乳鼠心肌细胞的培养ppt课件
乳鼠心肌细胞分离及培养程序
下文所述程序改编于Speicher和McCarl（1974）的方法。
实验需要两把弯头的解剖剪，两把5号钳子，一个25-ml的带橡皮塞的锥形瓶，内装一搅拌棒。
所有器械使用前均应消毒灭菌。
为了进一步保证无菌条件，最好用一次性无菌塑料用品。
所有的孵育操作均应在高湿度的5% CO237℃孵箱中。
本实验适合处理20~30只幼鼠，若少于20只鼠则可能会发生组织消化过度的情况，若超过30只，则由于准备工作加长降低了细胞的成活性。
组织消化和分离细胞1）在细胞操作间内，放一个加热搅拌台，上放一个装有100-ml灭菌水的容量600-ml的烧杯，加热至37℃。
2）准备胰酶液。
用水浴或温箱使胰酶液温度保持在37℃。
胰酶（0.1）%，100ml盐水A 90ml1%胰酶1:300（GIBCO/BRL）10ml使用当天配制盐水A137mmol/L NaCl4 mmol/L KCl4.2 mmol/L NaHCO35 mmol/L 葡萄糖溶于无菌蒸馏水中3）做一个冰台：将一只平皿装满冰后倒置即可，70%乙醇擦拭平皿后放进操作台。
取3个60-mm的一次性组织培养用平皿，加入5 ml盐水A，标记上1，2，3，放进操作台的冰台上。
4）取一只干净加盖的烧杯，内放一块Metofane饱和的纱布，把0~1日龄的SD幼鼠放进该烧杯中麻醉。
20只幼鼠大约需要5分钟时间。
用70%乙醇擦净烧杯再放进操作间。
5）一次取出一只幼鼠，一定要再盖好盖子，然后将幼鼠躺着放在一块无菌纱布上。
用乙醇擦洗其胸部及腹部。
把鼠肩胛骨往后夹，使突出胸腔，在肋骨下沿胸骨方向拉一口，摘出心脏放进标记着1的培养皿中。
24-mm规格的弯头解剖刀适合用于切口及摘除心脏。
此时幼鼠心脏仍能跳动，故一般很容易找到并摘除。
可用同一把解剖刀将心脏摘出放进盐水A溶液，若需要也可用灭菌的5号钳子。
6）继续处理余下的幼鼠，一定要保持手套及所用器械洁净。
每次解剖约需1分钟。
7）上述操作完成后，用两把5号钳子剔除心脏上结缔组织和血块再转入标记为2的平皿中。
小鼠乳鼠心肌细胞的原代培养
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病理 、 药理 等方 面 已开 展 了 多项 基 础 研 究 。其 中体 外 培养 的心 肌细 胞 可保 持 结 构 及 功 能 上 的某 些 特
乳鼠心肌细胞的培养
乳鼠心肌细胞的培养配液：Hanks液、低糖DMEM液、高糖DMEM液、胰酶消化液、双抗液、碳酸氢钠液、盐酸液。
取鼠：鼠盆用棉铺好，取鼠。
准备：事先检查显微镜、磁力搅拌器及离心机是否好用，提前三小时把小牛血清、胰酶、抗生素拿出来化开。
其余未冻药品也提前20分钟拿出来缓和一下。
新洁尔灭（0.1％）泡纱布（用10ml5％的新洁尔灭加水至500ml即得），消毒地面（1：500的84液）。
用酒精棉球擦拭台面后把物品摆放好，开紫外线灯照30分钟后开鼓风机吹至实验结束。
物品：白大衣、饭盒小剪子、小镊子（4套）（一套剪皮肤、一套开胸取心，一套剔除心缘纤维组织，一套剪碎心脏）瓶皿（2套）[两个小圆培养皿，培养皿内加DMEM液，先后装取出的心和剔出纤维组织后的心] [一个小烧杯装碘酒和酒精棉球]250ml烧杯3个[一个用于水浴，事先加好水，最好是一或二蒸] [一个装0.1％新洁尔灭150ml左右，消毒小鼠]500ml烧杯1个，用作废液缸。
50ml烧杯3个（剪碎心肌组织，最后配液）三角烧杯（50ml）+小转子（小转子，酒精擦，双蒸水冲后，再把酒精彻底冲掉后用三角烧杯高压）离心管及帽（12-14个），两个试管吸管（5~8个）大镊子（两把，持物，例夹棉球等）台面：磁力搅拌器、纱布（事先用于托盘装0.1％新洁尔灭浸泡）、试管架、泡沫塑料板、五个针头（不用消毒）75％酒精棉球及碘酒（消毒棉球，泡酒精、碘酒）大镊子两把（一把夹棉球，一把取鼠）、3个250ml烧瓶（一个装一蒸水，一个装新洁尔灭，另一为空的备用）1个500ml烧瓶（废液缸）、温度计、PH试纸（事先调PH值）、酒精灯、打火机/火柴、载玻片（5-10个）[用于培养前看接种密度及消化后看细胞密度]、注射器5ml 6个（胰酶、DMEM、小牛血清）1ml 2个（双抗液）20ml备用2个、微量加样器1000ml及500ml以上物品均用紫外线照30分钟。
另外准备手套、帽子、口罩、24孔培养板、离心机+一把小锁、未冻药品及DMEM、HCL、NaHCO3、小牛血清。
乳鼠原代心肌细胞培养方法
乳鼠原代心肌细胞培养方法
实验动物
出生1~3天的健康乳鼠（Wistar），雌雄不分。
药品与试剂
DMEM/F12基础培基，Brdu ，胰蛋白酶（1:250），Ⅱ型胶原酶（sigma)，胎牛血清（hyclone），双抗（青霉素-链霉素）
