗体的
检测，用于免疫学诊断。
在药物分析中，免疫分析法的应用主要集中在以下几方面：
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试血及效价测定 • 家兔的试血通常可由耳缘静脉取血，取血量0.5ml。 • 不同稀释度的抗血清和1%的血细胞悬液按1:1混合，37℃保温2h后观测血细胞的凝聚情况，即可测得免
疫血清的效价。
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（2）单克隆抗体 • 单克隆抗体是建立在经细胞融合而获得的杂交瘤细胞基础上的。所获得的抗体具有均一的特异性。 • 高度均质性的特异性抗体，由一个识别单一抗原表位的B细胞克隆所分泌。一般来自杂交瘤细胞 • 细胞培养法 & 接种动物体内生产法
《抗体制备过程》课件
免疫动物的筛选
选择合适的动物种类： 如小鼠、大鼠、兔子
等
确定动物的健康状况： 确保动物健康，无疾
病
确定动物的年龄：选 择合适的年龄，如成
年动物
确定动物的性别：选 择合适的性别，如雌
性动物
确定动物的免疫状态： 选择免疫状态良好的
动物
确定动物的遗传背景： 选择遗传背景合适的
动物
确定动物的饲养条件： 确保动物饲养条件良
免疫佐剂的选择原则：根据抗 原性质、免疫途径、实验目的 等因素选择
免疫佐剂的优化方法：通过实 验筛选最佳浓度、组合方式等
抗体纯化技术的优化
亲和层析法： 利用抗体与抗 原的特异性结 合，实现抗体
的纯化
离子交换层析 凝胶过滤层析
法：利用抗体 法：利用抗体
与离子交换树 分子大小不同，
脂的相互作用， 实现抗体的纯
抗体应用
医学领域：用于诊 断和治疗疾病
生物技术领域：用 于基因工程和生物 制药
食品工业：用于食 品检测和食品安全
环境监测：用于环 境污染物检测和监 测
抗体制备过程
免疫原的制备
免疫原选择：选择合适的抗原或半抗原 免疫原纯化：通过纯化技术去除杂质 免疫原处理：对免疫原进行化学修饰或物理处理 免疫原保存：在适当的条件下保存免疫原，防止降解或变质
免疫原的纯化： 去除杂质，提 高抗原的纯度
免疫原的浓度： 选择合适的抗 原浓度，以提 高抗体的产量
和质量
免疫原的保存： 选择合适的保 存方法，如低 温保存、干燥 保存等，以保 持抗原的活性
和稳定性
免疫佐剂的选用与优化
免疫佐剂的作用：增强免疫反 应，提高抗体产量
免疫佐剂的种类：铝盐、脂质 体、核酸等
第三章 抗体
Complement Binding Site Binding to Fc Receptors Placental Transfer
三、免疫球蛋白的水解片段
1. 木瓜蛋白酶（Papain）（将重链于近氨基端切断） Fab段（fragment of antigen- binding，抗原结合片 段） Fab段可以与抗原结合，具有抗体的活性。 Fc段（fragment crystalizable，可结晶片段） Fc段不能与抗原结合，但可执行Ig的其他生物学功 能。
Origin of Secretory Component of sIgA
四、IgD 1.单体分子 2.存在形式：分泌性 — 血清中，功能不清； 膜结合性 — B细胞表面, 3.意义 （1）是B细胞成熟的重要标志； （2）抗原受体，对B细胞活化、增殖和分化起调节 作用； 4.占血清Ig含量的1%； 5.半衰期3天。
IgG1 (kappa)
IgM (kappa)
（二）同种异型（allotype）
同一种属不同个体之间免疫球蛋白也具有的差 异性，主要反映在分子的CH和CL上的一个或数个 氨基酸的差异 (genetic markers — 遗传标志)。 Gm因子：Gm1～30 Am因子：A2m1，A2m2 IgG1 (kappa) IgG1 (kappa) Person 1 Person 2 Km因子：Km1，Km2，Km3
概念
1. 抗体（antibody, Ab）功能性概念 是由抗原刺激而产生并能与刺激其产生的抗 原发生特异性结合的、具有免疫功能的糖蛋白。 抗体主要存在血清中，也存在于如呼吸道粘膜液、 小肠粘膜液、唾液以及乳汁等其它体液中。 2. 免疫球蛋白（immunoglobulin, Ig）结构性概念 具有抗体活性或化学结构与抗体分子相似的 球蛋白。
第三章抗体123
（二）免疫球蛋白的水解片段
胃蛋白酶(pepsin)裂解IgG：得到一个具 有双价活性的F（ab’）2段和若干个小 分子多肽碎片（pFc’）。
（三）免疫球蛋白的功能区
Ig的H链、L链每隔110个氨基酸即由链 内二硫键连接形成一个能行使特定功能 的球性单位，称为Ig的结构域或功能区 （domain）。
C区的功能：
Fc片段的生物学活性：该片段无结合抗原 活性，但与抗体分子的生物学活性有密切 关系： 1、选择性地通过胎盘； 2、与补体结合活化补体； 3、决定Ig分子的亲细胞性(即与带Fc受体
细胞的结合)； 4、Ig通过粘膜进入外分泌液等都是Fc片段
的功能。
补体结合位点位于CH2上；Fc受体结合
