真核细胞常见表达载体

真核细胞常见表达载体

1. pCMVp-NEO-BAN载体

特点: 该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo 基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。

插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。

2. pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(E nhanced Fluorecent Protein Vector)

特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。

用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。

亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。

Excitation maximum = 488 nm; Emission maximum = 507

图示为启动子分泌信号肽和多克隆位点区域：

Ase1.pCMV…ccg cta gcg cta ccg gtc gcc acc atg- .EGFP…BamH1…SV40 poly A+

Nhe1 Age1

3. pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体

特点: pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。

用途: pEGFP-Actin载体在真核细胞表达EGFP-Actin融合蛋白，该蛋白能整合到胞内正在生的肌动蛋白，因而在活细胞和固定细胞中观察到细胞内含肌动蛋白的亚细胞结构。

Excitation maximum = 488 nm; Emission maximum = 507

图示为启动子和多克隆位点区域：

pCMV….Nhe1….Age1….EGFP…Bgl11…Actin…BamH1…SV40 poly A+

4. pSV2表达载体

特点：该表达质粒是以病责SV40启动子驱动在真核细胞目的基因进行表达的，克隆位点

为Hind111。SV40启动子具有组织/细胞的选择特异性。此载体不含neo基因，故不能用来筛选、建立稳定的表达细胞株。

图示为启动子和多克隆位点区域：

Pvu11…pSV40….Hind111….SV40 IVS….SV40 polyA+

5．CMV4 表达载体

特点:该真核细胞表达载体由CMV启动子驱动，多克隆区域酶切位点选择性较多。含有氨苄青霉素抗性基因和生长基因以及SV40复制原点和fl单链复制原点。但值得注意的是，该表达载体不含有neo基因，转染細胞后不能用G418筛选稳定的表达细胞株。

图示为启动子和多克隆位点区域：

CMVp…Bgl11…Kpn1…Mlu1…Cla1…Hind111…Xbal1…Sma1…GH…….SV40 ori

其他常用克隆V ector：

pBluscript II KS DNA 15 ug

pUC18 DNA 25 ug

pUC19 DNA 25 ug

说明:

pBluescript II kS、pUC18 & Puc19载体适合于DNA的克隆、DNA测序和对外源基因进行表达等。这些载体由于在lacZ基因中含有多克隆位点，当外源DNA扦入，转化lacZ基因缺乏细胞，并在含有IPTG和X-gal的培养基上培养时，含有外源DNA载体的细胞将为白色菌落，而无外源DNA载体的细胞则为兰色菌落，由此易于筛选有无外源DNA的载体。此外，这些载体中有便于测序的M13、T7和T3的通用引物进行DNA测序。

保存液: TE Buffer

TE Buffer组成:

10 mM Tris.HCL(Ph 8.0)

真核细胞表达外源基因的调控

1．真核基因组的复杂性

与原核生物比较，真核生物的基因组更为复杂，可列举如下。

（1）真核基因组比原核基因组大得多，大肠杆菌基因组约4×106bp，哺乳类基因组在109bp 数量级，比细菌大千倍；大肠杆菌约有4000个基因，人则约有10万个基因。

（2）真核生物主要的遗传物质与组蛋白等构成染色质，被包裹在核膜内，核外还有遗传成分(如线粒体DNA等)，这就增加了基因表达调控的层次和复杂性。

（3）原核生物的基因组基本上是单倍体，而真核基因组是二倍体。

（4）如前所述，细菌多数基因按功能相关成串排列，组成操纵元的基因表达调控的单元，共同开启或关闭，转录出多顺反子(polycistron)的mRNA；真核生物则是一个结构基因转录生成一条mRNA，即mRNA是单顺反子(monocistron)，基本上没有操纵元的结构，而真核细胞的许多活性蛋白是由相同和不同的多肽形成的亚基构成的，这就涉及到多个基因协调表达的问题，真核生物基因协调表达要比原核生物复杂得多。

（5）原核基因组的大部分序列都为基因编码，而核酸杂交等实验表明：哺乳类基因组中仅