原代心肌细胞培养
1．出生后1~3天的乳鼠，雌雄不分。
将乳鼠在75%乙醇中浸泡5秒左右，于无菌条件下取出心脏，置于平皿中，用PBS溶液反复洗涤3次，并除去大血管及脂肪组织，眼科剪剪碎至约1mm3。
2．用0.1%的Ⅱ型胶原酶和0.06%的胰蛋白酶在37℃恒温摇床中震荡消化5~7次，每次5min。
收集除第一次之外各次所得的消化液，并及时加入到含10%胎牛血清的DMEM培养液中终止消化。
（第一次的消化液中含较多血细胞，故弃去，也可视清洗的情况而定）
3．终止后的消化液用200目筛过滤去除未消化组织块，1000rpm离心10min 收集细胞。
4．离心后弃上清，用全培基将细胞沉淀充分而轻柔地吹打成单细胞悬液，接种于培养瓶中，CO2培养箱差速贴壁1.5小时。
5．收集未贴壁的细胞悬液，重新接种于培养瓶中，前3天加用0.1 mmol/L Brdu抑制非心肌细胞的生长。
6．培养2~3天，待贴壁心肌细胞连成片状同步搏动后，消化接种于不同的培养板中，供进一步实验用。
细胞工程实验三：乳鼠心肌细胞的原代培养-治
将细胞混悬液1 000 r/min离心10 min
去上层，收获细胞
实战程序 第四大步骤：清洗细胞，培养细胞
细胞沉淀用PBS溶液和DMEM清洗3次 弃上清液 加4ml含20%小牛血清的DMEM培养液制 成细胞悬液，置于培养瓶中 培养24 h后即可见细胞贴壁和细胞收缩
【注意事项】
组织块必须漂洗 2~3 次以除去组织的钙离 子、镁离子和血清对胰蛋白酶和 EDTA的抑 制作用。 胰蛋白酶浓度不宜过高，作用时间不能太长， 以避免毒性作用。 消化后组织不仅要尽量弃去消化液，以避免 毒性产生，而且动作要轻，以避免蓬松的细 胞随漂洗而失去。
【实验结果与分析】
记录心肌细胞的培养及动态观察。
实验三 动物细胞的原代培养
【实验目的】
掌握实体组织材料的原代细胞培养的 基本思路。 掌握动物组织中细胞的分离和原代培 养的方法。
【实验原理】（参考教材P128）
原代细胞培养是从供体取得组织细胞在体外
进行的首次培养
是一项基本技术
是建立细胞系的第一步
【实验原理】
原代细胞的分离和制作常采用的方法
用镊子小心剥离心包膜
剪去心房（心脏上半部分）及主动脉
PBS溶液清洗心室组织3次（至没有血时）
将心室组织剪成1~3 mm3碎块后，转移至
离心管
用PBS清洗3遍
实战程序 第三大步骤：消化组织，获得细胞
加0.125%胰蛋白酶（2ml）
37℃水浴中旋摇消化10 min 吸上层（细胞在悬液中，未消化好的组织块在底层） 细胞悬液转至小烧杯 加等体积无血清培养基终止反应，反复3-5次
【实验材料与器材】
本实验用品
每组1个：乳鼠、解剖器械、小烧杯、细胞 培养瓶、移液枪（1ml）及枪头 每组2个：离心管、培养皿
乳鼠心肌细胞培养详细步骤
乳鼠心肌细胞培养物品准备眼科剪、眼科镊、泡沫板、75%酒精、细胞培养皿、细胞培养瓶、胰蛋白酶、胶原酶II、5-溴脱氧尿苷（Brdu）、离心机、温控水平摇床、二氧化碳培养箱、普通倒置显微镜、细胞计数板、胎牛血清、DMEM培养基、生理盐水、细胞过滤器、除菌过滤器、15ml离心管、50ml离心管试液配制（1）培养液A:按每90ml培养液加入10ml胎牛血清即为10%DMEM培养液（含双抗）。
（2）培养液B:含0.1mmol/LBrdU配制的DMEM高糖型培养液（含双抗）。
（3）消化液：0.1%胰酶和0.1%胶原酶Ⅱ型分装冻存于-20C。
将0.1%胰酶与0.1%胶原酶Ⅱ型混匀，现用现配。
操作步骤（1）取1-3天龄的新生乳鼠，断头处死，固定于泡沫板上;（2）应用75%酒精常规消毒;（3）从左侧肋下缘剪开胸腔,用镊子取出心脏，置入含无血清DMEM培养液的平皿中;（4）全部心脏取出后，剪去心房及周围血管组织，移入一干平皿中;（5）剪碎，用无血清培养液洗1-2遍后，转移入50ml离心管中;（6）加入10ml 消化液，放入37℃摇床 100rpm，15min，弃掉上清，收集沉淀。
（7）沉淀的心室组织中加入10ml消化液，37℃摇床 100rpm，10min，充分吹打后静止，待未消化完全细胞沉淀后小心收集上清（避免吸入组织块）置于 20ml 培养液中。
（8）重复 5-6次消化步骤，至完全消化为止，收集上清。
用200μm 筛网过滤，1000rpm，4℃，离心 8min。
（9）用培养液A将收集到的细胞悬液再次重悬，接种于T25 培养瓶，放入 5%CO2 恒温（37℃）细胞培养箱培养1.5h（即差速贴壁分离法）。
（10）将T25培养瓶中的上清液转移至另一无菌T25培养瓶，放入细胞培养箱培养 1h，进行第二次差速贴壁。
（11）收集上清并计数后，离心 1000rpm，4℃，8min，弃上清，留取细胞沉淀。
