第8章 代谢控制育种

第8章代谢控制育种
概念：在了解代谢产物生物合成途径、遗传控制和代谢调节机制的基础上，设计对特定突变型的筛选（定向选育），选育出解除正常代谢调节、或绕过微生物正常代谢途径的突变株，从而人为地使有用代谢产物选择性地大量合成和积累
1 初级代谢的调节控制
1.1 酶合成的调节
诱导（induction）：促进酶合成的调节
阻遏(repression)：阻碍酶合成的调节
组成酶(constitutive enzyme)：细胞完成基本生物功能常备的酶类
诱导酶(induced enzyme)：细胞为适应外来底物或其结构类似物而临时合成的酶类
1.1.1 酶合成调节的类型
1.1.1.1 诱导
诱导物：能促进诱导酶产生的物质，是酶的底物或其结构类似物
同时诱导：当诱导物存在时，微生物同时合成几种诱导酶
顺序诱导：当诱导物存在时，微生物先合成能分解此物的酶，再依次合成分解各种中间产物的酶
1.1.1.2 阻遏
1.当代谢途径中某物质过量时，通过阻碍代谢途径中包括关键酶在内的一
系列酶的合成，从而彻底地控制代谢和减少该物质的合成。

2.末端产物阻遏（end-product repression）:由于某代谢途径末端产物过
量积累而引起的阻遏
3.分解代谢物阻遏（catabolite repression）:当有两种C/N源分解底物
同时存在时，细胞优先利用分解快的底物，并阻遏合成利用慢的底物的
相关酶的合成
4.分解代谢物阻遏实质是分解代谢反应链中的某些中间代谢物或末端产物
过量积累而阻遏代谢途径中一些酶合成的现象
5.葡萄糖效应：当葡萄糖和乳糖同时存在时，微生物优先利用葡萄糖，并
于葡萄糖耗尽后，才开始利用乳糖，出现“二次生长”。

葡萄糖的存在
阻遏了分解乳糖酶系的合成
1.1.2 酶合成调节的机制
1.操纵子：一组功能上相关且紧密连锁的基因。

由启动基因、操纵基因和
结构基因组成
2.启动基因(promoter):依赖于DNA的RNA聚合酶结合位点
3.操纵基因(operator):能与调节蛋白结合，阻遏转录
4.结构基因(structural gene): 编码多肽基因
5.调节基因（regulator gene):位于相应操纵子附近，编码组成型调节蛋
白(regulatory protein),此蛋白为变构蛋白，存在与操纵基因结合的位
点，以及与效应物结合的位点
6.效应物(effector):一类低分子量的信号物质，如诱导物（inducer)和辅
阻遏物（corepressor）
7.调节蛋白有两类,一类称为阻遏物(repressor),他能与操纵基因结合，阻
遏转录，但当与诱导物结合时，则不能与操纵基因结合，转录发生；另
一类称为阻遏物蛋白（aporeperssor）,只有与辅阻遏物结合后，才能与
操纵基因结合，阻遏转录
8.诱导型操纵子：当诱导物存在时，其转录频率才最高，并随后转译出大
量诱导酶，出现诱导现象，如乳糖、半乳糖和阿拉伯糖分解代谢操纵子
9.阻遏型操纵子：只有当缺乏辅阻遏物时，其转录频率才最高。

如组氨酸、
精氨酸和色氨酸合成代谢操纵子
10.例子：见P207~209
1.2 酶活性的调节
反馈抑制(feedback inhibition):末端产物过量时，这个产物可以反过来直接抑制该反应途径中第一个酶的活性，使整个反应过程减慢或停止，从而避免末端产物的过量积累。

1.2.1 直线式代谢途径中的反馈抑制
1.2.2 分支代谢途径中的反馈抑制
1.2.2.1 优先合成：分支途径中一个终产物优先被合成，浓度过量后，抑制自身合成途径，使代谢转向合成另一个终产物
1.2.2.2 协同反馈抑制（多价反馈抑制、协作反馈抑制)(concerted feedback inhibition):P210图 8.6
1.2.2.3 合作反馈抑制(增效反馈抑制)(cooperative feedback inhibition):P210图 8.8
1.2.2.4 积累反馈抑制(cumulative feedback inhibition):P210图 8.9
1.2.2.5 同工酶调节(isoenzyme regulation):P211图 8.11, P212图 8.12
1.2.2.4 顺序反馈抑制(sequential feedback inhibition):P212图 8.13, P213图 8.14
1.2.3 反馈抑制的机制
反馈抑制主要的作用方式在于末端产物对反应途径中调节酶的抑制。

