实验设计

毕业论文实验设计

一﹑实验题目：Pb2+对蚕豆幼苗生长的影响

二﹑实验器材及试剂：

三﹑实验操作：

1、对蚕豆幼苗的处理

选用大小均匀、健康饱满的蚕豆种子,用蒸馏水浸泡4h后,置于30℃培养箱中催芽,萌芽后播种于装有蛭石基质的培养钵中。用1/2 Hoagland培养液浇灌,待长出2片真叶后,选择长势一致的幼苗,移栽至装有2L 1/2 Hoagland 培养液的玻璃水槽中,放在自然光下每天间歇性通气4～6h进行培养,每3d 更换一次培养液。一周后随机分配13组（编号0—12号）。

2、Pb2+对蚕豆幼苗生长的影响

将0号的蚕豆幼苗，转移至含无离子水的新鲜1/2 Hoagland培养液中， 1-4号的蚕豆幼苗分别转移到含有10﹑20﹑50 和100 mg/L Pb2+的新鲜1/2 Hoagland培养液中( 用Pb(NO3)2配制)。每2d 补充浇灌等量的含相应浓度的培养液。于第7天采样测定各项生理生化指标。

3、生理生化指标的测定

3.1 根系、茎叶部分的干重及根冠比

分别取蚕豆根系部分和茎叶部分,用去离子水冲洗干净，采用烘干法，将其放在称量瓶中，在105℃下杀青0．5h之后置于75℃恒温处理48h，用1/1000 电子天平称其干重，并计算根冠比。

根冠比=根系干重/茎叶干重

叶绿素含量的测定；丙二醛(MDA)含量测定；质膜透性测定；超氧化物歧化酶(SOD)活性测定；过氧化物酶(POD)活性测定；脯氨酸含量测定。各项指标测定时至少做3个重复，取平均值。

3.2其它生理生化指标具体的测定方法

3.2.1 叶绿素含量的测定

一、原理

根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即A＝αCL式中：α比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，α为该物质的吸光系数。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物

质在不同波长下的吸光度而求得。如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。这就是吸光度的加和性。今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。

二、材料、仪器设备及试剂

（一）材料：新鲜（或烘干）的植物叶片。

（二）仪器设备：1. 分光光度计；2. 电子顶载天平（感量0.01g）；3. 研钵；4. 棕色容量瓶；5. 小漏斗；6. 定量滤纸；7. 吸水纸；8. 擦境纸；9. 滴管。

（三）试剂：96％乙醇（或80％丙酮）；石英砂；碳酸钙粉。

三、实验步骤

1. 取新鲜植物叶片（或其它绿色组织）或干材料，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。

2. 称取剪碎的新鲜样品0.2g，共3份，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2～3ml95％乙醇，研成均浆，再加乙醇10ml，继续研磨至组织变白。静置3～5min。

3. 取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25ml棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。

4. 用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用乙醇定容至25ml，摇匀。

5. 把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内。以95％乙醇为空白，在波长665nm、649nm下测定吸光度。

四、实验结果计算：

将测定得到的吸光值代入下面的式子：C

a =13.95A

665

－6.88A

649

；C

b

=24.96A

649

－7.32A

665。据此即可得到叶绿素a和叶绿素b的浓度（C

a

、C

b

：mg/L），二者之和

为总叶绿素的浓度。最后根据下式可进一步求出植物组织中叶绿素的含量：叶绿素的含量（mg/g）= [叶绿素的浓度×提取液体积×稀释倍数]/样品鲜重（或干重）。

3.2.2 质膜透性测定（电导率法）

一、原理

植物细胞的细胞质由一层质膜包围着，这种质膜具有选择透性的独特功能。植物细胞与外界环境之间发生的一切物质交换都必须通过质膜进行。各种不良环境因素对细胞的影响往往首先作用于这层由类脂和蛋白质所构成的生物膜。如极端的温度、干旱、盐渍，重金属离子（如Cr6+等）和大气污染物（如SO

2

、HF、

O

3

）等都会使质膜受到不同程度的损伤，其表现往往为细胞膜透性增大，细胞内部分电解质外渗，外液电导率增大。该变化可用电导仪测定出来。细胞膜透性变得愈大，表示受害愈重，抗性愈弱，反之则抗性愈强。

二、材料、仪器设备

1. 材料：蚕豆幼苗叶

2. 仪器设备：电导仪；电子天平；冰箱；真空泵；真空干燥器；恒温培养箱；电炉；50ml烧杯；50ml量筒；小镊子；纱布；表皿；滤纸条；镜头纸；剪刀；玻棒；胶头滴管；瓷盘。

三、实验步骤

1. 清洗用具

所用玻璃用具均需先用洗衣粉清洗，然后用自来水、蒸馏水洗3次，干燥后备用。

2. 实验材料的准备及处理

选取叶龄﹑层次相同的豆幼苗叶，剪下后用湿布包住。实验时用自来水将供试叶片冲洗，除去表面沾污物，再用蒸馏水冲洗1～2次，用干净纱布轻轻吸干叶片表面水分。狭长叶片可用刀片切成约1cm长段，宽大叶片应避开大叶脉，用打孔器打取原片。将上述材料充分混匀。快速称取鲜样三份，每份1g，分别放入编号为A、B、C的三个烧杯中。作如下处理：

A杯放入冰箱0℃以下作低温处理，处理15～30min后取出（供试叶片也可以在实验前低温处理好待用，处理温度及时间依不同植物叶片耐寒性而定），加入蒸馏水50ml。

B杯常温处理，加入蒸馏水50ml。

将A、B二杯放入真空干燥器，用真空泵抽气20—30min（以抽出细胞间隙中的空气），然后缓缓放入空气，从真空干燥器中取出A、B杯。

C杯加入蒸馏水50ml，称重，盖上表皿，置于电炉上煮沸10～15min（煮沸时间依不同植物叶片而定），冷却后再称重并加蒸馏水至原重量，继续浸泡叶片。

将A、B、C三杯放置室温下浸提1 h左右（经常摇动，以有利电解质外渗）。然后将叶片从杯中夹出进行下一步测定。

3. 电导率测定

用电导仪分别测定A、B、C三杯的电导率，同时测定蒸馏水（空白）的电导率（注意：每测定完一个样液后，用蒸馏水漂洗电极，再用滤纸将电极擦干，然后进行下一个样液的测定），所测得的结果记入下表：

电导率测定记录表

处理电导率(μS · cm－1) 电解质的相对外渗率（％）

蒸馏水（空白）

A（低温）

B（常温）

C（煮沸）

四、结果计算

按下公式计算低温及常温处理电解质的相对外渗率：

处理电导率－空白电导率电解质的相对外渗率（％）＝——————————————× 100

煮沸电导率－空白电导率