（12）用培养基B重悬细胞沉淀，按照1.5×105/10cm2的细胞密度接种于六孔板中，放入细胞培养箱培养。
乳鼠心肌细胞原代培养protocol
RAT NEONATAL CARDIOMYOCYTE PROTOCOLReagents:DMEM (1.0g/L glucose + L-glutamine)HBSS without Ca2+, Mg2+, or phenol redGentamycin: 50 mg/ml stock solution (2500X), store at 4 CL-glutamine: 200mM stock solution (100X), store at 4 CAra-C: (SIGMA C1768) 20mM stock solution (200X) 25mg Ara-C/4.45 mL sterile dH20, store at -20 C for up to 6 monthsHorse serum, heat inactivated at 56 C for 30’, store at -20 CFetal calf serum, heat inactivated at 56 C for 30’, store at -20 CPenicilin/Streptomycin (1000X), store at -20 CInsulin, Transferfin, Selenium (GIBCO 51500, 100X ITS-X), store at 4 CCollagenase Type II (Worthington LS004176) Dissolve 35mg collagenase in 50ml digestion media (~200 U/ml). Filter sterilize.Gelatin, 0.2%Trypan blue reagentOther supplies:Fine Iris straight scissors for dissection (FST 14094-11)Fine Iris curved scissors for mincing (FST 14095-11)Curved forceps (FST 11003-12)25 ml pyrex tubes (5020)Nylon cell strainer, 70 and 100 μM, (Falcon 2350)Surgical gauze (4”x4”), (PSS 2237)0.2um 25mm Pall syringe filters (VWR 4612)60ml Luer-Lok tip syringe (BD 309653)Hypertrophy stimulants:Phenylephrine: 50-100μM, make fresh just before use, protect from light. Isoproterenol: 1-10μM, dissolve in 0.002% ascorbic acid, make fresh, protect from light. Endothelin 1: 10nMDigestion Media: Final Conc Add for 500 ml HBSS without Ca2+, Mg2+, phenol red 500 ml Gentamycin (2500X) 25 μg/ul200 μlPlating Media: Final Conc Add for 500 ml DMEM (1g/L glucose) 500 mlHorse serum (Sterile filter) 5% v/v 25 mlFetal calf serum (Sterile filter) 5% v/v 25 mlAra-C 20mM 10 μM250 μlPen/Strep (100X) 1% 5 mlCulture Media: Final Conc Add for 500 ml DMEM (1 g/L glucose) 500 mlAra-C 20mM 10 μM250 μlL-glutamine (100X) 2 mM 5 mlPen/Strep (100X) 1% 5 mlInsulin, Transferrin, Selenium (100X) 0.2% 1 mlSupplies to Prepare:Dissecting Instruments (autoclaved): large scissors, small scissors, curved forceps25 ml Pyrex tubes (autoclaved)Sterile gauze (autoclaved)Autoclave