凝胶法鲎试剂测内毒素

凝胶法测内毒素

1)实验原理:

本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。

细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。

内毒素的量用内毒素单位(EU)表示。细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成。用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中鲎试剂灵敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。

凝胶法细菌内毒素检查用水系指内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水。试验所用器皿需经处理，以除去可能存在的外源性内毒素，常用的方法是250℃干烤至少1小时，也可用其它确证不干扰细菌内毒素的适宜方法。若使用塑料器械，如微孔板和微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。试验操作过程应防止微生物的污染。

制备供试品需根据灵敏度λ确定最大有效稀释倍数（MVD）最大有效稀释倍数是指在试验中供试品溶液被允许稀释的最大倍数，在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。用以下公式来确定MVD：

MVD=c L/λ

其中医用级透明质酸的内毒素限度为0.5EU/mg

2)实验方法

使用的是湛江安度斯生物有限公司生产的鲎试剂盒——灵敏度为λ=0.125-0.25EU/ml.选择λ=0.25EU/ml，孵育时间25分钟的使用方法

1，制备供试液

将所检医用级透明质酸样品配成c=1mg/ml的溶液S0待用，根据灵敏度λ=0.25EU/ml，L=0.5EU/mg,求得最大稀释倍数MVB=cL/λ为2。用水将S0稀释至2倍得供试液

2，制备内毒素溶液：取内毒素检测用水（ETW）及工作标准内毒素（CSE）各一支，开启，

按分析报告书标示价加入0.8ml的ETW复溶CSE,然后在漩涡混合器上混合2-3分钟，得到5EU/mL的CES溶液（E5）

3,检查方法：从试剂盒内取出TAL8支，开启，按下述方法设置检查项目及加样：

如果选择灵敏度λ=0.125EU/mL，应加0.01 mLE5，孵育30+1分钟

加样完毕，轻轻摇匀反应试管中的混合液，把试管置37+0.50C的恒温器中孵育25+1分钟，取出按凝胶法判断反应结果阴性（--）或阳性（+），记录反应结果。

当NC管阴性，PC管管阳性时，试验有效。此时如果S两管为阴性，表明S的内毒素含量少于0.25EU/mL；如果S两管为阳性，表明S的内毒素含量多于0.25EU/mL,已超过该供试品的内毒素限值；

4.结果分析：

将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转1800.若管内形成的凝胶，并且不变形，不从管壁滑落者为阳性；

未形成凝胶或形成的凝胶，变形并从管壁滑落者为阴性（保温和拿取试管过程中应避免受到震动造成假阴性结果）

3.实验结果

试验操作人试验时间