地高辛标记探针的Southern 杂交技术

地高辛标记探针的Southern 杂交技术

根据核酸变性与复性的特性，特定核苷酸序列的单链DNA或RNA能够在一定条件下与具有互补性的核酸链退火形成双链结构，称之为核酸杂交。将已知的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA进行标记，制成核酸探针，就可以用它检测样品中是否存在同源序列，或确定不同物种之间的亲缘关系，已成为分子生物学中一类重要的检测手段，在科学研究和实践中具有十分广泛的用途。它可用于基因组特定DNA序列的定位，测定相关片段的同源性、从cDNA文库、基因组文库中筛选完整基因等。还可以用于构建DNA分子的酶切图谱和遗传图—指纹分析等。

核酸杂交检测都是在滤膜上进行的，常用的滤膜有尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜等。其基本过程包括以下几步。首先将待检样品DNA或RNA分子直接点加到滤膜上，或经过凝胶电泳分离再通过毛细管作用或电导作用被转移到滤膜上，而且是按其在凝胶中的位置原封不动地“吸印”上去的，这个过程称为核酸印迹（nucleic acid blotting）转移，主要有电泳凝胶核酸印迹法、斑点和狭线印迹法（dot and slot blotting）、菌落和嗜菌斑印迹法（colony and plaque blotting）；然后将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。最后，经过放射自显影技术或光化学、免疫学技术显示出不同的颜色，根据颜色的有无和深浅判定结果。根据操作方式和检测对象的不同，核酸杂交技术主要有以下几种：斑点杂交技术（Dot blot）、Southern杂交技术（Southern blot）、Northern杂交技术（Northern blot）。前两者用于检测DNA，后者用于检测RNA。本实验主要介绍Southern杂交技术。

1主要内容

1. Southern Blot方法的原理。

2. DNA琼脂糖凝胶电泳。

3. DNA转移至硝酸纤维素膜/尼龙膜及膜处理。

4. 介绍随机引物法标记DNA探针，Southern blot的预杂交、杂交及显色过程。2目的要求

掌握Southern blot方法的原理；掌握随机引物法标记DNA探针，印迹法转移DNA 至硝酸纤维素膜及膜处理。

3 实验原理

Southern杂交技术是由Edward M. Southern在1975年首先发明的用于检测DNA 的一种核酸杂交技术，并因此而得名。Southern 杂交的原理是将待检测的DNA分子用限制性内切酶消化，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按照其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其他标记物标记的DNA探针进行反应。如果待测物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补原理进行结合，游离的探针洗涤后用显影或其他合适的技术进行检测，从而

显示出待检的片段及其相对大小。

Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：一是将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（blotting）；二是固定于膜上的核酸与同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。见图1。

图 1. Southern blot印迹杂交原理示意图

（a）核酸内切酶消化的基因组DNA；（b）琼脂糖凝胶电泳分离DNA 片段；

（c）凝胶中的DNA谱带转移到硝酸纤维素滤膜上；（d）滤膜与标记的DNA分子探针杂交；

（e）显色显示杂交的DNA谱带。

Southern blot方法十分灵敏，在理想的条件下，用放射性同位素标记的特异性探针和放射自显影技术，即便每条电泳带仅含2ng DNA也能被清晰地检测出来。

一、实验仪器：

尼龙膜；恒温水浴，塑料带，剪刀，平头镊子，封口机，烤箱，台式高速离心机，高压灭菌锅，电泳仪，水平电泳槽，微量移液器，摇床，吸水纸，3MM Whatman 滤纸，干烤皿，玻璃平台等。

二、溶液配制

1．待检基因组DNA、DIG标记和检测试剂盒、各种限制性内切酶等。

2．其他试剂

(1)20 X SSC(1000 mL) :

组分浓度 3.0M的Nacl，0.3M的柠檬酸钠

NaCl 175.32g

柠檬酸钠88.26g

NaOH调pH值到7.0，

(2)洗涤缓冲液Washing buffer 200ml

组分浓度：0.1M Maleic acid, 0.15M Nacl; pH 7.5(20℃); 0.3%(v/v) Tween20.

马来酸： 2.32g

Nacl： 1.75g

Tween20 0.6ml

NaOH固体约1.7g调pH值7.5

(3)马来酸缓冲液Maleic acid buffer 200ml

组分浓度：0.1M Maleic acid, 0.15M Nacl; pH 7.5 (20ºC)

马来酸： 2.32g

Nacl： 1.75g

Tween20 0.6ml

NaOH固体约1.7g调pH值7.5

(4)检测缓冲液Detection buffer 100ml

组分浓度：0.1M Tris-HCl, 0.1M Nacl, pH 9.5(20ºC)

Tris 1.21g,

NaCl 0.584g

MgCl2 1.01g

调ph值到9.5

(5)变性溶液(500 mL)： 1 mol/L NaCl (43.83 g)， 0.5 mol/L NaOH (10 g)，

(6)中和溶液(500 mL)：0.5 mol / L Tris (30.27 g)，3 mol/L NaCl (87.66 g)，用1

mol/L HCl调

(7)5 × TBE (250 mL)：13.5g Tris 6.9g硼酸, 0.9 g EDTA-Na2，定容250 mL

(8)6 ×溴酚蓝载样液：0.25 ％溴酚蓝，40 ％蔗糖

(9)1M Tris-HCl (pH 8.0): 称取12.114g Tris-base, 溶于80ml 蒸馏水中，用HCl

调pH 至8.0后，用蒸馏水定容至100ml，高压灭菌，分装保存。

(10)0.5M EDTA (pH 8.0): 称取18.61g EDTA，溶于80ml蒸馏水中，用NaOH调

pH至8.0后，用蒸馏水定容至100ml，高压灭菌，分装保存。

(11)T E buffer ：取1M Tris-HCl (pH 8.0) 5ml，0.5M EDTA (pH 8.0) 1ml，用蒸馏

水定容至500ml，调pH至8.0后，高压灭菌，分装保存。

(12)10% SDS：称取10g SDS，溶于90ml蒸馏水中，68℃加热溶解，用盐酸调

pH至7.2，定容至100ml。

(13)低严谨度洗膜液：将20 X的SSC 用蒸馏水稀释成2 X SSC，并按照100:1( 2

X SSC: 10% SDS) 加入10% SDS，配成2 XSSC 0.1% SDS。

(14)高严谨度洗膜液：将20 X的SSC 用蒸馏水稀释成0.5 X SSC，并按照