bag for carcasses1 500 mL glass beaker for carcasses1 empty tip box for EtOH bath2 150 mL glass beakers with 70% ethanol for washing dissecting instruments10 50 ml conical tubes70% EtOHPreparation before HarvestFill 2 ice buckets (large and small)Fill tip box and (2) 150 ml beakers with 70% EtOH, place in hoodPlace autoclave bag in 500 ml beaker in hoodPlace 25 ml of Digestion media in (5) 50 ml conical tubes on icePlace 25 ml of Digestion media in 50 ml conical tube and add 125 μl heat-inactivated FCS (for resuspension), place on icePlace 25 ml of Digestion media in 50 ml conical tube (for hearts), place on iceWeigh out 100 mg of Collagenase Type II into 50 ml Digestion media, sterile filter using0.22μm syringe filter, dilute 1:1 in 50ml Digestion media, place on ice1 100mm dish for mincing hearts, place on iceHarvesting the Cells1. Prepare ethanol bath: Fill sterilized tip box with 70% EtOH2. Place 4-6 pups in ethanol bath (briefly), and then transfer them to plastic container(left side of hood). Replace sterile gloves.3. Using the large scissors create an incision in the sternum, cutting through diaphragmin a single cut if possible.4. Grip the back of the pup from underneath with your left hand; twist and squeeze. Theheart should be exposed at the midline. With right hand, take the other set of scissors to cut away the atrium and aorta (about 2/3 of the way up from the ventricles).5. Using the curved forceps, remove the heart. Blot it on the gauze to remove as muchblood as possible.6. Place the heart in 50ml conical tube with Digestion Media on ice7. After all hearts have been harvested, cap the hearts tube and gently swirl to removeblood.8. Let hearts settle, then aspirate liquid and replace the media with 20 mL fresh coldDigestion Media. Swirl again, and remove as much of the media as possible.9. Pour the hearts into a cold 100 mm dish. Mince finely (about 5-10minutes) with the small curved scissors to increase surface area of tissue beforedigestion.10. Add about 10ml fresh Digestion