第05章酶与其他生物催化剂(二)

V
=
V
max
K
V m [ S ]
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直线的斜率为-Km，直线的纵轴截距为Vmax
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三、酶促反应速率与酶的浓度相关
当[S]＞＞[E]，酶可被底物饱和的情
况下，反应速率与酶浓度成正比。
关系式为：V =
k3 [E]
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A：底物浓度曲线，其中，[E]1 > [E]2 > [E]3。从图中可 知， [E]的变化不影响酶促反应的Km。 B：反应速率对酶浓度作图，V与[E]呈直线关系。
单底物、单产物反应； 酶促反应速率（velocity，V）一般在规定的 反应条件下，用单位时间内底物的消耗量和 产物的生成量来表示； 反应速率取其初速率，即底物的消耗量很小 （一般在5﹪以内）时的反应速率； 底物浓度远远大于酶浓度。
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一、采用酶促反应初速率来研究酶促反 应动力学
（一）酶活性是指酶催化化学反应的能力
同一酶对其所催化的不同底物有不同的Km； 不同酶对同一底物也有其各自的Km 。 Km的范围多在10-6～10-2mol/L之间。
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一些酶对底物的Km
酶 己糖激酶（脑） 底物 ATP D-葡萄糖 D-果糖 HCO3 甘氨酰酪氨酰甘氨酸 N-苯甲酰酪氨酰胺 -半乳糖苷酶 过氧化氢酶 溶菌酶 D-乳糖 H 2O2 己-N-乙酰2葡萄糖胺
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2．间接测定法利用非酶辅助反应对底物或产物 的变化进行间接检测 有些酶促反应的底物和产物不能直接进行检测， 必须增加一些辅助试剂来达到检测的目的，这种方 法称为间接测定法（indirect assay）
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3．偶联测定法不直接涉及原始反应的底物或产物
许多酶促反应的底物和产物虽然不能直接检测，但可 以与另外的酶反应相偶联，偶联的酶以第一个酶的产物为底 物，或以此类推，以最后的酶反应产物可以直接检测为目的。 这种通过偶联其他酶并对此酶促产物进行直接检测，间接地 反映待测酶反应的底物或产物变化量的方法称为酶偶联测定 法（enzyme coupled assay）
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四、酶促反应速率受反应系统温度的影响
双重影响
温 度 升高 ， 酶促 反 应速率升高；由于酶的 本质是蛋白质，温度升 高，可引起酶的变性， 从而反应速率降低 。
最适温度
(optimum temperature)： 酶促反应速率最 快时的环境温度。
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哺乳动物组织中酶的最适温度多在35～40℃之间
Km（mol/L）
4 104 5 105 1.5 103 2.6 102 1.08 101 2.5 103 4.0 103 2.5 102 6.0 103
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碳酸酐酶 胰凝乳蛋白酶
3．Km在一定条件下可表示酶对底物的亲和力
Km = k2 + k3 k1
衡量酶活性的尺度是酶促反应速率的大小。 酶促反应速率可用单位时间内底物的减少量 或产物的生成量来表示。 由于底物的消耗量不易测定，所以实际工作 中经常是测定单位时间内产物的生成量。
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酶的活性: 以国际单位（international unit, IU）表示。 在规定的实验条件下（如温度、pH的限定和足
Vmax
Vmax/2 Km
Vmax 2
Vmax[S] ＝ Km + [S] Km＝[S]
[S]
∴Km值等于酶促反应速率为最大反应速率一半 时的底物浓度，单位是mol/L。
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2．Km是酶的特征性常数
在酶的结构、溶液pH、温度等条件不变的情 况下，酶促反应底物的Km不因反应中酶浓度的改 变而不同。 Km只与酶和底物的种类以及反应环境（ pH、温 度、离子强度）有关，而与酶浓度无关。
整理得： ([Et]－[ES])[S] [ES] k2+k3 k1 ＝ k2+k3 k1
(2)
令：
＝ Km （米氏常数）
则(2)变为: ([Et]－[ES]) [S] ＝Km [ES]
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整理得:
[Et][S] [ES]＝─── Km + [S] k3[Et][S] V＝──── Km + [S]
当k3 << k2时，Km k2/k1。即相当于ES分解为 E + S 的解离常数（dissociation constant, Ks）。此 时，Km代表酶对底物的亲和力。 Km越大，表示酶对底物的亲和力越小； Km越小，表示酶对底物的亲和力越大。
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4．kcat代表酶的转换数 kcat = Vmax /[Et]
E与S形成ES复合物的反应是快速平衡反应，
而ES分解为E及P的反应为慢反应，反应速率取决
