细菌分子鉴定技术的研究进展
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图 2 两种鉴定步骤
F ig. 2 Two identifica tion approaches
缩短了鉴定时间 [ 25]。
除了分枝杆菌属以外, 还有诺卡氏菌属也采用此方法进
行分类鉴定 [26] 。相信随着这种方法的不断发展有更多的菌
属可以通过其进行鉴定。
5 小结 细菌在人类生活和科学研究中占有重要的地位, 然而对
[ 2] LORENZ P, SCHLEPER C. M etagenom e-a challenging source of enzym e d iscovery[ J]. M olC atalB En zym, 2002( 19/20): 13- 19.
[ 3] DEUTSCHBAUER AM, CH IVIAN D, ARK IN A P. Genom ics for environmen talm icrob iology[ J]. CurrOp in B iotechnol, 2006, 17: 1- 7.
[ 1 ] BULL A T, WARD A C, GOODFELLOW M. S earch and discovery s tra-t egies for biotechno logy: The paradigm sh ift [ J ]. M icrobiolM ol B io,l 2000, 64: 573- 606.
虽然这项技术开始是针对病原菌提出的, 但是现在已应 用到非病原菌的细菌, 例如植物乳杆菌 ( Lactobacillus plan tarum ) [14]。它最大的优势是有一个庞大的数据库, 可将数据 结果直接提交到数据库进行比较, 分析不同时间不同地区临
36卷 23 期
王浩竹等 细菌分子鉴定技术的研究进展
对 MCC菌种的分析选择扩增 667 bp的 h sp 65片段, 而不 是 441 bp的片段, 是因为传统的 441 bp区域的 hsp65-PCR方 法对混合物中的M. immunogenum 菌种参考菌株的 441 bp区 域扩增水平较低, 而针对 667 bp区域设计的新模板有很高的 扩增水平。另外, 针对要扩增的 667 bp区域 PCR 可用直接 破碎细胞的方法代替常规的 DNA 模板准备, 操作简化方法。 该方法还有一个优点, 就是选择 Bbv I、E co0109 I或 N arI限制 性内切酶的一步限制性分析来代替传统的两步限制性分析,
98 81
床分离株的遗传相关性, 并能长期追踪和不断补充完善[ 15] 。 2 多位点序列分析技术 (M LSA )
16S rDNA全序列测定已广泛应用于细菌的分类鉴定, 所以其技术相对比较成熟, 但是对于一些亲缘关系相近的种 来说还存在一定局限性, 比如一些肠球菌 [16- , 18] 因此在现代 技术中开始尝试用扩增一些编码特定蛋白的基因来进行菌
Note: RFLP, ARDRA, DGGE, TGGE, SSCP and FISH w ere all u sed in pattern analys is. 图 1 多相分类法
F ig. 1 P olyphasic taxonom y
给一个专门的编号作为一个分离菌株的核酸型或序列, 这样 就可以高效得到在一个菌群内的多个型别等位基因库, 并可 显示等位基因间的微小变异来对细菌进行检测或分型。细 菌在发生变异时, 多个位点等位基因差异比单个位点的差异 更能说明它们较远的亲缘关系。当分离到一个性质未知的 病原菌时, 与等位基因谱比较就可确定它的来源[ 13] 。
多位点测序技术是由 M aiden等在 1998年提出的 [ 12], 针 对病原微生物的一种新的能够应用网络来确定和追踪分离 病原菌在全球的毒力传播和抗药性情况, 同时可追踪相对较 长周期 内病原菌 的全球 流行病学 的细菌 分型方 法 。在 M LST中常选择微生物染色体上 7个左右相距一定距离且基 本覆盖整个染色体的管家基因, 这 7个基因最大的特点是既 相对保守, 又可允许局部碱基发生点突变, 这 样既能通过 M IST研究病原菌在致病性或耐药性改变时基因谱的改变, 又能追踪较长时间的病原菌的遗传谱来源。通过双向测序, 直接测出核酸序列, 每个管家基因用 1对引物可准确测出内 部 450 bp左右的基因片段, 每个不同的基因序列称作其等位 基因, 特定的等位基因序列给出一个专门的基因序号, 所有 7 个位点等位基因的序号组成等位基因谱。每个等位基因谱