Media to the dish, gently pull up hearts with a 5mlpipet and place heart solution into pyrex tube.11. Add 10 ml of collagenase to the pyrex tube, add glass cap, and vortex gently (level 6)to solubilize the tissue.12. Incubate in shaking 37 C water bath for 10 minutes (60 rpm).13. Allow tissue to settle and remove the supernatant using a 10 ml pipet. Discard this.14. Add 10ml pre-warmed Collagenase, vortex gently and shake for 10 min at 37 C.15. Remove tube from incubator and place in sterile hood. Using a 10 ml pipet triturateabout 10 times to release the cells, approx 3 mls/sec. Do not be too vigorous andavoid bubbles in the cell suspension16. Pre-rinse a 100 μm cell strainer with 2 ml Plating Media. Allow tissue to settle 2-3minutes, then filter supernatant through strainer into 50ml conical tube.17. Add 5 ml additional collagenase to the tissue residue. Repeat trituration and allowtissue to settle before filtering cells through same strainer.18. Repeat steps 14-17 until tissue is almost completely digested. (4-5 times). Poolsupernatants and keep on ice.19. Swirl cells gently; centrifuge the pooled cells for 4 min at 1500 rpm at (Use Abe labcentrifuge).20. Aspirate the supernatant and wash the pellet with cold digestion media 2-3 times.21. Resuspend cell pellet gently in pre-warmed Plating Media (10 ml per 10 hearts).22. Filter cell suspension through 70 μm cell strainer23. Plate suspension on uncoated 100 mm dishes. Plate about 15 ml per dish. Incubate30 min at 37 C.24. During this incubation: coat plates with 0.2% gelatin (dilute stock 1:10 in sterilePBS). Add 0.5 ml per 12 well. Incubate at 37 C until about 10 min before use.Aspirate gelatin and air dry in hood for 10 min.25. Repeat pre-plating step 23 to allow fibroblasts to adhere to the plate.Plating the CellsCollect cells and perform Trypan blue exclusion cell count using hemocytometer.A dd 50 μl cell suspension to 50 μl of Trypan Blue in 1.5 ml tube. Mix. Add 10 μl toend of hemocytometer.Day after Harvest (~24h after plating)1. Warm