位点在CH3上。
(1) B细胞的制备：可用提纯的抗原免疫 Balb/c或其他品系小鼠，免疫2-3次间隔24周，最后一次免疫后3-4d，取小鼠脾脏， 制成103/ml的脾细胞悬液，即为亲本的B 细胞。
(2) 骨髓瘤细胞的制备：用与免疫相同品系 小鼠的骨髓瘤细胞，要求其本身不能分 泌Ig，而且具有某种营养缺陷，可用 SP2/0或NS-1，它们缺少次黄嘌呤--鸟嘌 呤磷酸核糖转移酶，不能在HAT培养基 上生长。
4. J链和分泌片
J链是一条多肽链，富含半胱氨酸，由浆 细胞合成，以二硫键的形式共价结合到Ig 的重链上。
分泌片：由黏膜上皮细胞合成和分泌， 以非共价形式结合到二聚体上，保护IgA， 使之不受环境中酶的破坏，并介导IgA的 转运。
（二）免疫球蛋白的水解片段
木瓜蛋白酶(papain)水解IgG：得到两个相 同的Fab段和一个Fc段。
3、基因工程抗体：利用基因工程技术来 制备的抗体分子称为基因工程抗体，是 分子水平的抗体。
第3章免疫原和抗血清的制备
第3章免疫原和抗血清的制备免疫原是指能够引起机体免疫反应并激发产生特异性抗体的物质。
抗血清是指动物或人体经过免疫后所产生的含有抗体的血清。
免疫原和抗血清的制备是研究免疫学和生物制剂开发的重要环节。
本文将探讨免疫原和抗血清制备的一般原则和步骤。
1.免疫原的选择选择合适的免疫原对于制备高效的抗血清至关重要。
一般来说，免疫原应具备以下特点：(1)纯度：免疫原应具有尽可能高的纯度，以避免其他成分对免疫反应的干扰。
(2)特异性：免疫原应具有与所需抗体特异性结合的能力，以激发特异性抗体的产生。
(3)免疫原性：免疫原应具有足够的免疫原性，即能够引起机体的免疫反应。
(4)安全性：免疫原应具备足够的安全性，避免潜在风险。
根据不同的应用需求，免疫原可以是多种类型的物质，如蛋白质、多肽、核酸和糖类等。
选择合适的免疫原需要根据研究目的和预期应用来确定。
2.免疫原的制备免疫原的制备通常分为化学合成和生物提取两种方式。
(1)化学合成：对于小分子的免疫原，可以通过化学合成的方法合成。
例如，对于多肽免疫原，可以设计并合成相应的多肽序列。
化学合成的优势在于可以精确控制免疫原的结构和纯度。
(2)生物提取：对于大分子的免疫原，如蛋白质和核酸，通常采用生物提取的方法。
蛋白质可以通过基因工程技术在大肠杆菌等表达系统中表达并纯化得到。
核酸可以通过DNA重组技术合成。
3.免疫反应的诱导免疫反应的诱导是指向机体注射免疫原以激发免疫反应。
免疫反应的诱导通常包括以下步骤：(1)免疫原的给药：将免疫原通过注射、给药或吸入等方式引入机体内。
(2)辅助剂的使用：为了增强免疫反应效果，通常会添加辅助剂。
辅助剂可改变免疫原的物理性质和免疫反应的过程。
(3)免疫程序的设计：根据需求设计免疫程序，包括免疫原的剂量、注射间隔和免疫次数等。
抗血清的制备是通过免疫动物或人体以获得抗体，从而制备含有抗体的血清。
一般来说，抗血清的制备包括以下步骤：(1)免疫动物的选择：选择合适的免疫动物，如小鼠、兔子或猴子等。
抗体制备课件
根据半抗原拥有的化学基团不同，连接方法 主要有以下几类： ①带游离氨基或羧基以及二种基团皆有的半抗原： 羧基可用混合酸酐法和碳二亚胺法与载体氨基 形成稳定的肽键，带氨基的半抗原则可与载体 羧基缩合。 ②带有羟基、酮基、醛基的半抗原：不能直接与 载体连接，需要用化学方法如琥珀酸酐法、O（羧甲基）羟胺法等方法将之转变为带有羧基 的半抗原衍生物后才能与载体连接。 ③带有酚基的半抗原，可用一氯醋酸钠法或重氮 化的对氨基苯甲酸法，生成带有羧基的半抗原 衍生物。
是一类良好的载体，常用的有多聚赖氨酸。 （3）大分子聚合物：聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、羧甲
基纤维素(CMC)等皆可与半抗原结合，加入福氏完 全佐剂可诱导动物产生良好的抗体。
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2.连接方法
半抗原与载体的连接有物理法和化学法。 物理法是用物理吸附法将载体与半抗原连接，其
原理是通过电荷和微孔来吸半抗原，吸附载体主 要有PVP和CMC等； 化学法是利用某些功能基团把半抗原连接到白质 类或多肽类聚合物载体上。不同的半抗原应选用 不同的方法进行连接。
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载体
SPA IgG 杂质
再生
载体 洗脱
图4 亲和层析纯化IgG基本过程示意图
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四、免疫血清的鉴定 1. 效价的测定：颗粒性抗原可采用凝集试验，可溶性抗
原常用双向免疫扩散试验、ELISA等方法。 2. 特异性的鉴定：抗体特异性鉴定常用双向免疫扩散法、
免疫电泳法。
