第三章 酶反应动力学

引起酶反应速度降低的原因： 底物浓度的降低；酶的部分失
斜率=[P]/ t = V初速度 活；产物对酶的抑制；产物增
加引起的逆反应速度的增加
时间
t •研究酶反应速度以酶促反应的
初速度(initial speed)为准
酶反应速度曲线
二、底物浓度对反应速度的影响
1、单底物酶促反应动力学
（1））米氏方程（Michaelis－Menten equation
所以 Vm k2 Et
(4)
v
Vm ax S Km S
2.2.3 米氏常数的意义
•当v=Vmax/2时，Km=[S]（ Km的单位为浓度单位）,即 米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底物浓度。
* 是酶在一定条件下的特征物理常数，通过测定Km的
数值，可鉴别酶。
* 可近似表示酶和底物亲合力，Km愈小，E对S的亲合
以 对作图，绘出曲线，横轴截距即 为－值，纵轴截距则是
双倒数作图
米氏常数（Michaelis-constant）的意义
a Km的物理意义
当V＝1/2Vmax时的底物浓度，为Km的物理意义。 即［S］＝Km
Km单位：m(mol)/L
b Km是酶的特征性常数
不同酶,Km是不一样的。 底物种类，pH（opt）,T（opt） 要定下来。
分变性； （3） 随时间延长，产物增加，产物对酶的抑制作用； （4） 产物增加，逆反应速度增加。
因此，只有初速度才是酶的反应速度。
一、酶浓度的影响
酶促反应的速度和酶浓度成正比
[S]>>[E]
V∝[E]
反 应 速 度
0
酶浓度
[P] 产 物 浓 度
反应速度:用单位时间内、单 位体积中底物(S)的减少量或产 物(P)的增加量来表示。单位： 浓度/单位时间
温度影响的两个方面 : 1.温度升高，酶反应速度增加
在达到最适温度之前提高温度，可以增 加酶促反应的速度。
2. 温度升高，酶蛋白变性而失活。
在最适温度以前，第1种影响为主。
在最适温度以后，第2种影响为主。
大部分酶在600C以上变性，到700C－ 800C酶达到不可逆变性；少数酶能耐受较高 的温度，如细菌淀粉酶在950C下活力最高， 又如牛胰核糖核酸酶加热到1000C仍不失活。
第二节双底物酶促反应动力学
双底物双产A物+B反应 P+Q
双底物双产物的反应按动力学机制可分为两大类 :
序列反应
有序反应
（sequential reactions） （orderd reactions）
双底物 双产物的反应
随机反应 （random reactions）
乒乓反应 （ping pong reactions）
V Vmax
Vmax ·[S]
v = —————
km + [S]
可以用一个方程来表示 ：是最基本的 [S] 动力学方程。
V=Vmax[S]/(Km+[S])
酶反应速度与底物浓度的关系曲线
(条件:[E];pH;t等条件固定不变)
原因:中间产物学说解释 E+S ES E+P
在低底物浓度时, 反 应速度与底物浓度成正 比，表现为一级反应特 征;v=k[S]
pH的影响
非特征性常数，只在一定情况下才有意义。
1、 最适pH 当酶反应速度受pH影响，当某个pH，酶表现
最大活力，此pH就是pH（opt）。 pH（opt）不是酶的特征性常数，受测定环境的 影响很大。 2、 pH影响的原因 （ 1） 影响酶的构象（过酸过碱引起酶构象的变 化，使酶失活） （ 2） 影响酶与底物的解离
再用作图法求出Km。 例：双倒数作图法（Lineweaver-Burk法）
米氏方程的双倒数形式：
1 Km 1 1 — = —— . — + ——
v Vmax [S] Vmax
酶动力学的双倒数图线
Vmax [S]
V＝
Km+[S]
Km值的物理意义：即是Km值是 当酶反应速率达到最大反应速率 一半时的底物浓度。(摩尔/升)。
成一个中间复合物, 然后中间复合物再分解, 生成产物并释放
出酶。一般以产物的生成速度代表整个酶催化反应速度，而产
物的生成取决于中间物的浓度. 因此, 整个酶促反应的速度取
决于中间物的浓度.