Culture Media and HBSS (without Ca2+, phosphate, or phenol red).2. Wash plates 2 times vigorously with prewarmed HBSS or PBS to remove debris, includ ing RBC’s.4. Replace with prewarmed Culture Media. Check under the microscope to see that mostof the debris is gone and that individual myocytes are visible. A few may be beating.5. Several hours later, treat cells or if infecting with adenovirus, add adenovirus at this time.7. Wash virus off the next day and harvest 72 hours later.*For hypertrophy stimulation, add at the time of removal of serum. Change media daily with fresh phenylepherine, and allow 48 hours before harvesting.。
心肌细胞培养
原代培养的心肌细胞的准备
将出生1-3天的Wistar乳鼠浸泡75%的酒精中消毒，开胸后取心室肌，用Hank's液清洗2次，剪碎，放入10ml离心管中；离心管中装有5倍体积的0.25%胰酶，37℃消化10分钟后，加等体积的DMEM全培养液终止消化，自然沉淀；取出沉淀物，放入另一盛有胰酶的离心管中，重复上述消化过程4次，每次37℃20分钟；收集除第一次以外的上清液，1500 r/min 离心15分钟，弃上清，用含10％胎牛血清及青霉素和链霉素(终浓度均为100U/ml)的高糖DMEM培养液充分而轻柔地吹打成单细胞悬液，经 200目筛网过滤去除未消化组织块。
然后按差速贴壁分离法37℃、5%CO
孵育 1-1.5小时，去除贴壁的非心肌细胞，纯化心肌细胞。
细胞计
2
条件下培养。
于培养后12h即可见部数，相同密度接种于培养瓶中，37℃，5%CO
2
分细胞收缩,24h后换液,此时心肌细胞约90%以上都在收缩, 速率达70/min～120/min。
细胞培养72h后用于实验。
乳鼠心肌细胞分离
Neonatal Rat Cardiomyocyte Isolation Protocol作成者：富海英 趙卉日 期：2006/08/11法消毒器具：镊子 大和小 各两把，用纸包好后放入一个玻璃杯中放入搅拌棒的50cc 的烧杯一个次日开始培养的话，提前：17～21時）１）Hanks medium 15ml 加入P10培养皿，共三枚，置于37℃ incubate（其中2枚在取心脏时备用）Hanks medium 是室温保存，没时间的话，不用incubate 37℃也可２）从新生大鼠取心脏（以下以两窝计算）铺上草纸、准备酒精消毒液和尸体袋取出心脏（从剑突左下用尖镊子刺入，分离，心脏将突出体外）用镊子把心脏夹出，放在P10培养皿中将全部大鼠的心脏取出后，把心脏移到新的培养皿中然后拿到无菌操作台（cleanbench ）里面行进一步操作３）将P10 dish 中的心脏的血液挤出洗净后移到另一个干净的p10培养皿，枚目のdish に移将心脏撕裂2-3下，裂而不断的程度即可。
４）将Trypsin/EDTA 放入50cc 三角烧杯中、两窝大鼠心脏约20个需要10ml 。
4℃ 过夜。
Trypsin 不要加温、在取心脏之前从4℃保存的冰箱里取出，将需用部分取出注入带刻度试管中。
Trypsin 不要加热，以免影响效果。
4℃过夜，静置即可。
12-16h后：早上9点开始）试剂：D-MEM (cat No. D5796, containing 10%FCS and 1%PSG)FCS (JRH Bioscience Cat No. 12303-500M)PSG (GIBCO Cat No. 10378-016)GIBCO Hank’s balanced salt solution（Cat. No. 14175-095）（不含Ca,Mg离子）Collagenase Type II （Worthington Bio. Chem. Cat No. CLS2）最终浓度0.5~1.0mg/mlBSA (Sigma)最终浓度5mg/ml0.25%Trypsin-EDTA（GIBCO、cat No. 25200）（4℃直接使用，不加温）５）配制胶原消化液：Collagenase type II(25~50mg)/BSA(250mg)/Hanks medium 50ml６）在过夜的心脏/Tripsin瓶中加D-MEM（10%FCS）10ml，37℃恒温槽5min７）弃上清，加胶原消化液10ml（0.22um filter过滤）（弃上清时注意勿把心脏组织吸走了。