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3. 纯度的鉴定：抗体纯度的鉴定可采用SDS-聚丙酰胺 凝胶电泳（SDS-PAGE）、双向扩散试验、免疫电泳 等方法。IgG含有重链和轻链，纯IgG的SDS-PAGE 结果应有两条蛋白电泳带（分子量约53kD和22kD）， 若出现多条电泳带则表明制备的抗体混有杂蛋白，需 进一步纯化。
第三章免疫原和抗血清的制备- 临床免疫学检验教案
了解：免疫原和抗血清的基本概念，免疫佐剂增强免疫应答的机制
内容与时间安排，教学方法：
内容：
抗原和抗体是免疫学检测的两个重要因素，也是整个免疫反应的基本条件。制备高效价和高特异的抗血清必须有理想的免疫原、适宜的动物和科学的方法，其中抗原的纯化是制备特异性抗体的先决条件。抗体类型有杂交瘤技术制备的单克隆抗体、免疫动物制备的多克隆抗体(抗血清)和基因工程抗体(单链抗体)。本章仅叙述抗原纯化和多克隆抗体制备技术。时间安排：2.0学时
一、佐剂的种类
二、佐剂的作用机制
第三节 抗血清的制备
一、免疫动物的选择
二、免疫程序
三、动物采血法
第四节 抗血清的鉴定和保存
一、抗血清的鉴定
二、抗血清的保存
第五节 抗血清的纯化
一、特异性IgG抗体
二、单价特异性抗血清
简图
简表
示意图
设问
讨论
讲解免疫原的制备 20 min
讲解免疫佐剂 20 min
讲解抗血清的制备 20 min
特异性IgG抗体的纯化方法有盐析法、凝胶过滤法、离子交换层析法、亲和层析法等；制备单价特异性抗血清可采用亲和层析法和吸附剂方法。
复习思考题、作业题
1．什么是免疫原？
2．如何制备可溶性抗原？
3．常用的细胞破碎方法有哪些？
4．连接半抗原的载体有哪些？制备半抗原性免疫原的方法有哪些？
5．纯化抗原的鉴定包括有哪些内容？
教学方法：CAI讲授结合板书
教学重点、难点：
重点：
1．免疫佐剂的特性及应用原则。
2．抗血清鉴定方法的选择。
难点：免疫佐剂增强免疫应答的机制。
手段
课堂设计和时间分配
抗体制备标准操作规程(3篇)
第1篇一、目的为了规范抗体制备过程，确保抗体质量，特制定本操作规程。
二、适用范围适用于各类抗体制备，包括免疫原制备、免疫接种、抗体采集、抗体纯化等环节。
三、职责1. 抗体制备负责人：负责制定抗体制备方案，监督实施，确保抗体制备质量。
2. 研究员：负责免疫原制备、免疫接种、抗体采集等具体操作。
3. 技术员：负责抗体纯化、质量检测等具体操作。
四、标准操作程序1. 免疫原制备（1）选择合适的免疫原，如蛋白质、多肽、DNA等。
（2）将免疫原进行化学或生物合成，制备成适宜的免疫原形式。
（3）对免疫原进行纯化，去除杂质。
2. 免疫接种（1）选择合适的动物模型，如小鼠、大鼠、兔等。
（2）根据动物种类和免疫原特性，确定免疫接种方案，如免疫途径、免疫间隔、免疫次数等。
（3）按接种方案对动物进行免疫接种，注意观察动物反应，如体重、食欲、活动等。
3. 抗体采集（1）在免疫结束后，根据抗体产生时间，选择合适的抗体采集时间。
（2）采集抗体，如血清、腹水等，注意无菌操作。
（3）将采集到的抗体进行分离、过滤，去除杂质。
4. 抗体纯化（1）选择合适的纯化方法，如亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤等。
（2）根据抗体特性和纯化方法，制备纯化柱或选择合适的纯化试剂。
（3）将抗体溶液过柱，收集洗脱液，进行抗体浓度测定。
5. 抗体质量检测（1）检测抗体效价，如ELISA、Western blot等。
（2）检测抗体特异性，如竞争ELISA、免疫印迹等。
（3）检测抗体稳定性，如冻融稳定性、pH稳定性等。
五、注意事项1. 操作过程中应严格遵循无菌操作原则，防止污染。
2. 抗体制备过程中，应密切关注动物反应，如体重、食欲、活动等，确保动物健康。
3. 抗体制备过程中，应做好记录，包括免疫原、免疫方案、抗体采集时间、纯化方法等。
4. 抗体制备完成后，应对抗体进行质量检测，确保抗体质量。
六、附则本规程自发布之日起实施，如有未尽事宜，由抗体制备负责人负责解释。
抗体制备过程PPT课件
背部皮下，每处注射0.2 ml, 共2～4点。待肿瘤到达一定大小后(一般10～20天
)那么可采血，从血清中获得单克隆抗体含量可到达1-10mg／ml。但采血量有
限。
+
② 腹水的制备 常规是先腹腔注射0.5mlPristane(降植烷)或液体石腊于
BaLb／c鼠，1～2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后可
+ 1. 有限稀释法的程序
+
① 制备饲养细胞悬液(同融合前准备)
+
② 阳性孔细胞的计数，并调细胞数在1～5×10３／ml
+
③ 取130个细胞放入含饲养细胞完全培养液，即20个细胞／ml，100μl
／孔加A、B、C三排为每孔2个细胞。余下细胞悬液补加含饲养细胞的完全培
养液,细胞数为10个／ml，100μl／孔加D、E、F三排，为每孔1个细胞。余下
