第六章 微生物的生长与控制

按培养器的级数分
菌体生成器
产物合成器
按细胞状态分 一般连续培养器 固定化细胞连续培养器
按用途分 实验室科研用：连续培养器 发酵生产用：连续发酵罐
（三）连续培养技术——恒化连续培养
概念：以恒定流速使营养物质浓度恒定而保持细菌 生长速率恒定的方法。 原理：通过控制某一种营养物浓度（如碳、氮源、 生长因子等） ，使其始终成为生长限制因子，而 达到控制培养液流速保持不变，并使微生物始终在 低于其最高生长速率条件下进行生长繁殖。 特点：维持营养成分的亚适量，控制微生物生长速 率。菌体生长速率恒定，菌体均一、密度稳定，产 量低于最高菌体产量。 应用范围：实验室科学研究
② 稳定期细胞数目及产物积累达到最高。
4、 衰亡期（decline phase）
1）特点： ①群体呈“负生长”； ②细胞常出现多形态； ③菌体死亡、并发生自溶； ④有的会进一步合成或释放对人类有益的抗生素等 次生代谢物 ⑤释放芽孢。 衰亡期比其他各时期时间长，它的长短也与菌种 和环境条件有关。 2）产生原因：生长条件的进一步恶化，使细胞内的分 解代谢大大超过合成代谢，继而导致菌体的死亡
其他名称：指数期 指细胞以几何级数速度分裂的一段时期
1）特点：
生长速率常数最大，即代时最短 细胞进行平衡生长，菌体大小、形态、生理特征等比较一 致 代谢最旺盛
2） 影响因素：
菌种 营养成分 营养物浓度﹡ 培养温度
E.coli 17 分，结核杆 菌 792—932分
大肠杆菌 10℃ 代时860分， 15℃ 代时120 分， 40℃ 代时17.5分
简单易行，但易造成机械损伤
干重法
将一定量的菌液中的菌体通过离心或过滤分离 出来,然后烘干(干燥温度可采用105℃、100℃ 或80℃)、称重。一般干重为湿重的10%—20%， 而一个细菌细胞一般重约10-12—10-13g。 该法适合菌液浓度较高的样品。
比浊法
原理是在一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与混浊度成 正比，即与光密度成正比，菌数越多，光密度越大。因 此，借助于分光光度计，在一定波长下测定菌悬液的光 密度，就可反应出菌液的浓度。
4）影响延滞期长短的因素：
菌种 ： 繁殖速度较快的菌种的延滞期一般较短； ◆接种物菌龄 ： 用对数生长期的菌种接种时，其延滞 期较短，甚至检查不到延滞期； ◆接种量：一般来说， 接种量增大可缩短甚至消除延 滞期； ◆培养基成分：
在营养成分丰富的天然培养基上生长的延滞期比在合成培养基上生长时短； 接种后培养基成分有较大变化时，会使延滞期加长，所以发酵工业上尽量 使发酵培养基的成分与种子培养基接近。
④
选择性培养基分离法
各种微生物对不同的化学试剂、染料、抗生素等具有不同 的抵抗能力，利用这些特性可配制适合某种微生物而限制其它 微生物生长的选择培养基，用它来培养微生物以获得纯培养。 微生物纯培养分离方法的比较
分离方法 平皿划线法 稀释倒平皿法 单细胞挑取法 利用选择培养基法 应用范围 方法简便，多用于分离细菌 即可定性，又可定量，用途广泛 局限于高度专业化的科学研究 适用于分离某些生理类型较特殊的 微生物
Fra Baidu bibliotek
群体生长 = 个体生长 + 个体繁殖
研究生长规律需要解决三个前提：
微生物的纯培养； 微生物生长的测量方法； 微生物的同步生长。
第一节 微生物纯培养分离及生长测定方法
一、获得纯培养的方法
二、微生物纯培养生长的测定方法
一、获得纯培养的方法
纯培养(pure culture)——微生物学中把从一
第二节 微生物的生长规律
一、微生物的个体生长和同步生长
由于微生物细胞极其微小，研究其个体生长存在着 技术上的困难。
1、同步培养：设法使群体中的所有细胞尽量都处于 同样的细胞生长和分裂周期中，然后通过分析此群 体在各个阶段的生物化学特征来间接了解单个细胞 的相应变化规律。 2、同步生长：通过同步培养的手段而使细胞群体中 各个体处于分裂步调一致的生长状态，称为同步生 长
梯度稀释过程 倾注 涂布
即可定性，又可定量，用途广泛。