乳鼠心肌细胞培养
大鼠心肌细胞培养一、乳鼠原代心肌细胞培养（一）、试液配制1．DMEM培养液：配制方法同前。
按每90ml 培养液加入10ml 胎牛血清即为10%DMEM 培养液。
2．0.1%胰酶：移取0.5g 胰酶，加入５00ml 生理盐水，充分溶解后，调pH至７.2~7.4,过滤除菌后，分装冻存于-２０℃。
3．１0mmol/L 5-溴脱氧尿苷：（二）、操作步骤１．取１天龄的新生乳鼠，断头处死，固定于泡沫板上；２．应用碘酊及７０％酒精常规消毒；３．从左侧肋下缘剪开胸腔，用镊子取出心脏，置入含无血清DMEM培养液的平皿中；４．全部心脏取出后，剪去心房及周围血管组织，移入一干平皿中；５．剪碎，用无血清培养液洗１～２遍后，转移入５０ml 离心管中；６．按３０～５０个心脏加１０～1５ml胰酶液，于３２～３５℃，不停搅动１５０～２００rpm,消化１５～２０min;７．让组织块自然沉淀，上清移入另一离心管中，立即加入等量含１０％血清的培养液以终止胰酶的作用。
最初２～３次消化液因含较多的细胞碎片及红细胞，可弃去。
８．组织块可反复加入胰酶消化５～８次，所得细胞悬液在１０００rpm离心５min , 弃去上清，沉淀用少量培养液重悬；９．细胞计数后，将细胞稀释成１×106cells/ml的浓度，转移入培养瓶中，３０cm2的培养瓶加入５ml ，轻轻摇晃培养瓶，使细胞均匀分布；10.37℃95%空气－５％CO2条件下培养１h，然后轻轻摇动，将未贴壁的细胞转移到新的培养瓶中继续培养；11.２4h后更换含０.1mmol５－溴脱氧尿苷的培养液，以后每２天更换一次培养液。
心肌细胞全部汇合，自主搏动良好即可用于实验。
（三）、注意事项１．心脏是由多种细胞群组成的，心肌细胞约占５０％。
决定心肌细胞培养成败的关键是：１）不能污染，在整个操作过程中都要注意无菌操作，所用器皿都要严格消毒，所用试液都要预先检验无菌后方可使用。
２）尽量减少非心肌细胞的存在。
细胞生物学：小鼠心肌细胞原代培养
细胞生物学：小鼠心肌细胞原代培养㈠、概述整体动物心肌细胞的增殖能力在出生后仅能维持一个短时期，小鼠在出生3周后DNA合成所需的酶的活性及心肌细胞的增殖能力就明显降低至成年鼠水平。
小鼠心肌细胞的原代培养，一般选用生后1-10d的乳鼠心脏，尤以出生1-4d的较好，此时心肌细胞已分化充分，适于作各种研究，而出生4d以后的乳鼠心脏中分离出来的心肌细胞较慢发育成为有自律性搏动的心肌细胞。
㈡、[试剂]1、培养液：1：1混合的DMEM/F12培养液，添加终浓度为10%小牛血清（FCS）、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素。
2、消化液：胰酶（效价为1：250）0.08%、胶原酶II（活力为150U/mg）0.05%，用pH7.2-7.8的D-Hanks溶液配制，-20℃保存。
3、D-Hanks溶液（pH7.2-7.8）：KCl0.4g，KH2PO40.06g，NaCl8.00g，NaHCO30.35g，Na2HPO4？7H2O0.09g，酚红0.01g1L㈢、[实验步骤]1、取生后1-4d的乳鼠，用75%乙醇消毒皮肤，再用大头针固定乳鼠的头及四肢，剪开胸部皮肤，用75%乙醇消毒皮下组织，更换镊子及剪刀，开胸取出心脏，将心脏放入盛有D-Hanks溶液的平皿（或青霉素瓶）中，剪去心房，剪开心室，用D-Hanks溶液冲洗三次，去除残留积血后，将心脏剪成1mm3大小的碎片，再将心脏碎片转移至离心管中，加5ml左右消化液，37℃消化5min，自然沉淀，弃上清，再加5ml左右消化液，37℃消化20min（每隔2min 振摇几下），用吸管吹打1min后，将未消化完全的心脏碎片吸出至另一离心管中，加入2ml冷的培养液终止消化，1000rpm5min，弃上清，沉淀中加入D-Hanks溶液2ml，1500rpm10min，弃上清，沉淀中加入培养液2ml，用吸管吹打制成细胞悬液。
（为节约时间，以下步骤省略）上述未消化完全的心脏碎片补加5ml左右消化液后继续消化，同样操作，合并细胞悬液后放入培养瓶中置二氧化碳培养箱中（37℃5%CO2）培养。
动物细胞培养课件(共39张PPT)—2023-2024学年高二下学期生物选择性必修3课件
胰蛋白酶可能会把细胞消化掉。 因此，胰蛋白酶处理的时间不能太长。
取动物组织
制成细胞悬液
转入培养液中进行原代培养