备的，与其它抗原无交叉反响性。与其它常规免疫 血清相比，单抗的特异性高、效价高、质地均一， 便于精制浓缩，应用单抗可以提高检测方法的敏感 性和特异性。同时，他又可作为提纯抗原、制备疫 苗、生产生物制剂和用于根底研究的重要手段。
+ 3 .生产简单，易于标准化 + 一旦选育成功一株高效价的杂交瘤细胞株，经鉴定
料离心管内用不完全培养液洗1次，1200rpm,8分钟。
+
(4) 弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度。
+
(5) 轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。
+
(6) 在室温下融合可先以预热40℃:
+
① 30秒内参加预热的1ml45％PEG(Merek,分子量4000)含5％DMSO，边加
31第3.3章基因工程抗体的制备一
（2）可变区片段(variable fragment, Fv)
定义： 是抗体分子中保留抗原结合部位的最小功能性片段，是由轻链和重链可
变区以非共价键结合而成的单价小分子，其大小为完整抗体的1/6。
（3）单链抗体(single chain variable fragment, ScFv)
（2）改形抗体(reshaped antibody, RAb)
定义：为进一步降低抗体的免疫原性，应用基因工程技术将 鼠源McA b中CDR移植至人源抗体可变区，替代人源抗体 CDR，即为“CDR植入抗体(CDR grafting antibody)”。
（2）改形抗体(reshaped antibody, RAb)
3
基因工程抗体的优点
降低甚至消除人体对鼠单抗的排斥反应 分子量较小，易进入病灶的核心部位 可根据治疗需要制备新型抗体 可采用多种表达形式，大大降低生产成本
Hale Waihona Puke 一、人源化抗体定义：是指利用DNA重组技术对鼠源的McAb进行 改造，使其大部分氨基酸序列为人源序列所取代而 获得的抗体。
一、人源化抗体
特点： 保持鼠源单抗的特异性和亲和力 几乎对人体无免疫原性
二、小分子抗体
定义：是指分子量较小但具有抗原结合功能的分子片段。 优点：
分子量小，易到达靶部位，可用于免疫治疗 可在大肠杆菌等原核细胞中表达，降低生产成本 免疫原性比原来的单抗弱 不含Fc段，更能集中到达靶细胞部位，有利于作为
特点： 分子量小 稳定性高 免疫原性弱 组织穿透力强
思考题
PD-1抗体是当前研究的热点，目前各公司制备的PD-1抗体是 否是基因工程抗体？为什么？
特点： 降低对人体的免疫原性 保留单抗的特异性和亲和力
抗体制备详解PPT学习教案
三、半抗原
半抗原（无免疫原性 ＋）
载体
多肽、多糖、甾族 激素、脂肪胺、类脂 质、核苷、某些药物 以及其他化学物品等 。
完全抗原（具免疫原性）
机体
抗体/致敏淋巴细胞 第31页/共79页
1、载体的选择
①蛋白质：牛血清白蛋白、人血清白蛋白 、兔血 清白蛋白、牛甲状腺球蛋白 ②多肽聚合物：多聚赖氨酸 ③大分子聚合物：
➢细胞抗原：绵羊红细胞
➢细菌抗原：菌体抗原
➢
鞭毛抗原
➢寄生虫体抗原：虫卵
第3页/共79页
血细胞抗原制备
细菌抗原制备: 多用液体或固体纯培养 物，经集菌后处理。
寄生虫和真菌抗原制备: 除用破碎法加 工粗提外，大多要加以适当纯化。
第4页/共79页
第5页/共79页
二、可溶性抗原 （一）组织和细胞可溶性抗原的粗提 ➢ 1.组织细胞抗原的制备： ➢ 高速捣碎法－组织捣碎机捣碎 ➢ 研磨法－用玻璃匀浆器或乳钵研磨
第44页/共79页
多克隆抗体
天然抗原刺激多种B
淋巴细胞克隆产生的
多种抗体的混合物
。
多克隆抗体的产生示意图
第45页/共79页
一、免疫动物的选择
抗原来源与动物种属的 关系：种属差异越远， 免疫原性越强； 动物个体的选择：适龄 、健康、体重符合要求 ； 抗原的性质； 第46页/共79页
二、抗原剂量的选择
最常用的纯化方式是提取抗血清中 的特异性IgG或单价抗体。
第47页/共79页
三、免疫程序
免疫原的剂量 免疫间隔时间 免疫途径
第48页/共79页
四、采血方法
➢ 颈动脉采血法：家兔、绵羊、山羊 ➢ 心脏采血法：家兔、豚鼠、大鼠、鸡 ➢ 静脉采血法：家兔、山羊、绵羊 ➢ 眼球摘除法或断尾法：小鼠
第3章 抗体
第三章抗体(Antibody,Ab)食品免疫学检测技术第一章绪论第二章抗原第三章抗体第四章抗体的制备及处理第五章常见免疫学检测技术第六章免疫学检测技术在食品检测中的应用第三章抗体（2学时）l第一节抗体概述l第二节抗体的结构与功能l第三节特异性免疫应答过程l第四节抗原与抗体的相互作用l第五节抗体的发展第一节抗体概述v 抗体l 机体在抗原刺激下，由B 细胞分化成的浆细胞产生的，能与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白v 抗体和免疫球蛋白v 免疫球蛋白l 具有抗体活性，或与抗体结构相似的球蛋白统称免疫球蛋白抗体和免疫球蛋白的关系？抗体都是免疫球蛋白冯.贝林Behring （德国）1890 抗体的发现第二节抗体的结构与功能一、抗体的基本结构与功能v1.重链和轻链•所有抗体分子的基本结构都是四条肽链组成的对称结构。
