液体活检的检测对象

金氪研究-液体活检的检测对象

导语

继上次金氪平台推送了液体活检行业篇的第一部分后，本文将继续介绍液体活检的检测对象。目前，液体活检的三种主要肿瘤来源的生物标志物分别是循环肿瘤细胞（CTC）、循环肿瘤DNA（ctDNA）、肿瘤外泌体。

液体活检的检测对象

液体活检是指通过非侵入性取样，如血液、唾液、尿液等，利用高通量测序技术、过滤、捕获或富集体内肿瘤细胞的基因组信息，把握住癌症的蛛丝马迹，从而对疾病进行动态的观察和治疗，是一种突破性的革新技术。

液体活检的检测样本、对象及其临床应用

资料来源：Clin Cancer Res; 23(10) May 15, 2017

目前，液体活检的三种主要肿瘤来源的生物标志物分别是循环肿瘤细胞（CTC）、循环肿瘤DNA（ctDNA）、肿瘤外泌体。CTC是由原发灶或转移灶释放的，进入外周血循环的肿瘤细胞，侧重于细胞病理，适用于治疗后的病情监测，判断预后等；外泌体所含信息丰富，包括蛋白质，RNA等，不仅能用于临

床诊断，还有可能用于疾病的治疗；ctDNA是肿瘤细胞释放到血液循环系统中的DNA，可通过检测ctDNA的突变信息和甲基化，进行定性和定量分析，适用于早期筛查，个性化用药指导，耐药性监测等。除了以上三种生物标志物，循环肿瘤miRNA也可作为液体活检的检测对象。miRNA由于尺寸较小且能免于RNA 酶介导的降解，致使其在血液或其他体液中通常比较稳定。最近的研究表明在诊断结肠癌时，miRNA表现出比ctDNA更优越的敏感性和特异性。然而，miRNA 能否作为临床上诊断癌症的生物标志物，仍需要克服一些障碍，尤其是不能追溯肿瘤组织来源，以及不能确定是否能够在临床上标准化。

CTC技术的弊端在于血液中CTC的含量极少，且不易提取，其应用范围由此受到了较大限制；外泌体技术目前仍处于早期科研阶段，距大范围市场应用还有较长周期。ctDNA技术手段较为成熟，临床应用最广泛，尤其是在肿瘤早期筛查领域潜力巨大，此外，ctDNA甲基化检测能提高敏感性，且能用于肿瘤定位，判断肿瘤来源。因此，综合技术的成熟度、应用范围的广度、测序成本的合理性等考虑，ctDNA技术是目前最主流的液态活检技术。

CTC、ctDNA和外泌体三种技术的比较

资料来源：宽华集团投研部整理

CTC临床潜力巨大，但捕获难度大，大多数应用局限于研究目的1869年Ashworth首次提出循环肿瘤细胞(CTC)的概念，CTC是由自发或诊疗操作由原发或转移肿瘤中，获得脱离基底膜的能力并进入血液循环的肿瘤细胞，是恶性肿瘤患者出现术后复发和远处转移的重要原因，也是导致肿瘤患者死亡的重要因素。根据其细胞类型的不同，可将CTC分为上皮细胞表型、间质细胞表型和上皮间质细胞混合表型。通过监测CTC类型和数量变化可以实时评估肿瘤动态与治疗效果，有望实现个体化精准用药。

CTC的发展历史

资料来源：宽华集团投研部整理

CTC 是活体肿瘤细胞，可通过计数实现早期筛查和复发监控，亦可通过分离培养和全基因组测序实现指导治疗方案和治疗监测。可在基因组、转录组、蛋白组和代谢组水平分析CTC特性，在癌症的诊断和治疗领域拥有最广阔的发展潜力。CTC的半衰期不超过2.4个小时，仅有少数具有高活性的CTC能存活下来，并有机会在患者其他组织器官中形成转移灶。血液中的CTC含量稀少，1ml血液中含有数十亿个细胞，其中仅包含1个CTC，所以CTC检测的主要挑战是如何对CTC进行捕获。现阶段CTC捕获技术的灵敏度和捕获效率低，漏检率高，因此CTC的大多数应用局限于研究目的，目前还没有建立临床实践。

CTC在癌症治疗中的应用场景

资料来源：参考浙商证券

基于外泌体的液体活检技术需进一步观望

血液中外泌体含量高，稳定强、可长期存储。大多数细胞在正常和病理状态下均可分泌外泌体，肿瘤细胞外泌体即肿瘤细胞脱落的囊泡，携带肿瘤细胞的DNA、RNA和蛋白质等信息，在细胞间物质和信息转导中具有重要作用。外泌体可介导肿瘤细胞增生、免疫耐受和化学抵抗，促进肿瘤血管形成，且其miRNA 有望成为肿瘤诊断的新型标志物。与ctDNA和CTC相比，外泌体具有易于富集、稳定性高且不易降解的特性。据悉在冷库中储存30年的血液也可用于分离检测外泌体，因此可用外泌体建立肿瘤细胞进化发展史“活日记”，记录患者肿瘤组织在治疗过程中产生的一系列遗传信息和蛋白表达的变化情况，便于病情和治疗追踪，可用于癌症的诊断和复发监控。

目前基于外泌体的液体活检技术尚处于起步阶段，但是外泌体凭借其易富集、稳定性高等优势，已获得极高的关注。关于外泌体的文献报道层出不穷，以2015年发表在《自然》杂志上关于利用Glypican-1蛋白作为早期胰腺癌的诊断标准为首。外泌体最先可被应用于癌症早期诊断中，但由于科研成果转化中存在不确定性，技术成熟时间仍需观察。

ctDNA技术是目前最主流的液态活检技术

1948年，科学家首次报道发现了人类血液中循环的DNA（cell-free DNA, cfDNA）；1977年，发现血液中循环的DNA在癌症患者中尤为显著。ctDNA是指肿瘤细胞DNA经脱落或者当细胞凋亡、坏死后释放进入循环系统，游离于细胞外的由肿瘤细胞释放的小片段游离DNA，是cfDNA的一部分。健康人血液中的cfDNA含量极低，通常为10-15 ng/ml，不容易检测到。而癌症病人血液中，根据其病情阶段，可以检测到含量不等的cfDNA或ctDNA。1ml血液中约含有0.08-38 ng ctDNA。ctDNA的半衰期非常短，一般不超过1.5小时。

ctDNA的发展历史

资料来源：宽华集团投研部整理

ctDNA携带着肿瘤细胞中的基因突变和表观遗传学改变信息，包括点突变、DNA甲基化、序列重排、拷贝数差异（copy number variation, CNV）等，其在人体血液循环系统中不断流动，可实时反映肿瘤患者当前信息。对ctDNA 的分析包括定性和定量的分析，其中定性分析包括检测基因突变、缺失、插入、融合、重排、拷贝数变异、甲基化、微卫星不稳定（MSI）和杂合性缺失（LOH）等；定量分析就是计算ctDNA 在血液中实时的含量。定性和定量两种方法均可以反映肿瘤的存在和严重程度。

在液体活检的三种监测对象中，ctDNA技术手段较为成熟，目前已被临床逐渐运用到了从肿瘤的最初诊断到治疗、发展的各个阶段，包括：早期筛查，评估肿瘤的异质性，转移复发风险和预后评估、实时监控治疗反应和耐药，肿瘤分期分级和指导治疗方案选择等。

（1）早期筛查：当肿瘤生长到一定阶段，会向血液循环释放ctDNA，通过检测ctDNA能对癌症早期病人甚至是癌前病变病人进行筛查，该方法能早于传统的