于慢反应。即 V＝k3[ES]
(1)
S的总浓度远远大于E的总浓度，因此在反应 的初始阶段，S的浓度可认为不变即[S]＝[St]。
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2．稳态的概念介入米氏方程式的推导过程
稳态：是指ES的生成速率与分解速率相等， 即 [ES]恒定。 k1 ([Et]－[ES]) [S]＝k2 [ES] + k3 [ES]
物浓度关系的数学方程式，即米-曼氏方程式， 简称米氏方程式(Michaelis equation)。
Ｖ＝
[S]：底物浓度
──[S] K +
m
Vmax[S]
V：不同[S]时的反应速率 Vmax：最大反应速率(maximum velocity)
Ｋm：米氏常数(Michaelis constant)
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米-曼氏方程式推导基于两个假设：
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二、酶促反应速率受底物浓度的影响
（一）酶促反应的底物浓度曲线是矩形双曲线
在酶浓度和 其他反应条件 不 变的情况下， 反 应速率V对底物 浓度[S]作图呈矩 形双曲线。
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V
Vmax
[S] 当底物浓度较低时 反应速率与底物浓度成正比；反 应为一级反应。
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V
Vmax
[S]
随着底物浓度的增高 反应速率不再成正比例加速；反应 为混合级反应。
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七、酶活性可被许多抑制剂可逆地或 不可逆地抑制
（一）可逆性抑制剂与酶非共价结合

酶的抑制剂(inhibitor)
凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白 变性的物质称为酶的抑制剂。
区别于酶的变性
• 抑制剂对酶有一定选择性 • 引起变性的因素对酶没有选择性
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可逆性抑制（reversible inhibition）
kcat 表示酶被底物完全饱和时，单位时间内 每个酶分子（或活性中心）催化底物转变成产物 的分子数。 kcat也称为酶的转换数(turnover number)，单 位是s1 。
多数酶的转换数在1104 s1之间
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一些酶的转换数 酶 底物 转换数 （s1）
过氧化氢酶
碳酸酐酶 乙酰胆碱酯酶
够的底物浓度等），每分钟催化1mol底物转变成
产物所需要的酶量为1个国际单位（IU）。
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催量（Katal）
1催量是指在特定条件下，每秒钟将1mol 底物转化成产物所需的酶量 1IU＝16.67×10－9 Kat 比活性（specific activity）：比较酶的纯度 比活性单位是每mg蛋白质所含酶的国际单位数， 其单位是IU mg 蛋白1
Taq DNA聚合酶最适温度为72℃
* 低温的应用
一般的酶在低温下活性降低，但酶本身不 被破坏，其活性可随温度的回升而恢复。 低温保存酶和菌种等生物制品
低温麻醉
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五、酶的活性依赖于反应系统的pH
最适pH
(optimum
pH)：
酶催化活性最 大时的环境pH。 体内酶的最适 pH多在6.5～8之间。
胃蛋白酶的最适pH为1.8 精氨酸酶的最适pH为9.8
pH对几种酶活性的影响
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六、激活剂可加速酶促反应速率
酶的激活剂（activator） 使酶从无活性变为有活性或使酶活性增加的物质 必需激活剂（essential activator） 为酶促反应所必需，如缺乏则测不到酶的活性。 Mg2+为己糖激酶的必需激活剂 非必需激活剂（non-essential activator） 可以提高酶的催化活性，但不是必需的。 Cl-对唾液淀粉酶的激活作用
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（二）酶促反应初速率是反应刚刚开始时测得 的反应速率
酶促反应初速率是指反应刚刚开始，各种影响 因素尚未发挥作用时的酶促反应速率，即反应时间 进程曲线为直线部分时的反应速率。
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（二）有三类方法对底物和产物的变化量进行检测
1．直接测定法是对底物或产物的含量变化进行直 接检测
有些酶促反应可在反应进行一定时间后，不用任 何辅助反应便可直接测定反应液中底物或产物的浓度。 这类测定方法称为直接测定法（direct assay）。 还原型（Fe2+）细胞色素c在波长550nm处有明显 的吸收峰，而氧化型（Fe3+）则无；细胞色素c氧化酶 对细胞色素c的氧化反应，可以直接在波长550nm处检 测一定时间内还原型细胞色素c的减少过程 。
第三节 酶促反应动力学
The Kinetics of Enzymatic Reactions
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概念 研究各种因素对酶促反应速率的影响，并 加以定量的阐述。