两条长链为重链（heavy chain, H 链），两条短的为轻链（light chain, L链），4条链通过链间二硫键构成Y字型。
v轻链（light chain，L链）•214个氨基酸残基，约24KD•分为：κ与λ2个亚型•同一抗体分子两条轻链完全相同v重链（heavy chain，H链）•450-550个氨基酸残基，55-75KD•同一抗体分子两条重链完全相同•根据抗原性分μ、γ、α、δ、ε链5类根据重链将抗原分为IgM，IgG，IgA，IgD，IgEv可变区（Variable region，V区）v2.可变区和恒定区•H链N端1/5-1/4处（V H）118个aa•L链N端1/2处（V L）110个aa骨架区（FR）高变区（HVR）•HVR1，HVR2，HVR3又分别称为CDR1，CDR2，CDR3•互补决定区（CDR）：三个高变区共同组成Ig 的抗原结合部位Variable regionv恒定区(constantregion，C区)•H链C端3/4-4/5处，331-431个aa•L链C端1/2处，105个aa在同一种属动物中是比较恒定的,是制备第二抗体进行标记的重要基础糖基v 3.铰链区(Hinge region)•重链中Fc 与Fab区之间的区域,富含脯氨酸, 使分子有弹性, 使Ig 分子中的两个抗原结合位点能独立工作IgG3和IgD 的长※※※※IgG1, IgG2, IgG4和IgA 的短※※※※IgM 和IgE 没有如：IgG3的铰链区明显要比IgG1、IgG2和IgG4的长•J chain:由浆细胞合成，富含半胱氨酸, 存在于多聚IgA 和IgM 分子中的一个单态性多肽，与多聚体的形成有关v 4.J 链(Joining chain)SPv5.分泌片（secretory piece),简称•由上皮细胞合成，和分泌型IgA连接，使之不受环境中酶的破坏v6.免疫球蛋白的功能区（domain）•免疫球蛋白的多肽链分子折叠形成几个由链内二硫键连接成的环状结构，称之为domainIgG 、IgA 和IgD 4个V H , C H1, C H2, C H3轻链：2个，V L 、CL IgM 、IgE 5个V H , C H1, C H2, C H3, C H4重链：（1）VL和VH是抗原结合的部位v V区的功能-----识别并特异性结合抗原•V H和V L抗体分子：单体（IgG, IgE) ---2价二聚体(分泌型IgA) ---4价五聚体(IgM) ---10价（5价）实际意义:a.中和效应---中和毒素和病毒b.与Ag结合---促吞噬细胞吞噬c.与Ag结合---检测（2）CL和CH1上具有同种异型的遗传标记（3）IgG的CH2和IgM的CH3具有补体C1q结合位点；IgG借助CH2部分可通过胎盘（4）CH3或CH4具有结合单核细胞、巨噬细胞、粒细胞、B细胞、NK细胞Fc段受体的功能，不同的抗体可与不同的细胞结合，产生不同的免疫效应v C区的主要功能•V H和V LC H1～C H3和C L---Ig遗传标志所在；C H2(IgG)、C H3(IgM) ---C1q结合部位；C H2～C H3(IgG) ---结合并通过胎盘；C H3(IgG) ---FcγR结合部位；C H4(IgE) ---FcεR结合部位IgGIgD IgAIgEIgM第二节抗体的结构与功能二、抗体的酶切片段•木瓜蛋白酶的水解片段1959年Porter 用木瓜蛋白酶（papain ）水解兔IgG 分子，获得了三个片段(1)Fab 段2个抗原结合片段(2)Fc 段1个可结晶片段；无抗体活性；还具有活化补体、亲细胞、通过胎盘等活性抗体分子模型•胃蛋白酶的水解片段1960年Nisonoff等用胃蛋白酶水解兔IgG分子，获得了大小不等的两个片段1)F(ab’)2 段1个；结合颗粒性抗原出现凝集反应(2)Fc’段1个；无生物学活性二、Ig 的类型v 1.类•同一种属每个个体都具有的免疫球蛋白的抗原特异性，其抗原决定簇主要存在于Ig 的C 区(一) 同种型•根据H 链的抗原性不同分五类：•IgG ---γ(gamma)•IgA ---α(alpha)•IgM ---μ(mu)•IgD ---δ(delta)•IgE ---ε(epsilon)v 2.亚类：•IgG ：IgG1, IgG2, IgG3, IgG4•IgA ：IgA1, IgA2•IgM: IgM1, IgM2v 3.型(根据轻链C 区抗原特异性不同分型)•κ(kappa)型、λ(lambda)型•OZ(+) (或λ1) ：第190位(亮氨酸)•OZ(-) (或λ2) ：第190位(精氨酸)•Kern(+)(或λ3) ：第154位(甘氨酸)•Kern(-)(或λ4) ：第154位(丝氨酸)v 4.