3.将细胞悬液放入培养液进行原代培养 （1）原代培养：动物组织经过处理后的初次培养。 CO2培养箱中培养
（2）用培养液将细胞制成细胞悬液，于适宜的环境中培养。
【思考 讨论】
1.常用胰蛋白酶分散细胞，这说明细胞间的物质主要是什么成分？用胃蛋 白酶行吗？ 说明细胞间的物质主要是蛋白质。
胃蛋白酶作用的适宜pH约为2，当pH大于6时，胃蛋白酶就失去活性， 多数动物细胞培养的适宜pH为7.2~7.4，胃蛋白酶在此环境中没有活性， 所以用胃蛋白酶不行。
美国马里兰大学的博士生贾森·马西尼找到了在实验室内制造"人造肉"的 两种方法。一种是，首先从牛、猪、家禽或鱼的肌肉组织中提取细胞，在一个 薄膜上进行培育。他们发现细胞会生长、扩张，然后从薄膜上脱落；等到脱落 后的平面细胞群堆积到一定厚度时，就形成了肉；另一种是在一人种造三肉维颗粒中 培育肌肉细羽胞毛。中这提样培育出的细胞组织可以用来制造肉制品，比如鸡米花和碎 牛肉。 取细胞
细胞系的遗传物质一定改变
动物细胞培养的过程
取动物组织
制成细 胞悬液
转入培养液进 行原代培养
放入CO2培养 箱中培养
传代培养
放入CO2培养 箱中培养
取动物组织
机械法或用胰蛋白酶 、胶原蛋白酶等处理
分散成单个细胞
制成细胞悬液
转入培养液进行原代培养
细胞贴壁 接触抑制
分瓶
进行传代培养
比较项目
【精品】乳鼠心肌细胞的培养15页PPT
35、不要以为自己成功一次就可以了 ，也不 要以为 过去的 光荣可 以被永 远肯定 。
【精品】乳鼠心肌细胞的培 养
31、别人笑我太疯癫，我笑他人看不 穿。(名 言网) 32、我不想听失意者的哭泣，抱怨者 的牢骚 ，这是 羊群中 的瘟疫 ，我不 能被它 传染。 我要尽 量避免 绝望， 辛勤耕 耘，忍 受苦楚 。我一 试再试 ，争取 每天的 成功， 避免以 失败收 常在别 人停滞 不前时 ，我继 续拼搏 。
31、只有永远躺在泥坑里的人，才不会再掉进坑里。——黑格尔 32、希望的灯一旦熄灭，生活刹那间变成了一片黑暗。——普列姆昌德 33、希望是人生的乳母。——科策布 34、形成天才的决定因素应该是勤奋。——郭沫若 35、学到很多东西的诀窍，就是一下子不要学很多。——洛克
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实 验 目 的 意 义 实 验 材 料
实 验 方 法
操作步骤及人员落实 预 期 结 果
目的：掌握原代细胞培养的一般方法和步骤及培 养过程中的无菌操作技术，熟悉原代培养细胞的 观察方法。 意义：原代培养是指直接从机体取出细胞、组织 和器官后立即置于培养基中培养，使细胞得以生 存、生长和繁殖。原代培养细胞离体时间短，细 胞保持体内原有的基本性质，适用于研究。 一般说来，幼稚状态的组织和细胞（如动物的胚 胎、幼仔的脏器）等更容易进行原代培养。
•消 化 组 织
•培 养 细 胞
前 期 准 备
1. 将备用物品（手术 器械、培养皿、烧 杯、离心管等）进 行高压灭菌； 2. 用酒精擦拭层流台， 将高压灭菌后的物 品放入层流台，紫 外线消毒30分钟。
用镊子夹住小鼠尾巴将小 鼠在酒精中浸泡两次，约 2~3秒； 2. 用剪刀将小鼠头部剪去； 3. 将动物固取材器官范围的 被毛，定在解剖板上并将 胸部剪开暴露出心脏，用 另一个剪刀将小鼠心脏剪 下； 4. 放入装有预冷的Hanks液的 培养皿中，将心脏剪开,剪 碎组织至1mm³左右，清洗 残留的血液。
1.
1. 将心肌组织转移至另一个装有预冷的Hanks液的培 养皿中进一步剪碎心脏后，加入等体积的0.125％ 胰酶； 2. 将心肌组织转移至离心管中，用吸管反复吹打（使 消化下来的细胞彻底从组织团快上掉下来）10min, 静置2min后，弃上清； 3. 再次加入Hanks液和等体积的0.125％胰酶，常温下 用吸管反复吹打10min，静置2min后将上层液转移 至100ml容器中，加入含10%小牛血清的1640培养 基终止消化； 4. 重复上一步骤至组织完全消化，适当控制消化时间。
仪器：培养箱（调整至37℃）、培养瓶、
青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液 管、纱布、手术器械、血细胞计数板、离心 机、水浴箱（37℃）。
试剂：1640培养基（含10%小牛血清）、
75%酒精、Hanks液、0.125%胰酶消化液 、碘酒、碳酸氢钠液、盐酸液。
材料：乳鼠的心脏
•前 期 准 备 •实 验 取 材
1.
加入培养液1~2ml（视细胞量）,血球计数板 计数； 将细胞调整到5×105 个24h后换液继 续观察培养。
2.
3.
操作步骤及人员落实
预期结果
谢谢观看！ 预祝实验圆满成功！
PS：部分数据根据实验具体情况修改。