②平板划线分离法
用接种环沾少许待分离的材料，在培养基表面进行多次平行
划线，使微生物细胞分开生长以获得微生物纯培养的过程
特点：快速、方便。
划线分离后平板上显示的菌落照片
连续划线
③ 单细胞（单孢子）分离法
采用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体 进行培养以获得纯培养的方法。该方法要在显微镜下进行。
血球计数板法
适用范围：个体较大细胞或颗 粒，如血球、酵母菌等。 特点：快速，准确。
染色法
方法：用特殊的染料对活菌染色后再观察或用紫 外光显微镜观察。
丫啶橙染色
活菌发出橙色萦光 死菌发出绿色萤光
活细胞无色
美兰染色 死细胞蓝色
浇注平板法（Pour Plate）
平板涂布分离法（Spread Plate）
典型的生长曲线
延 对 滞 数 期 期
稳定期 衰亡期
生长速率常数(R)=分裂次数(代)/单位时 间 典型的生长曲线按照生长速率常数（growth race constant）不 同分为延滞期、对数期、稳定期和衰亡期
1.延滞期（lag phase）
其它名称：停滞期、调整期、适应期 1）现象：活菌数没增加，曲线平行于横轴。
二、微生物的群体生长 单细胞微生物的群体生长曲线
生长曲线：定量描述液体培养基中微生物群体 生长规律的实验型曲线。
生长曲线代表了细菌在新的环境中从开始生长、 分裂直至死亡的整个动态变化过程。
生长曲线的制作
生长曲线的制作： 接种 适温培养 定时取样测 定生长量
典型生长曲线：将少量单细胞的纯培养，接种到一恒 定容积的新鲜液体培养基中，在适宜条件下培养，每 隔一定时间取样，测细菌细胞数目。以培养时间为横 坐标，以细菌数目的对数为纵坐标，绘制所得的曲线。
第六章 微生物的生长及其控制
本章学习要点
微生物生长的研究方法 环境因素对微生物生长的影响 微生物生长的控制
生长与繁殖的概念
生长——微生物细胞吸收营养物质，进行新陈代谢， 当同化作用大于异化作用时，生命个体的重量和体积 不断增大的过程。 繁殖——生命个体生长到一定阶段，通过特定方式产 生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学 过程。 群体生长——群体中各个个体进一步生长、繁殖。可 以用重量、体积、密度或浓度来衡量。
方式流出培养液，使培养物达到动态平衡，其中的微生物就能 长期保持对数期的平衡生长状态和稳定的生长速率。
连续流入 新鲜培养液 单批培养 恒浊法 恒化法 连续培养
lg细胞数（个/ml）
单批培养
连续培养
时间
（二）连续培养器
按控制方式分
连 续 培 养 器
内控制（控制菌体密度）：恒浊器 外控制（控制培养液流速、以控制 生长速率）：恒化器 单级连续培养器 多级连续培养器
2）特点：
生长速率常数= 0，细胞数目不增加 细胞形态变大或增长 细胞内RNA特别是rRNA含量增高，原生质嗜碱性增强 合成代谢活跃（核糖体、酶类、ATP合成加快），易产生诱 导酶 对外界不良条件敏感，（如氯化钠浓度、温度、抗生素等化 学药物） 3） 原因：适应新的环境条件，合成新的酶，积累必要的中间产 物
4） 应用意义：
①由于此时期的菌种比较健壮，生产上用作接种 的最佳菌龄；
②发酵工业上尽量延长该期，以达到较高的菌体 密度 ③是生理代谢及遗传研究或进行染色、形态观察 等的良好材料。 ④食品工业上尽量使有害微生物不能进入此期
3、稳定期（stationary phase）
又称：恒定期或最高生长期
1）特点： ①生长速率常数R=0，即新繁殖的细胞数与衰亡相等； ② 菌体产量达到了最高点。 ③细胞开始积累储藏物质，合成次生代谢产物
3、获得同步生长的方法：
同步培养法
诱导法
筛选法
化学诱导
过滤法
物理诱导
区带密度梯度离心法 膜洗脱法
获得同步生长的方法主要有两类：
环境条件诱导法：抗生素、变换温度、光线、培养基等。造 成与正常细胞周期不同的周期变化。
机械筛选法：选择性过滤、密度梯度离心或膜洗脱法。
硝 酸 纤 维 素 滤 膜 法
离 心 法
个细胞或一群相同的细胞经过培养繁殖而得到的后 代,称纯培养.