第一节单底物酶促动力学
单底物酶促动力学 只有初速度才是酶的反应速度，原因： （1） 底物随反应时间的延长减少； （2） 酶随反应时间的延长受速度、pH的影响，酶部
Understanding Vmax
The theoretical maximal velocity Vmax is a constant Vmax is the theoretical maximal rate of the
reaction - but it is NEVER achieved in reality To reach Vmax would require that ALL enzyme
米氏方程讨论
当底物浓度较低时,有[S]Km,代入米氏方程 则有v=Vmax/Km[S],即反应速度与底物浓度呈 正比,符合一级反应
当底物浓度很高时,有[S]Km,代入米氏方程 则有v=Vmax,即反应速度与底物浓度无关,符合 零级反应
当[S]=Km时,v=Vmax/2
S E k1
S Et ES
第三章 酶反应动力学
中间产物学说 第一节单底物酶促动力学 第二节双底物酶促反应动力学 第三节 酶反应影响因素
中间产物学说
酶动力学研究始于1902年，当时，A.Brown用酵母β-呋喃
果糖糖苷酶对蔗糖进行水解。他发现当蔗糖的浓度比酶的浓度
高许多时，反应速度不再取决于蔗糖的浓度，即是说，反应速
度相对于蔗糖来说是零级反应。因此，他提出，蔗糖水解的总
反应是由两个基本反应构成，第一步是底物与酶形成一种复合
物，第二步是这种中间物生成产物并释放出酶:
k1
k2
E + S ←→ ES → P + E
k-1
这里,E、S、ES和P分别代表酶、底、酶-底物复合物和产物。
中间产物学说认为, 当酶催化某个反应时, 酶和底物先结合形
(3)Kcat / km的意义
Kcat / km =
K3 K1 K2 + K3
K m = K2 + K3 K1
• 上限为108~109mol-1 ·L ·s-1
• 大小可以比较不同酶或同一种酶催化不同底物的催化 效率。
3. 利用作图法测定 km 和 Vmax
根据实验数据作图 v ~ [s]
V Vmax
当底物浓度较高时[S] 增加,反应速度v增加, 但增加幅度较小
当底物浓度达到一定 值，反应速度达到最大
值（Vmax），此时再增
加底物浓度，反应速度 不再增加，表现为零级
反应。v= Vmax
V
零级反应
混合级反应
一级反应
[S]
中间复合物学说：
第一步: E+S ES 第二步: ES→E+P V∝[ES]
Vmax 2
Km
[s]
双倒数作图法
1 v
~
1 [S]
Vmax [S] V＝ Km+[S]
1 v
(2) Eadie - Hofstee 作图法
v
v = Vmax – Km · [S]
v
Vmax
v
v ~ [S]
Vmax [S] V＝ Km+[S]
– Km
Vmax Km
v [S]
单底物酶促反应的反应速度与底物浓度呈 双曲线关系，不易直接求出Vmax和Km的 值，通常采用双倒数法进行参数估计。将 米氏方程改写成以下形式
molecules are tightly bound with substrate Vmax is as symptotically approached as
substrate is increased
米氏常数的测定
双倒数作图法，即 1/V对1/S作图
Lineweaver-Burk法。
1 Km 1 1 v Vmax [S] Vmax
则：KmES ESS Et S
经整理得： ES
Et S Km S
(1)
由于酶促反应速度由[ES]（2）代入（1）得：
v k2
Et S Km S
v
k2Et S Km S
(3)
当[Et]=[ES]时， v Vm
将（4）代入（3），则：
Km是酶的一个特性常数与酶的性 质有关，与酶浓度无关，只是对 一定底物、一定的pH、一定的温 度条件而言。
对活细胞的实验表明：酶的 物浓度通常就在这种底物的Km 附近，不是大大高于或大大低于
Km?