亚型(λ链)亚类鉴定试剂盒(二) 同种异型（allotype）•同一种属不同个体之间免疫球蛋白也具有的差异性，主要反映在分子的CH和CL上的一个或数个氨基酸的差异(genetic markers---遗传标志)(三) 独特型（idiotype）•在同一个体内，不同B细胞克隆所产生的免疫球蛋白分子V区以及T、B细胞表面抗原受体V 区所具有的抗原特异性不同三、各类Ig 的特性与生物功能(一) IgG •IgG 于出生后3个月开始合成•IgG 多为单体，半衰期约为23天，占血清免疫球蛋白总量的75%～80%•IgG 1、IgG 2和IgG 3的C H2能通过经典途径激活补体（裂解细胞）•IgG 是唯一能通过胎盘的抗体（新生儿抗感染）•通过Fc 段与吞噬细胞表面FcR 结合，发挥调理作用（促进吞噬）；与NK 细胞结合，发挥ADCC 作用（细胞毒作用）；与葡萄球菌A 蛋白结合（亲合层析）•具有抗菌、抗毒和抗病毒作用（抗感染）•参与II 、III 型超敏反应•淋巴结、脾产生；再次应答中的主要Ab ；150kd•人类发育过程中最早合成的Ig，胚胎晚期已能合成(二) IgM•体液免疫应答最先产生的Ig（感染早期诊断）•占血清Ig含量的5～10%•半衰期: 5天（血清中特异性IgM 水平增高提示有近期感染）•激活补体（比IgG强）•IgM不能通过胎盘（脐带血或新生儿血清中IgM水平升高表明胎儿有宫内感染）•B细胞膜IgM（B细胞抗原受体的主要成分，参与体液免疫应答）•自身抗体（自身免疫病，如类风湿因子）•淋巴结、脾产生；初次应答中的主要抗体；五聚体，900kd，又称巨球蛋白，补体激活的起始C1rC1sC1qC1rC1sC1q(三) IgA•两种类型--血清型（单体，IgA1，170kd）肠系膜淋巴组织中的浆细胞产生--分泌型（二聚体，IgA2，390kd）呼吸道、消化道、泌尿生殖道等处的固有层中浆细胞产生•（粘膜局部抗感染免疫）•占血清Ig含量的5～15%•聚合IgA激活补体替代途径•产生部位：粘膜淋巴组织•粘膜免疫中的主要Ab•可经初乳传给新生儿(四) IgE•单体分子•存在形式--分泌性，存在于血清中，功能不清--膜结合性，存在于B细胞表面----B细胞成熟的重要标志----抗原受体•占血清Ig含量的1%•半衰期3天•呼吸道和胃肠道浆细胞产生•过敏性疾病和某些寄生虫感染患者血清中特异性IgE水平增高(五) IgD•IgD是B细胞的重要表面标志•B细胞的分化过程中首先出现SmIgM，后来出现SmIgD，它的出现标志着B细胞成熟了第三节特异性免疫应答过程•特异性体液免疫(humoral immunity)是指由B细胞介导的免疫反应，由抗体发挥免疫效应，因此也叫抗体应答• 1. 抗体形成的机理---克隆选择学说（Clone selection theory): 1957，Burnet---免疫网络学说(关于独特型抗体) 1972，Jerne ---• 2. 抗体形成的过程致敏阶段抗原初次进入机体巨噬细胞处理降解Ag-MHC复合物浆细胞生成反应阶段抗体形成，在一定时间内水平保持不变效应阶段大量抗体生成达到高峰，维持长时间与Ag结合，清除Ag• 3. 抗体的产生规律---抗原进入机体后，可激发体液免疫应答，其标志是大量抗体的产生以及最终对抗原的清除---抗体的产生在抗原初次和再次进入机体时各有其特点，而在抗体的产生过程中，各类免疫球蛋白的出现先后也不同---在免疫应答中, 各类抗体产生的顺序,首先是IgM，然后是IgG、IgA、IgD和IgE。
《医学免疫学 》教学课件：第三章 抗体
表 达 于 B 细 胞 表 面 的 膜 型 免 疫 球 蛋 白 M （ membrane immunoglobulin M, mIgM）为IgM 单体，其胞外区结构与 血液中的IgM基本相同，且具有特异性识别结合相应抗原 表位的功能，故称之为B细胞抗原受体（BCR）。
多克隆抗体：由多个B细胞克隆产生的针对多种抗原 表位的混合抗体。
特点：来源广泛，制备容易，但特异性不高，易发生 交叉反应。
单克隆抗体：由单一克隆杂交瘤细胞产生的只识别 某一特定抗原表位的同源抗体。
特点：结构高度专一，特异性强，效价高，少或无交 叉反应，可大量生产。
单克隆抗体的制备原理和方法：
与Tiselius一起，用电 泳证明了抗体是丙种球 蛋白。
Elvin A. Kabat （1914-2000）
Adapted from A. Tiselius and E. A. Kabat, J. Exp. Med. 1939, 69:119
The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1972
同种型
同种异型
独特型
（种属型标志） （个体型标志） （细胞型标志）
同种型
同一种属所有个体抗体分子共有的抗原特异性， 为种属型标志。 同种型抗原决定基位于CH、CL。 根据CH抗原特异性的不同将抗体分成五类。 亚类：因重链恒定区内某些抗原表位及二硫键数 目和位置存在差异，IgG分四个亚类（IgG1～4）， IgA分两个亚类（IgA1～2）。 根据CL抗原特异性的不同将Ig分成两型：κ、λ。 亚型：λ型轻链恒定区内由于某些抗原表位存在差 异，可将其分为λ1～4四个亚型。
