用于流式细胞分析的细胞内抗原染色方法总结

用于流式细胞分析的细胞内抗原染色

改进的基本免疫荧光染色和流式细胞分析操作步骤可用于在单细胞水平上同时流式细胞分析表面分子和细胞内抗原。通常，细胞用甲醛固定以稳定细胞膜，然后用破膜剂或酒精透化，使得抗细胞内抗原的抗体可以在细胞内进行染色。染色细胞内的蛋白质时，重要的是要考虑它们的位置，因为这可能决定了最优的操作步骤和缓冲系统。例如，核蛋白和许多分泌蛋白与Foxp3 /转录因子染色液组合配合良好，而分泌蛋白如细胞因子和趋化因子搭配细胞内固定和破膜缓冲液组合很好。最后，有几种磷酸化的信号蛋白可能在前面提到的两种缓冲系统中不起作用，但可与固定/甲醇方案一起使用。应根据经验确定不同缓冲系统和方案中的抗体性能。

细胞表面蛋白质染色操作步骤：

1，取100-200w细胞（流式收20w），1200rpm离心8min，留100μL，将细胞重悬。

2，加入1mL 5% BSA（PBS配），1200rpm离心5min，留100μL，将细胞重悬。重复两次。这步是封闭，封闭非特异性的表面蛋白分子，防止与抗体非特异性结合。

3，每种抗体加0.3-0.5μL，4℃避光30min。

4，加1mL PBS 终止，1200rpm离心5min，留100μL，将细胞重悬。

5，如果不能马上过流式，加100μL4%多聚甲醛（PBS配），4℃固定。

细胞内抗原染色方法：

一、两步法：细胞内（细胞质）蛋白质。

二、一步法：细胞内（核）蛋白质。

三、固定/甲醇的两步法。

一、两步法：细胞内（细胞质）蛋白质

在该操作步骤中，固定步骤之后是破膜，在细胞膜上穿孔，这需要在所有后续步骤中持续存在破膜液。这使得抗体可以进入细胞的细胞质。因此，所有细胞内染色必须在存在破膜液的条件下进行。该操作步骤推荐用于体外或体内活化后个体细胞中的胞浆蛋白、细胞因子或其他分泌蛋白的