作者简介 王浩竹 ( 1983 - ), 女, 吉林 吉林人, 硕士研 究生, 研 究方向: 生物信息学。 通* 讯作者。
收稿日期 2008-02-28
注: 应用限制性片段 长度分析 (RFLP)、扩增的 rDNA限 制性分 析 ( ARDRA)、变性梯度凝胶电泳 (DGGE )、温度梯度凝胶电 泳 ( TGGE )、单链构象多肽性 ( SSCP)、荧光原位杂交 ( FISH ) 方法进行格局分析。
目前, 高可变基因间隔区的比较已经成为准确鉴定细菌 种属的常用方法 。 [22] ITS 是存在于核糖体大小亚基之间的 基因间隔序列。这些序列的长度差异可以非常大, 并且在同 一基因组内不同操纵子上的间隔片段长度都可能是不同的。
不仅长度有差异, 序列上的差异更大, 呈现出高度的可变性, 这也是能够利用 ITS进行细菌分类鉴定的重要原因。通常 ITS-PCR方法都是针对 16S ~ 23S ITS 和 5S ~ 16S ITS 设计 的, 此方法则是选择了 23S~ 5S ITS作为 PCR 扩增的目标基 因, 扩增后通过与数据库中的数据进行比对后确定细菌的种 属。针对 16S-23S IST基因的 PCR 技术已经在细菌鉴定方面 得到了广泛的应用, 其数据库相对于 23S-5S ITS数据库也比 较丰富, 但不是所有的细菌种属都适用于 16S-23S ITS或 5S16S ITS基因的 PCR 技术, 像立克次氏体属采用常规方法难 以鉴定到种的水平 [23] , 但是通过 5S~ 16S ITS基因的鉴定就 可以将其分离开来。
细菌在生化循环 (碳、氮以及其他矿物质 )、能源转化、生 物催化等方面扮演着重要角色, 这使得细菌在新的工业和生 物医学方法领域成为重要的资源 [ 1- 3] 。然而, 目前已知的细 菌种类有限, 大概有 6 370种[ 4]。随着越来越多的细菌的发 现, 对其分类鉴定也就变得非常重要。虽然目前传统的表型 和化学鉴定方法是不可缺少的, 但是很多种属之间生理生化 特征很相似, 单凭传统的鉴定方法已无法将其区分。随着分 子生物学研究的不断深入, 细菌的分类鉴定也从最初的表型 和化学鉴定演变到了分子水平, 通过对细菌 DNA 的鉴定来 达到区分种属的目的, 使鉴定结果更加准确和可靠。已经比 较成熟的分子鉴定方法有很多, 目前对于细菌而言, 最常用 的是 16S rDNA 全序列的测定, 还有将多种方法如将表形分 析、基因型分析和以分类学为目的的系统发育特征分析结合 在一起的方法, 这样的方法被看作是 / 多相分类方法 0 [ 5- 11] (图 1[ 11] )。笔者主要介绍几种在以往鉴定技术基础上新的 鉴定方法。 1 多位点测序技术 (M LST)
摘要 细菌的分子鉴定方法随着分子生物学的不断发展而得到了长足的进步, 建立了一系列完整而系统的鉴定方法, 如 DNA-DNA 杂 交、rDNA 指纹图谱、质粒图谱、16S rDNA 全序列测定、限制性核酸内切酶分析、脉冲场凝胶电泳分析等方法。介绍了在这些分子鉴定方 法基础上产生的新的或有针对性的细菌分子鉴定技术及其研究进展。 关键词 细菌; 分子鉴定; 研究进展 中图分类号 Q 789 文献标识码 A 文章编号 0517- 6611( 2008) 20- 09880- 02
R esearch Progress of M olecular Technology for B acterial Identification WANG H ao-zhu et al ( Key Laboratory o f Industria l Biotechno logy, Culture and Inform ation Center of IndustrialM icroorganism s of China U niversity, M in istry of Education, W ux,i Jiangsu 214122) A bstract A s the developm ent of the m olecular biology, them ethods of bacter ia l identification has been evolved rapidly. A ser ies o f integrated and system atic m ethodsw ere established. For exam p