红细胞膜制备

两种提取红细胞膜蛋白方法的比较

在制备抗血型抗原单克隆抗体时，为了提高红细胞血型抗原的免疫效果，获得更多的阳性克隆，我们比较了两种提取红细胞膜蛋白的方法。 1 材料和方法

1.1 低渗溶血法粗提红细胞膜蛋白

1.1.1 方法一 略有改良 取25 ml A(或B ) 型抗凝混合血加0.01 mol/L PBS ( pH7.4)，离心3000 r/min ，20 min ，弃上清和上清下的白细胞、血小板层。用相当于红细胞压积3倍的预冷PBS(pH7.4)洗涤3次(4 ℃ 5 000 r/min,15 min) 。加预冷的0.01 mol/L Tric-HCl(pH7.4)与红细胞(V V=401)∶∶混合，4℃放置2 h 。再以9 000 r/min 离心20 min ，弃上清(重复3~5次)至无肉眼可见的红细胞为止。沉淀物加0.01 mol/L PBS(pH7.4)置-20℃保存。

1.1.2 方法二 略有改进 4 ml A(或B)型血加40 ml NS,离心2 000 r/min,20 min,洗3次。沉淀物加入40 ml 预冷蒸馏水，离心5 000 r/min,10 min ，洗4次。因沉淀物中仍有少量红细胞，故加40 ml 0.01 N 冰醋酸，置4 2 h ℃后离心9 000 r/min ，15 min 。沉淀物加4 ml NS 混匀后，再加0.2 ml 0.1 N NaOH ，

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室温30 min,离心转速同上，弃上清后加4 ml NS,用0.1 N HCl(约0.1 ml)调pH 至7.4。紫外分光光度计测蛋白含量。 1.2 红细胞膜抗原的活性测定

1.2.1 血凝抑制试验 将提取的A(或B)型红细胞膜蛋白倍比稀释，分别加相应抗体(原液~1128∶倍比稀释)，震摇后置

室温1 h ，再加入2%A 或B 型红细胞，水平振荡20 min,室

温静置1 h 观察结果。另用A 或B 型红细胞代替A 或B 型红细胞膜蛋白作为对照。能使加入的2%红细胞不出现凝集所需膜抗原的量作为膜抗原的血凝抑制效价。

1.2.2 60Co 照射对膜蛋白抗原活性的影响 将提取的红细胞膜蛋白用15 000 rad 照射后，倍比稀释成不同浓度，用18∶的A 或B 型血型抗体做血凝抑制试验[3]。

1.2.3 膜蛋白抗原免疫效果观察 将分别以10%红细胞和A 、B 型膜蛋白抗原免疫BALB/c 小鼠(4次)所获血清，分别与2%A(或B)红细胞作血凝试验测定血型抗体效价。 2 结果和讨论

2.1 红细胞膜蛋白量的测定 用两种方法提取的红细胞膜蛋白中镜下观察均无完整红细胞。所获蛋白量以100 ml 容积的

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细胞计算，方法一和方法二提取的A 型膜蛋白量分别为120~160 mg 和50 mg,B 型膜蛋白量分别为260 mg 和68 mg 。 2.2 膜蛋白抗原的活性测定 以能完全抑制相应抗体(原液)与红细胞产生凝集反应所需膜蛋白量来判定。方法一提取的膜蛋白A 型为7.5~15 mg/ml ，B 型为13.6 mg/ml ；方法二提取

的膜蛋白A 型为7.5~15 mg/ml,B 型为11.6 mg/ml 。

2.3 60Co 照射后对膜蛋白抗原活性的影响 将所提膜蛋白抗原于照射前后做血凝抑制试验，结果是：方法一提取的膜蛋白抗原，A 型照射前后分别为0.26 mg/ml 和0.13~0.26 mg/ml;B 型分别为0.11 mg/ml 和0.26 mg/ml ；方法二提取的膜蛋白抗原，A 型照射前后分别为0.24 mg/ml 和0.47 mg/ml ；B 型分别为0.1 mg/ml 和0.34 mg/ml 。

2.4 完整红细胞与膜蛋白抗原的免疫效果 以10%红细胞免疫BALB/c 小鼠产生的抗体效价A 型为180~1512,B ∶∶型180~1512∶∶。A 型膜蛋白抗原免疫BALB/c 小鼠产生的抗体效价为1512~11024,B ∶∶型为1256~11024∶∶。用A 型红细胞和A 型膜蛋白抗原免疫BALB/c 小鼠的脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞进行融合，所获杂交瘤细胞的阳性率分别是0.7%和11.5%。

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本文采用两种低渗溶血法提取的红细胞膜蛋白抗原量有所不同，方法一高于方法二。但两种方法所获膜蛋白抗原都具有血凝抑制活性。因免疫动物所需抗原必须无菌，故对提取的膜蛋白抗原进行了60Co 照射。照射后对A 型膜蛋白抗原活性的影响不大，但可使B 型膜蛋白抗原的活性下降2~3倍。更为重要的是，以照射后的膜蛋白抗原作为免疫原可使融合阳性率较完整红细胞作免疫原提高15倍。因此认为本文提取的红细胞膜蛋白抗原不仅简便易行，而且有实际应用价值，尤其是方法一。

分离膜蛋白的方法有两种：1先分离膜，然后提取；2用特殊的去污剂选择性的分离。第二

种方法简单，可靠，但有时含有其他蛋白。

原理：4度时所有的蛋白质原则上都溶于TritonX114水溶液，但在37度时，此溶液分为水相

和去污相；此时亲水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去污剂相中。 方案

1）放射性标记受试细胞 2）将标记的细胞放在冰上

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3）去除上清，用pH7。4的冷磷酸盐缓冲液洗涤单层细胞两次

4）加入1ml2%TritonX 溶液冰浴15min 5)刮下单层细胞，4度下10 000g 5min 离心

6）溶液37度水浴 10min 以分离水相和去污剂相，然后37度下2 000g 离心5min 7)收集水相留作分析

8）用500ul 冰冷的buffer C 溶解去污剂相沉淀，冰浴2min 后加温，在按步骤6再次离心

9）按步骤8再次抽提去污剂相，用buffer C 将洗涤后的去污剂相稀释到初始体积

10）用等量的buffer A 分别稀释水相与去污相，并进行免疫沉淀实验 试剂：

1）2%tritonX114:2%TritonX114、50mmol/L Tris HCl （pH7。5）、蛋白酶抑制剂

2）缓冲液A （含0。5mol/LNaCl 的RIPA buffer ） 3）buffer C

10mmol/L Tris HCl(pH7.5) 150mmol/L NaCl 5mmol/L EDTA(PH7.5)

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