纯培养基本步骤：
(1) (2) 分 培 离 养
稀释平板法
纯培养方法
平板划线分离法 单细胞挑取法
选择性培养基分离法
①
10-1 10-2
稀释平板法
10-3 10-4 10-5 10-6
又分为：倾注平板法和涂布平板法。
基本过程：（1）梯度稀释过程；（2）分离培养过程
3）对数期中的的三个重要参数： 繁殖代数、生长速率常数、代时
设接种时细胞数为x1, 时间为t1, 到时间t2后，繁殖n 代，细胞数为x2
繁殖代数 n=3.322(lgx2-lgx1) 3.322(lgx2-lgx1) 生长速率常数 R= t2 - t 1 t2 - t1 代时 G= 3.322(lgx2-lgx1)
④芽孢菌开始形成芽孢。 2）产生原因： 营养物尤其是生长限制因子的耗尽 营养物的比例失调，如碳氮比不合适; 有害代谢废物的积累（酸、醇、毒素等） 理化条件（pH、氧化还原势等）不合适;
3）应用意义：
① 发酵生产形成的重要时期（抗生素、氨基酸
等），生产上应尽量延长此期，提高产量，措 施如下： 补充营养物质（补料） 调pH 调整温度
（四）连续培养技术——恒浊培养
使用范围：用于生产大 量菌体、生产与菌体生 长相平行的某些代谢产 物，如乳酸、乙醇等。
恒浊器与恒化器的比较
装臵 控制对象 培养 基 培养基 生长速 流速 率 不恒定 最高 产物 应用 范围
应用范围：实验室科学研究，与生长速率相关的各种 理论研究
（四）连续培养技术——恒浊培养
概念：通过调节培养基流速，使培养液浊度保持恒 定的连续培养方法。 原理：以光电控制系统测定培养器内微生物的生长 密度，从而调节新鲜培养基流入的速度来维持菌浓 度不变,即浊度不变。当浊度高时，使新鲜培养基的 流速加快，浊度降低，则减慢培养基的流速。 特点：基质过量，微生物始终以最高速率进行生长， 并可在允许范围内控制不同的菌体密度；但工艺复 杂，烦琐。
种子的损伤度
5）认识延滞期的特点及形成原因对实践的指导意义： ◆在发酵工业上需设法尽量缩短延滞期；
采取措施有：
①选用繁殖快的菌种
②采用对数生长期的健壮菌种
③增加接种量
④调整培养基的成分，在种子培养基中加入发酵 培养基的某些成分
◆在食品工业上，尽量在此期进行消毒或灭菌
2、对数期（logarithmic phase）
特点：快速、简便；但易受干扰。
生理指标法
测含氮量
蛋白质是细胞的主要物质，含量稳定，而氮是蛋白质的主 要成分，通过测含氮量就可推知微生物的浓度。
一般细菌含氮量为干重的12.5%，酵母菌为7.5%，霉菌为 6.0%，根据一定体积培养液中的含氮量再乘以6.25，就可 测得粗蛋白的含量。 其他方法 含碳、磷、DNA、RNA、耗氧量、消耗底物量、产二氧化碳、 产酸、产热、粘度等，都可用于生长量的测定。
小
结
对数生长期
什么时期细菌细胞生长速度最快
什么时期世代时间短而稳定
什么时期细菌细胞代谢活性最强 什么时候细菌细胞总数最多 什么时期菌体代谢产物最多
对数生长期
对数生长期 稳定期 稳定期
三、微生物的连续培养（continuous culture）
分批培养（batch culture）：将微生物臵于一 定容积的定量的培养基中培养，培养基一次性加 入。不再补充和更换，最后一次性收获。
二、微生物纯培养生长的测定方法
描述不同种类、不同生长状态的微生物生长情况， 需选用不同的测定指标。
（一）微生物生长量的测定法
1、直接法
测干重法
测体积法 2、间接法 比浊法 生理指标测定法
（二）微生物细胞数目的检测法
1、直接法 血球计数板 涂片染色法
2、间接法（平板菌数计数法） 浇注平板法 涂布平板法
连续培养（continuous culture）：在微生物培 养的过程中，不断地供给新鲜的营养物质，同时 排除含菌体及代谢产物的发酵液，让培养的微生 物长时间地处于对数生长期，以利于微生物的增 殖速度和代谢活性处于某种稳定状态。
（一）连续培养原理
原理：当微生物在单批培养方式下生长达到对数期后期时， 一方面以一定的速度流进新鲜培养基并搅拌，另一方面以溢流