蛋白酶活性电泳实验

蛋白酶活性电泳

活性电泳(明胶酶谱法)

一、实验原理

明胶酶谱法的基本过程是先将样品进行非还原性SDS-PAGE（含0.1%明胶）电泳分离，然后在缓冲系统中使样品中的酶恢复活性，在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶，最后用考马斯亮蓝将凝胶染色，再脱色，在蓝色背景下可出现白色条带，条带的强弱与酶的量和比活成正比。

复性原理：在电泳过程中，SDS与样品中的酶结合（可逆性结合），破坏其氢键、疏水键而使酶不能发挥其分解明胶的作用，而只有当将胶置Triton中震荡洗脱时，由于SDS被Triton结合而去除，从而使酶恢复了活性，此步注意上样缓冲液中不能含有DTT等还原性物质。

通过不同孔径凝胶电泳达到分离蛋白的目的，而活性电泳又能保证蛋白的活性，在孵育条件下，酶对明胶的水解使后期染色出现白色条带，得以定位目的酶。通过对该位置酶的回收与质谱鉴定，得到该酶部分氨基酸序列。

二、材料与方法

1试剂与溶液配制

1.1试剂和仪器：

酪氨酸，酪蛋白，明胶（猪源），Tris，Glycine，TEMED，SDS，过硫酸铵，考马斯亮蓝R250购自sigma公司，为电泳纯；Triton X-100，CaCl2·2H2O，Brij-35（十二烷基聚乙二醇醚），NaCl，乙酸，乙酸钠，碳酸钠，甲醇，乙酸，盐酸，三氯乙酸，福林试剂均为国产分析纯；30%丙烯酰胺溶液（29:1），非还原性5×蛋白上样缓冲液，预染彩虹蛋白marker等购自康为世纪公司。水为去离子水或超纯水。

主要仪器：紫外分光光度计电泳仪垂直电泳槽高速离心机milipore超滤管等1.2溶液配制

1.2.1 5×SDS-PAGE电泳缓冲液

配法：称取Tris 15.1g，Glycine 94g，加适量去离子水溶解，加入SDS 5.0g，加水至约800ml，注意尽量减少气泡生成，完全溶解后定容至1000ml，室温保存。使用时用去离子水稀释至1×，新配置的电泳液可重复使用1-2次，最好使用新鲜配制的电泳液。

1.2.2 明胶储液（10 mg/ml）

配法：称取明胶0.1 g，加去离子水10 ml，溶解，配好后储存于4℃。若凝固成胶冻状可用温水浴解冻。

1.2.3 10 %过硫酸铵（W/V）

配法：称取1g过硫酸铵；加入10ml的去离子水，将固体粉末彻底溶解；贮存于4℃。注意：10%过硫酸铵最好现配现用，配好的溶液在4℃保存可使用2周左右，过期会凝胶效果会减弱，可适当增加用量。

1.2.4 凝胶配制：

1) 10% SDS-PAGE凝胶之分离胶（含1.0 mg/ml 明胶）

dH2O 3ml

30%丙烯酰胺溶液 3.3 ml

4×分离胶缓冲液 2.5 ml

10%过硫酸铵0.1 ml

TEMED 0.004 ml

10 mg/ml明胶 1 ml

Total 10 ml

2)5%浓缩胶的配置

dH2O 4.56 ml

30%丙烯酰胺溶液 1.36 ml

4×浓缩胶缓冲液 2.0 ml

10%过硫酸铵0.1 ml

TEMED 0.008 ml

10 mg/ml明胶0 ml

Total 8 ml

3) 配制梯度胶的丙烯酰胺凝胶轻溶液（5%）

dH2O 7.25 ml

30%丙烯酰胺溶液 2.50 ml

4×分离胶缓冲液 3.75ml

10%过硫酸铵0.1 ml

TEMED 0.008 ml

10 mg/ml明胶 1.5 ml

Total 15 ml

4) 配制梯度胶的丙烯酰胺凝胶重溶液

15% 20%

dH2O 1.0 ml 0

30%丙烯酰胺溶液7.50 ml 10.0

4×分离胶缓冲液 3.75ml 3.75ml

10%过硫酸铵0.1 ml 0.1 ml

TEMED 0.01 ml 0.01 ml

10 mg/ml明胶 1.5 ml 1.5 ml

Total 15 ml 15 ml

重溶液添加蔗糖至0.1g/ml，增加溶液密度。

1.2.5洗脱液（1×）

配法：量取Triton X-100 25 ml，加去离子水定容至1000 ml即可。

1.2.6孵育液（1×）

配法：

1)中性孵育液：称取 Tris碱6.06 g，CaCl2·2H2O 0.74 g（或CaCl2 0.555 g），Brij-35 0.2 g，NaCl 11.7 g；加水至800 ml；用浓HCl调pH至7.6；定容至1000 ml。2)弱酸性孵育液40g NaCH3COOH·3H2O溶于适量水，6mol CH3COOH 168mL，CaCl2·2H2O 0.74 g（或CaCl2 0.555 g），Brij-35 0.2 g，NaCl 11.7 g，加水至800，用冰乙酸调pH至4.0，定容，1000mL。

1.2.7 0.5%（w/v）考马斯亮蓝R-250(400 ml)

配法：称取2 g考马斯亮蓝R-250，置于1 L烧杯中；量取100 ml异丙醇加入上述烧杯中，搅拌溶解；加入40 ml冰醋酸，搅拌均匀；加入260 ml去离子水，搅拌溶解；用滤纸过滤除去颗粒物质后，室温保存。

1.2.8 考马斯亮蓝脱色液（400ml）

配法：甲醇：乙酸：水=5：1：4 。

2 实验方法

2.1蛋白酶样品制备

样品液前处理：发酵液10000g 离心，上清液经3kD超滤管6500 rpm浓缩，得到粗酶液，﹣20℃保存。

2.2 样品液蛋白酶活性的测定（福林一酚试剂法）

2.2.1 标准曲线的制作：精确称取烘干的酪氨酸50mg，加少量0.2 mol/L盐酸溶解，用50mmol/L的Tris-HCl (pH9.0) 缓冲液定容至100 mL，分别配成0-100

μgm/L的不同浓度的溶液。不同浓度酪氨酸溶液各取lmL，加2%酪素l mL，于50℃水浴中反应15分钟，然后加入10%三氯乙酸(TCA) 2 mL，离心，取上清液l mL，加入0.4mol/L的碳酸钠5 mL，再加入福林试剂l mL，于37℃水浴中显色15分钟，在680 nm波长比色，测光密度(O.D)。以光密度读数为纵坐标，酪氨酸的微克数为横坐标，绘制标准曲线。

2.2.2 样品测定：取适当稀释的酶液l mL，加入2%酪素l mL，以下操作同上，同时作对照管。