le, DNA-DNA hybridization, rDNA fingerpr ints, plasm id m ap, sequence de term ination o f 16S rDNA, restr iction endonuclease analysis and pulsed-fie ld gel electrophoresis analysis. The new m ethods which were based on these m e thods and their progress were introduced. K ey w ords Bacteria; M o lecular identification; R esearch progress
其认识还相对较少。目前的细菌分子鉴定方法已经相对成
熟和可靠, 但是对于多样复杂的细菌来说还有很多的局限
性, 这些新的技术还需要不断的发展和完善。相信随着分子
生物学的不断进步, 细菌鉴定的方法也将会不断的更新。分
子手段和传统方法的有机结合将会为细菌鉴定提供更加准
确的保障, 也有利于我们更好地认识、研究细菌。 参考文献
4 hsp 65限制性分析法 (AHSPRA ) h sp 65广泛存在于分枝杆菌的细菌中, 而且相对保守, 有
足够的种间差异, 适用于分枝杆菌的鉴定。AH SPRA 可针对 两种不同大小可变区使用, 分别是 441和 667 bp。基于 441 bp的方法在分枝杆菌鉴定中的应用较广, 而 667 bp 可变区 的方法主要应用于常用的龟分枝杆菌混合物 (MCC )。两者 鉴定的主要步骤见图 2。
安徽农业科学, Jou rn al ofAnhu iAgr.i Sc.i 2008, 36( 20): 9880 - 9881, 9884
责任编辑 孙红忠 责任校对 傅真治
细菌分子鉴定技术的研究进展
王浩竹 1, 2, 王正祥 1, 2 *
( 1. 工业生物技术教育部重点实验室和中国高校工业微生物资源数据平台, 江苏无锡 214122; 2. 江南大学生物工程学院, 江苏无锡 214122)
属中种的鉴定。目前 MLSA技术主要应用的是编码 RNA 聚 合酶 A-亚基的 rpoA 基因和编码苯丙氨酰-tRNA 合成酶的 pheS基因[ 19] 。通过 PCR 扩增这两个基因后进行序列分析, 并采用软件分析建立进化树[ 24] 或者进行 GC含量分析 ( 这里 的 GC 含量分析指的是每同义位点发生同义替换的比率或 是非同义位点发生非同义替换的比率 dS /dN )等方法来确定 细菌种属 [19] 。
多位点序列分析技术是一项比多位点测序技术应用更为
普遍的技术。这种技术适合基因型表征更多元化的组, 应用的 是编码蛋白质的基因序列, 这个序列普遍存在, 至少出现在分 类学研究中并且在基因组中是单拷贝的[ 11]。除了上述的两种 常用的基因以外, pm oA和 mxaF[20- 21] 等编码结构和功能蛋白 质的基因可以应用到该方法中来对细菌进行鉴定。 3 针对 23S~ 5S基因间隔序列 ( ITS)的 PCR鉴定方法
图 2 两种鉴定步骤
F ig. 2 Two identifica tion approaches
缩短了鉴定时间 [ 25]。
除了分枝杆菌属以外, 还有诺卡氏菌属也采用此方法进
行分类鉴定 [26] 。相信随着这种方法的不断发展有更多的菌
属可以通过其进行鉴定。
5 小结 细菌在人类生活和科学研究中占有重要的地位, 然而对
[ 2] LORENZ P, SCHLEPER C. M etagenom e-a challenging source of enzym e d iscovery[ J]. M olC atalB En zym, 2002( 19/20): 13- 19.
[ 3] DEUTSCHBAUER AM, CH IVIAN D, ARK IN A P. Genom ics for environmen talm icrob iology[ J]. CurrOp in B iotechnol, 2006, 17: 1- 7.
[ 1 ] BULL A T, WARD A C, GOODFELLOW M. S earch and discovery s tra-t egies for biotechno logy: The paradigm sh ift [ J ]. M icrobiolM ol B io,l 2000, 64: 573- 606.