影响因素包括有
酶浓度、底物浓度、pH、温度、抑制剂、 激活剂等。
※ 研究一种因素的影响时，其余各因素均恒定。
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研究前提
I. II.
III. IV.
外加的酶称为工具酶或辅助酶（auxiliary enzyme） 产物可直接检测的酶称为指示酶（indicator enzyme）
丙氨酸转氨酶 丙氨酸 + -酮戊二酸 丙酮酸 + 谷氨酸 乳酸脱氢酶 丙酮酸 + NADH + H+ 乳酸 + NAD+ （在340nm处有吸收峰） （在340nm处无吸收峰）
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2．其他一些作图法也可较准确地求取Vmax和Km 海涅斯-沃尔弗作图法（Hanes-Wolff plot） 双倒数方程式两边同时乘以[S] [ S ] V = V K m max
1
+ [ S ]
V
max
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直线的斜率等于1/Vmax，横轴截距为-Km
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伊迪-霍夫斯蒂作图法（Eadie-Hofstee plot） 米氏方程式两边均除以[S]
H2O 2
HCO3 乙酰胆碱
40 000 000
400 000 14 000
-内酰胺酶
延胡索酸酶 Rec A蛋白
苄青霉素
延胡索酸 ATP
2 000
800 0.4
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5．在低底物浓度时，kcat/Km代表酶的催化效率 当[S]<< Km时
V=
kcat Km
[ Et] [ S ]
kcat/Km是此二级反应的速率常数，也称特异 性常数，其单位是L· 1· 1 。 mol S 反应速率的大小取决于E和S由于相互渗透而 相互碰撞的速率。.这种被渗透控制的碰撞速率 (diffusion-controlled rate of encounter，DCRE)的 上限是108109L· 1·1 。kcat/Km 越接近此数据， mol s 酶的催化效率越高。
(3)
将(3)代入(1) 得
(4)
当底物浓度很高，将酶的活性中心全部饱和时， 即[Et]＝[ES]，反应达最大速率 Vmax＝k3[ES]＝k3[Et] (5)
Vmax[S] 将(5)代入(4)得米氏方程式： V＝──── Km + [S]
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（三）动力学参数可用来比较酶的动力学 性质与活性
1．Km值相当于V为Vmax一半时的[S] V
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V
Vmax
[S] 当底物浓度高达一定程度 酶被底物所饱和，反应速率不再增 加，达最大速率；反应为零级反应。
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（二）底物浓度与反应速率的关系可用米氏 方程式表示 1．米氏方程式可以很好地解释底物浓度曲线
酶促反应模式——中间产物学说
k1 k2 k3
E+S
ES
E+P
中间产物
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※1913年Michaelis和Menten提出反应速率与底
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一些kcat/Km值接近DCRE的酶
酶 乙酰胆碱酯酶 碳酸酐酶 过氧化氢酶 巴豆酸酶 延胡索酸酶 磷酸丙糖异构酶 -内酰胺酶 超氧化物岐化酶 kcat/Km （L· 1·1） mol S 1.6 108 8.3 107 4 107 2.8 108 1.6 108 2.4 108 1 108 7 109
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（四）酶促反应动力学参数可用作图法求得
1．双倒数作图法是求取Vmax和Km的最常用方法 林-贝方程式（Lineweaver-Burk equation） 将米氏方程式两边取倒数，并加以整理， 则得出米氏方程式的双倒数形式 ： 1 V = Km Vm ax 1 + 1
[S ]
Vm ax
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直线在纵轴的截距等于1/Vmax，而在横轴 上的截距为1/Km