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一、杂交瘤技术的基本原理
杂交瘤技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌 特异性抗体能力的致敏B细胞与具有无限繁殖能力的骨髓 瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。
这种杂交瘤细胞具有两种亲代细胞的特性，既保留了 骨髓瘤细胞在体外培养无限增殖的特点，又继承了致敏B 细胞可合成和分泌特异性抗体的能力。
杂交瘤技术使用的选择培养基是在普通细胞培养液中 加入次黄嘌呤（hypoxanthine,H）、氨基喋呤（ aminopterin,A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine,T），所以 取三者的字头称为HAT培养基。
临床免疫学与免疫学检验
第三章 抗体的制备
抗体是机体在抗原刺激下所产生的特异性免疫应答的 重要产物，也是免疫学实验中的常用试剂，对于抗原的分 析鉴定和定量检测极为重要，在各种免疫学实验室诊断中 广泛应用。
第一节 免疫原的制备
免疫原（immunogen）是能刺激机体免疫系统产生特异 性抗体或致敏淋巴细胞的抗原。
3. 电处理融合法 当细胞处于电场中,细胞壁两面产生电势, 由于细胞
膜两面相对电荷正负相吸,使细胞膜变薄,随着外加电场强度升高,膜电 场增强,当膜电势增强到临界电势时,细胞膜处于临界膜厚度,导致发生 局部不稳定和降解,从而形成微孔。
融合子的筛选
(1) 杂合细胞的显微镜鉴别：若一方细胞大,另一方细胞小,则大、小
弗氏佐剂（Freund adjuvant,FA）可分为:弗氏不完 全佐剂、弗氏完全佐剂。
佐剂与抗原混合乳化的方法有两种：研磨法、搅拌混 合法。
二、佐剂的生物学作用
1.增强抗原免疫原性，使无或弱免疫原性的物质成为持 久或强免疫原。
2.增强机体对抗原刺激的反应性，提高机体初次和再次 免疫应答产生抗体的效价。
五、单克隆抗体鉴定
抗体效价测定 抗体特异性鉴定 Ig类型鉴定
六、单克隆抗体的特性
高度特异性 高度均一性 弱凝集反应和不呈现沉淀反应 细胞毒作用较弱 对环境敏感性
七、单克隆抗体的应用
临床检验诊断试剂 蛋白质的纯化 肿瘤的导向治疗 放射免疫显像技术
光学显微镜下正常细胞与被侵染细胞比较
图1 正常 vero细胞
人-鼠嵌合抗体（human-mouse chimeric antibody ） 是利用DNA重组技术，从杂交瘤细胞中分离出鼠源 McAb功能性IgV区基因，与人IgG C区基因连接成嵌合基 因后， 插入适当的表达载体中，构建人-鼠嵌合的重链 和轻链基因质粒载体，共同转染宿主细胞中表达的抗体 。
为进一步降低抗体的免疫原性，人们应用基因工程技 术将鼠源McAb中互补决定区(complementarity determining region，CDR)移植至人源抗体可变区，替代 人源抗体CDR，即为CDR植入抗体。
融 合 过 程 示 意 图
细胞融合的方法
1. 生物学法 采用病毒促进细胞融合,如仙台病毒、疱疹病毒、天花病
毒、副流感型病毒、副黏液病毒和一些致癌病毒等均能诱导细胞融合 。
2. 化学融合剂法 20世纪70年代以来,采用的化学融合剂包括PEG、
二甲亚砜、甘油醋酸酯、油酸盐及磷脂酰丝氨酸等脂类化合物。在 Ca2+在存下皆可促进细胞融合。
叉反应； • IgY不激活哺乳动物的补体系统，不与类风湿因子或Fc受体相结合，避免在免
疫检测过程中产生假阴性或假阳性结果； • IgY对哺乳动物抗原的敏感性高。
二、抗原剂量的选择
抗原的注射剂量应考虑抗原的免疫原性的强弱、分子 量大小、动物的个体状态和免疫时间。
三、免疫程序
动物产生抗体的过程符合抗体产生的一般规律—即初 次免疫应答和再次免疫应答的规律。一般在首次接触抗原 7天～10天后，动物血清中才有抗体出现，并在14天～21 天内达到高峰，随后开始下降。
特异性抗体的纯化：亲和层析法、吸附法
七、多克隆抗体的特性和应用
用于某些疾病的紧急预防，例如破伤风和Rh不合的 新生儿溶血症等。
用于某些感染性疾病和移植排斥反应等的治疗。 应用于某些疾病的临床检验。 在科研中常用于免疫印迹和免疫组化等。
第四节 单克隆抗体的制备及应用
单克隆抗体（McAb）的特点是理化性状高度均一、纯 度高、特异性强、少或无血清交叉反应的特点，易于实验 标准化和大量制备。
重链抗体以其分子量小，稳定性高，免疫原性弱，组织穿透 力强，可以结合一些常规抗体无法接近的抗原表位等特点，显示出 其与常规抗体相比在抗体-抗原结合及免疫防御中的优势。
三、双特异性抗体
双特异性抗体(bispecific antibody, BsAb)是指同 时能与两种不同特异性的抗原发生结合的抗体。它不同于 天然抗体，其两抗原结合部位具有不同的特异性。
（三）免疫球蛋白片段的制备
免疫球蛋白片段的制备方法有解离二硫键、溴化氰裂 解法和酶裂解法。
三、半抗原