虽然这项技术开始是针对病原菌提出的, 但是现在已应 用到非病原菌的细菌, 例如植物乳杆菌 ( Lactobacillus plan tarum ) [14]。它最大的优势是有一个庞大的数据库, 可将数据 结果直接提交到数据库进行比较, 分析不同时间不同地区临
36卷 23 期
王浩竹等 细菌分子鉴定技术的研究进展
对 MCC菌种的分析选择扩增 667 bp的 h sp 65片段, 而不 是 441 bp的片段, 是因为传统的 441 bp区域的 hsp65-PCR方 法对混合物中的M. immunogenum 菌种参考菌株的 441 bp区 域扩增水平较低, 而针对 667 bp区域设计的新模板有很高的 扩增水平。另外, 针对要扩增的 667 bp区域 PCR 可用直接 破碎细胞的方法代替常规的 DNA 模板准备, 操作简化方法。 该方法还有一个优点, 就是选择 Bbv I、E co0109 I或 N arI限制 性内切酶的一步限制性分析来代替传统的两步限制性分析,
98 81
床分离株的遗传相关性, 并能长期追踪和不断补充完善[ 15] 。 2 多位点序列分析技术 (M LSA )
16S rDNA全序列测定已广泛应用于细菌的分类鉴定, 所以其技术相对比较成熟, 但是对于一些亲缘关系相近的种 来说还存在一定局限性, 比如一些肠球菌 [16- , 18] 因此在现代 技术中开始尝试用扩增一些编码特定蛋白的基因来进行菌
Note: RFLP, ARDRA, DGGE, TGGE, SSCP and FISH w ere all u sed in pattern analys is. 图 1 多相分类法
F ig. 1 P olyphasic taxonom y
给一个专门的编号作为一个分离菌株的核酸型或序列, 这样 就可以高效得到在一个菌群内的多个型别等位基因库, 并可 显示等位基因间的微小变异来对细菌进行检测或分型。细 菌在发生变异时, 多个位点等位基因差异比单个位点的差异 更能说明它们较远的亲缘关系。当分离到一个性质未知的 病原菌时, 与等位基因谱比较就可确定它的来源[ 13] 。
多位点测序技术是由 M aiden等在 1998年提出的 [ 12], 针 对病原微生物的一种新的能够应用网络来确定和追踪分离 病原菌在全球的毒力传播和抗药性情况, 同时可追踪相对较 长周期 内病原菌 的全球 流行病学 的细菌 分型方 法 。在 M LST中常选择微生物染色体上 7个左右相距一定距离且基 本覆盖整个染色体的管家基因, 这 7个基因最大的特点是既 相对保守, 又可允许局部碱基发生点突变, 这 样既能通过 M IST研究病原菌在致病性或耐药性改变时基因谱的改变, 又能追踪较长时间的病原菌的遗传谱来源。通过双向测序, 直接测出核酸序列, 每个管家基因用 1对引物可准确测出内 部 450 bp左右的基因片段, 每个不同的基因序列称作其等位 基因, 特定的等位基因序列给出一个专门的基因序号, 所有 7 个位点等位基因的序号组成等位基因谱。每个等位基因谱
作者简介 王浩竹 ( 1983 - ), 女, 吉林 吉林人, 硕士研 究生, 研 究方向: 生物信息学。 通* 讯作者。
收稿日期 2008-02-28
注: 应用限制性片段 长度分析 (RFLP)、扩增的 rDNA限 制性分 析 ( ARDRA)、变性梯度凝胶电泳 (DGGE )、温度梯度凝胶电 泳 ( TGGE )、单链构象多肽性 ( SSCP)、荧光原位杂交 ( FISH ) 方法进行格局分析。
目前, 高可变基因间隔区的比较已经成为准确鉴定细菌 种属的常用方法 。 [22] ITS 是存在于核糖体大小亚基之间的 基因间隔序列。这些序列的长度差异可以非常大, 并且在同 一基因组内不同操纵子上的间隔片段长度都可能是不同的。
不仅长度有差异, 序列上的差异更大, 呈现出高度的可变性, 这也是能够利用 ITS进行细菌分类鉴定的重要原因。通常 ITS-PCR方法都是针对 16S ~ 23S ITS 和 5S ~ 16S ITS 设计 的, 此方法则是选择了 23S~ 5S ITS作为 PCR 扩增的目标基 因, 扩增后通过与数据库中的数据进行比对后确定细菌的种 属。针对 16S-23S IST基因的 PCR 技术已经在细菌鉴定方面 得到了广泛的应用, 其数据库相对于 23S-5S ITS数据库也比 较丰富, 但不是所有的细菌种属都适用于 16S-23S ITS或 5S16S ITS基因的 PCR 技术, 像立克次氏体属采用常规方法难 以鉴定到种的水平 [23] , 但是通过 5S~ 16S ITS基因的鉴定就 可以将其分离开来。