受反馈抑制的酶为变构酶(allosteric enzyme),具有与底物结合的催化中心(活性中心)，和与调节因子（效应物）结合的调节中心（变构中心）。

当与效应物结合后，酶发生构象变化，引起酶活性中心对底物亲和力变化，阻碍或促进酶与底物的结合，从而抑制或促进酶活力。

反馈抑制中，终产物作为抑制剂抑制酶活力。

P213图
8.15
1.3 反馈阻遏与反馈抑制的比较
2 次级代谢的调节控制
2.1 次级代谢产物的诱导调节
两种方式:
1 诱导物→刺激影响初级代谢造成代谢流改变→大量生成此生代谢物;
2 诱导物→次生代谢物合成酶的合成→大量生成次生代谢物
2.2 次级代谢产物碳源分解调节
利于生长的碳源往往不利于抗生素的产生: 如在青霉素发酵中, 虽然葡
萄糖被菌体利用最快,但对青霉素合成并不适宜. 而乳糖利用虽然较为缓慢,却能提高青霉素的产量
可能原因: 1 菌体利用最好的碳源能抑制抗生素合成; 速效碳源分解产
物如丙酮酸迅速堆积不利于抗生素合成
部分碳源分解调节见下表(P217 表8.4)
2.3 次级代谢产物氮源分解调节
高氮和速效氮源尤其是氨, 往往不利于抗生素的合成.P217 表 8.5
2.4 次级代谢反馈调节
2.4.1 次级代谢自身产物的反馈抑制
一般产生菌产量越高,对自身抗生素的耐受力越强,反之越敏感
自身抗生素不一定对生长有影响
2.4.2 分支代谢中初级代谢物的反馈调节对次级代谢的影响
方式一:次级途径和初级途径具有共同的分叉中间体, 由分叉中间体产生的初级代谢终产物可能影响次级代谢产物的形成. 如赖氨酸对青霉素合成
的反馈调节,见下图(P220图8.18)
方式二: 在抗生素合成途径中,初级代谢终产物作为前体合成次生产物.
如适量加入外源前体可以显著增加抗生素产量,但过量加入对细胞生长有毒害作用.
P222 表8.7 几种抗生素的发酵的前体
2.5 磷酸盐调节
过量磷酸盐对生长和对抗生素产生均有抑制作用;在生产中,磷酸盐常被
控制在亚适量水平
往往磷酸盐耗尽后抗生素合成才开始
磷酸盐主要影响磷酸酯酶和前体形成过程中某些酶的活性
2.6 细胞膜透性的调节
微生物的细胞膜对细胞内外物质的运输具有高度选择性
代谢产物不能分泌到细胞外,造成反馈抑制
细胞外的营养物质不能进入细胞,造成前体不足,产量下降
3 代谢调节控制育种
3.1 组成型突变株的选育
操作基因或调节基因突变,造成菌株不经诱导也能合成诱导酶, 或解除终产物阻遏的调节突变型. 筛选方法如下:
3.1.1 限量诱导物恒化培养
加入低浓度诱导底物,连续培养,由于培养基中诱导底物浓度控制在对野生型菌株发生诱导的浓度以下,所以诱导型野生型均菌株不能生长,而组成型突变株可以产生相应酶类,得以生长富集
3.1.2 循环培养
1.移接到含诱导物和不含诱导物的培养基上交替连续循环培养, 组成型菌
株在两种培养基中都能快速生长,而野生型菌株在含诱导物的培养基中有较长延滞期,控制培养时间,组成型菌株逐渐占优势.
2.其它筛选方法: P225
3.2 抗分解调节突变株的选育
1.指抗分解阻遏和抗分解抑制突变
2.微生物分解代谢阻遏指代谢过程中某些酶的合成如抗生素合成酶类, 往
往受高浓度葡萄糖或其它易被迅速分解利用的碳或氮源所抑制
3.培养基中过多的糖,磷是合成抗生素关键酶的阻抑物
3.2.1 解除碳源调节突变株的选育
高浓度葡萄糖的存在,其分解产物能阻遏多种抗生素合成的关键酶.
用葡萄糖结构类似物筛选解除碳源调节突变株: 人们发现抗葡萄糖结构
类似物的菌株,常常是分解阻遏脱敏的菌株. 2-脱氧葡萄糖(2-dG)和3-O-甲基葡萄糖(3-mG)不被微生物代谢,也不阻抑生长,并和葡萄糖一样阻遏诱导酶的合成,其阻遏作用甚至更强.
将诱变处理后的微生物涂布在含低浓度2-dG或3-mG和一种迟效碳源的养基上,野生型菌株由于2-dG或3-mG的阻遏作用不能合成利用迟效碳源而不生长,而抗2-dG或3-mG阻遏的突变株能生长形成菌落.
例子见P227~228
3.2.2 解除氮源分解调节突变株的选育