V＝ Vmax 得 Vmax
2
2
Vmax[S] 化简得： Km=[S] Km + [S]
2. 动力学参数的意义
Km
k1 k2 k1
Km is, under true Michaelis-Menten conditions, an estimate of the dissociation constant of E from S,
because E S k1
ES at equilibrium, k1[E]S k1[ES]
（E） A＋B C＋D 此酶有4个Km值
c 在一定条件下，Km表示酶与底物的亲和力
有些酶有很多底物，Km值最小的底物叫此酶的最适 底物，也叫酶的天然底物。
d 已知Km，可以求出V/Vmax与底物浓度[S]的关系。
测定Km的意义：（以上4点）
Understanding Km
Km is a constant derived from rate constants
力愈大，Km愈大，E对S的亲合力愈小。
*在已知Km的情况下，应用米氏方程可计算任意[s]时的
v，或任何v下的[s]。（用Km的倍数表示）
练习题：已知某酶的Km值为0.05mol.L-1，要使此酶所催化的反 应速度达到最大反应速度的80％时底物的浓度应为多少？
2.2.4 米氏常数的测定
基本原则： 将米氏方程变化成相当于y=ax+b的直线方程，
例：丙酮酸可被乳酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶和丙酮酸脱 羧酶催化，当丙酮酸浓度较低时，走哪条途径？ Km分别为 1.7×10-5、 1.3×10-3和 1.0×10-3mol/L
(2) Vmax 和 k3 (kcat) 的意义
K1
E +S
K2
[ES]
K3
P+E
K4
Kcat值越大，表示酶的催化效率越高。
k-1
Reversible reaction, dissociation constant is
Kd
[E]S
[ES ]
k 1 k1
So small Km means tight substrate binding; high Km means weak substrate binding.
Km equals to the substrate concentration at which v=1/2vmax
(1)Km值的意义
K1
E +S
K2
[ES]
K3
P+E
K4
Km = K2 + K3 K1
KS = K2 K1
Km = Ks
酶 过氧化氢酶 脲酶
蔗糖酶
谷氨酸脱氢酶 乳酸脱氢酶
底物 H2O2 尿素 蔗糖 棉子糖 谷氨酸 α—酮戊二酸 丙酮酸
Km（mmol/L） 25 23 28 350 0.12 2.0
序列有序反应；序列随机反应；乒乓反应；
AB
E AE AEB
P
Q
QEP QE E
A + E AE B + E EB AEB
QE QEP EP
Q+E E+P
A
E AE
PB
Q
PE
E EB EQ E
1．序列有序反应
2．序列随机反应
3．乒乓反应
第三节 酶反应影响因素
温度的影响 酶的最适温度（optimum temperature）
1913年Michaelis和Menten推导了米氏方程
v Vmax [S] K m [S]
酶促反应的米氏方程及Km
E S k1 ES k2 k1
米氏常数:
Km
k1 k2 k1
米氏方程:
v
Vm ax S Km S
PE
推导原则：从酶被底物饱和的现象出发，按照
“稳态平衡”假说的设想进行推导。
0.017
❖ KM值与米氏方程的实际用途： 例：当[S] = 3Km时，反应速率相当于Vmax的百分数？
Vmax [S]
V＝
Km+[S]
当Km已知时，任何底物浓度下被酶饱和的百分数可 用下式表示：
[s]
fES =
Km + [s]
❖可帮助推断某一 代谢反应的方向和途径和限速步骤 例：酶1，2，3分别催化 A 1 B 2 C 3 D Km分别为10-2, 10-3, 10-4，A，B，C 浓度均为10-4 限速步骤？
k1
ES k2 P E
ES
[ES]生成速度：v1 k1Et ES S ，[ES]分解速度：v2 k1ES k2ES
米
当酶反应体系处于恒态时： v1 v2
氏 方 程 的 推 导
即： k1Et ESS k1ES k2ES
Et
S ES ES
S
k1 k1
k2
令： k1 k2 Km k1