半抗原（hapten）是指只有抗原性而无免疫原性的物 质，如多肽、多糖、甾族激素、核苷、某些药物以及其他 化学物质等。
半抗原不能直接用作免疫原，只有把半抗原与蛋白质 等大分子物质结合后，才能剌激机体产生抗体或致敏淋巴 细胞。
16天
图7 单克隆细胞生长情况
第五节 基因工程抗体及应用
基因工程抗体（genetic engineering antibody） 又称重组抗体，是指利用重组DNA及蛋白质工程技术对 编码抗体的基因按不同需要进行加工改造和重新装配， 经转染适当的受体细胞所表达的抗体分子。
一、人源化抗体
人源化抗体(humanized antibody) 是指利用基因 克隆及DNA重组技术对产生鼠源McAb的杂交瘤细胞内抗 体基因进行改造，使其分泌的McAb中大部分氨基酸序列 为人源序列所取代，既保留了亲本鼠McAb的特异性和亲 和力，又降低了其异源性，以利于临床应用。
图2 风疹病毒侵染后的细胞
细胞融合技术
细胞融合技术是20世纪60 年代创立的, 它是指在一定条件下，将 两个或多个细胞融合在一个细胞的过程，细胞融合又称细胞杂 交。
细胞融合的最初变化，是细胞在促融因子的作用下，出现凝集 现象，细胞之间的质膜发生粘连，细胞开始融合，然后在培养 过程中，进而发生核融合，形成杂种细胞，现在不仅微生物、 动物、植物种内或种间可以杂交,而且微生物、动物、植物细胞 之间也可以杂交，可促进基因重组，对遗传育种、选育优良品 系，以获得高产优质的品种具有重要实践意义。
通常首次免疫后3周左右进行加强免疫，加强免疫至 少2次，必要时需3次～5次。
四、采血方法
颈动脉放血法 静脉采血法 心脏采血法
五、抗血清鉴定及保存
抗体效价和纯度的测定 抗体特异性的鉴定 抗体亲和力的鉴定 抗血清的保存
六、抗体的纯化
IgG类抗体的纯化：盐析法粗提γ-球蛋白、离子交换 层析提取IgG、亲和层析法。
（一）组织和细胞可溶性抗原的粗提
组织细胞抗原的制备：粉碎的方法有两种：高速组织 捣碎机法和研磨法。
细胞可溶性抗原的制备：常用的细胞破碎方法有超声 破碎法、酶处理法、冻融法和表面活性剂处理法。
（二）可溶性抗原的纯化
一般采用的纯化方法有超速离心法、选择性沉淀法、 凝胶层析法、离子交换层析法和亲和层析法。
细胞融合的就是杂合细胞;若一方细胞基本无色,另一方为绿色,则白绿 色结合的细胞是杂合细胞;如果双方原生质体在特殊显微镜下或双方 经不同染料着色后可见不同的特征,则可作为识别杂合的标。
(2) 互补法筛选杂合细胞：遗传互补法的前提是获得各种遗传突变细
胞株系。如甲细胞株缺外源激素A不能生长,乙细胞株需要提供外源激 素B才能生长,则甲株与乙株融合,杂合细胞在不含激素A、B的选择性 培养基上可能生长，这种选择类型称生长互补。
(3) 用采细胞与分子生物学的方法鉴别杂合体：进行染色体核 型分析、染色体显带分析、同功酶分析以及更为精细的核酸 分子杂交、限制性内切酶片段长度多态性和随机扩增多态性 分析,以确定其是否结合了双亲本的遗传素质。
单 克 隆
抗 体 制
备 过 程
图6 融合细胞后第四天细胞生长情况
3天
7天
10天
14天
二、杂交瘤细胞的制备过程
亲本细胞的选择和融合 选择培养基的应用 抗原特异性杂交瘤细胞的筛选
三、单克隆抗体的生产
大量制备单克隆抗体的方法主要有两种，一种是动物 体内诱生法，另一种是体外细胞培养法。
动物体内诱生法 是目前McAb大量制备的主要方法。 体外细胞培养法 将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培 养。 兔单克隆抗体
二、小分子抗体
小分子抗体是指分子量较小但具有抗原结合功能的分 子片段。
优点表现为:分子量小、 可在大肠杆菌等原核细胞中 表达、免疫原性要比原来的McAb弱得多、不含Fc段有利于 作为靶向药物的载体、半衰期短、周转快有利于放射免疫 成像检查肿瘤。
பைடு நூலகம்
1.抗原结合片段(Fab) 由一条完整的L链和约1/2的H链 组成，具有与完整抗体相同的抗原结合特性，但只能结合 一个抗原表位。
3.刺激淋巴细胞的增殖分化，增强和扩大免疫应答。
第三节 多克隆抗体的制备及应用
一、免疫动物的选择
抗原与动物种属之间的关系 动物的个体因素 抗原的性质与动物种类 抗体的用量和要求
IgY有如下几方面的优点
• 无需采血，只需收集免疫母禽产下的禽蛋即可提取抗体； • 使用少量的抗原免疫禽类既可获得大量的质量均一的特异性IgY； • IgY抗体耐酸、耐热，经巴氏消毒后活性依然存在，因此容易保存和运输； • 由于种系发生距离相差很大，禽类IgY与哺乳动物免疫球蛋白之间不会发生交
半抗原-载体的连接方法： 带有游离羧基或游离氨基以及两种基团均有的半抗原 带有羟基、醛基和酮基的半抗原 芳香族半抗原
第二节 免疫佐剂
免疫佐剂( immunoadjuvant)是指预先或与抗原同时 注入体内，可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答 类型的非特异性免疫增强性物质。