在次级代谢中,铵盐和其他快速利用的氮源对抗生素生物合成具有分解阻
遏调节作用
筛选耐氨基酸突变株,是提高蛋白酶产量的有效方法.
3.2.3 解除磷酸盐调节突变株的选育
1.磷酸盐在许多抗生素,有机酸,核苷酸的发酵中,是初级代谢中菌体生长
的主要制约因子又是不可缺少的营养成分,但过多的磷酸盐对某些产物的产生是不利的,特别是抗生素只有在磷酸盐基本耗尽后才开始合成.
2.磷酸盐作为培养基成分,要严格控制在亚适量水平P231表8.11
3.磷酸盐可以加强初级代谢,推迟抗生素合成
4.机制见P230
5.筛选方法见下图(P231图8.20)
3.3 营养缺陷型在代谢调节育种中的应用
1.营养缺陷型常由结构基因突变引起合成代谢中一个酶失活直接使某个生
化反应发生遗传性障碍,使菌株丧失合成某种物质的能力,导致该菌株在培养基中不添加这种物质,就无法生长.
2.营养缺陷型常常使发生障碍的前一步的中间代谢产物得到积累
3.营养缺陷型由于合成不能完成,解除了终产物的反馈抑制,外加限量的营
养物质,克服生长的障碍,从而使某一中间产物或另一途径的终产物得以积累
3.3.1利用氨基酸缺陷型进行鸟氨酸发酵
直链式反应,谷氨酸棒状杆菌,精氨酸缺陷型,补充亚适量精氨酸或瓜氨酸,大量积累鸟氨酸.P233图8.21
3.3.2 L-谷氨酸的生产
3.3.3 高丝氨酸营养缺陷型菌株用于赖氨酸生产
3. 4 渗漏缺陷型在代谢育种中的应用
渗漏缺陷型是一种特殊的营养缺陷型, 是遗传性营养代谢障碍不完全的
突变型,其特点是酶活力下降而不完全丧失,并能在基本培养基上少量生长.
渗漏缺陷型既能合成少量终产物,又不造成反馈抑制.
例子见 P236
3.5 抗反馈调节突变株的选育
抗反馈调节突变株产物不当积累,不会因其浓度超量而终止产生.
抗反馈突变型:结构基因突变,使相应的酶不能与终产物结合,便失去了终
产物的反馈抑制作用
抗阻遏突变型:由于调节基因突变引起调节蛋白不能与终产物结合而失去
阻遏作用
3.5.1 回复突变引起的抗反馈调节突变株
具有突变基因型的个体通过再突变又成为野生型表型(原养型).
在抗生素生产菌株育种中,发现发生障碍性突变的营养缺陷型,抗生素产
量大多数都比亲株低,而回复突变株往往比亲株高
3.5.2 耐自身产物突变株选育
大多数抗生素合成的水平,往往受抗生素本身的反馈抑制,一个菌株的生
产能力与耐自身抗生素的浓度成正相关.
3.5.3 抗终产物结构类似物突变株的选育
结构类似物和终产物一样能够和变构酶的调节位点结合,引起酶活性的抑
制;它们和终产物不同的是, 终产物和酶结合是可逆的,而类似物和酶结合不可逆,造成酶活性丧失,且其浓度在细胞中不变,对微生物具有致死或抑菌作用;
在含有结构类似物的培养基中野生型细胞不能生长,抗结构类似物突变株
则能生长,这样的菌株不受代谢终产物的反馈抑制阻遏,终产物可以不断积累
抗结构类似物育种成为初级代谢产物,尤其是氨基酸产生菌育种的主流
浓度梯度法:例如抗异烟肼的酵母菌吡哆醇高产株的选育,见下图(P244
图8.28)
3.5.4 耐前体或前提结构类似物突变株的选育
有些抗生素发酵时, 加入前体物可以显著增产,但达到一定浓度时, 前提对生长就有抑制作用, 甚至是抑制终产物的合成.
例子见P245~246
3.6 细胞膜透性突变株的选育
1.选育改变细胞膜透性的营养缺陷型突变型突变株:控制磷脂/细胞膜的合
成,解除细胞膜的渗透屏障,如生物素缺陷型/油酸缺陷型/甘油缺陷型
2.温度敏感型突变株的选育
3.溶菌酶敏感突变株的选育
思考题
1 名词解释：代谢控制育种；葡萄糖效应；
2 酶合成的调节的主要方式
3 阻遏调节主要方式及其原理
4 反馈抑制及其机制
5 图示并说明反馈抑制中的同工酶调节
6 反馈阻遏与反馈抑制的比较,表解说明
7 次级代谢产物的诱导调节两种方式
8 次级代谢产物碳源/氮源分解调节原理和特点
9 次级代谢自身产物的反馈抑制的特点
10 营养缺陷型在代谢调节育种中的应用
11 抗反馈调节突变株特点及类型。