细菌在生化循环 (碳、氮以及其他矿物质 )、能源转化、生 物催化等方面扮演着重要角色, 这使得细菌在新的工业和生 物医学方法领域成为重要的资源 [ 1- 3] 。然而, 目前已知的细 菌种类有限, 大概有 6 370种[ 4]。随着越来越多的细菌的发 现, 对其分类鉴定也就变得非常重要。虽然目前传统的表型 和化学鉴定方法是不可缺少的, 但是很多种属之间生理生化 特征很相似, 单凭传统的鉴定方法已无法将其区分。随着分 子生物学研究的不断深入, 细菌的分类鉴定也从最初的表型 和化学鉴定演变到了分子水平, 通过对细菌 DNA 的鉴定来 达到区分种属的目的, 使鉴定结果更加准确和可靠。已经比 较成熟的分子鉴定方法有很多, 目前对于细菌而言, 最常用 的是 16S rDNA 全序列的测定, 还有将多种方法如将表形分 析、基因型分析和以分类学为目的的系统发育特征分析结合 在一起的方法, 这样的方法被看作是 / 多相分类方法 0 [ 5- 11] (图 1[ 11] )。笔者主要介绍几种在以往鉴定技术基础上新的 鉴定方法。 1 多位点测序技术 (M LST)
摘要 细菌的分子鉴定方法随着分子生物学的不断发展而得到了长足的进步, 建立了一系列完整而系统的鉴定方法, 如 DNA-DNA 杂 交、rDNA 指纹图谱、质粒图谱、16S rDNA 全序列测定、限制性核酸内切酶分析、脉冲场凝胶电泳分析等方法。介绍了在这些分子鉴定方 法基础上产生的新的或有针对性的细菌分子鉴定技术及其研究进展。 关键词 细菌; 分子鉴定; 研究进展 中图分类号 Q 789 文献标识码 A 文章编号 0517- 6611( 2008) 20- 09880- 02
R esearch Progress of M olecular Technology for B acterial Identification WANG H ao-zhu et al ( Key Laboratory o f Industria l Biotechno logy, Culture and Inform ation Center of IndustrialM icroorganism s of China U niversity, M in istry of Education, W ux,i Jiangsu 214122) A bstract A s the developm ent of the m olecular biology, them ethods of bacter ia l identification has been evolved rapidly. A ser ies o f integrated and system atic m ethodsw ere established. For exam p le, DNA-DNA hybridization, rDNA fingerpr ints, plasm id m ap, sequence de term ination o f 16S rDNA, restr iction endonuclease analysis and pulsed-fie ld gel electrophoresis analysis. The new m ethods which were based on these m e thods and their progress were introduced. K ey w ords Bacteria; M o lecular identification; R esearch progress
其认识还相对较少。目前的细菌分子鉴定方法已经相对成
熟和可靠, 但是对于多样复杂的细菌来说还有很多的局限
性, 这些新的技术还需要不断的发展和完善。相信随着分子
生物学的不断进步, 细菌鉴定的方法也将会不断的更新。分
子手段和传统方法的有机结合将会为细菌鉴定提供更加准
确的保障, 也有利于我们更好地认识、研究细菌。 参考文献
4 hsp 65限制性分析法 (AHSPRA ) h sp 65广泛存在于分枝杆菌的细菌中, 而且相对保守, 有
足够的种间差异, 适用于分枝杆菌的鉴定。AH SPRA 可针对 两种不同大小可变区使用, 分别是 441和 667 bp。基于 441 bp的方法在分枝杆菌鉴定中的应用较广, 而 667 bp 可变区 的方法主要应用于常用的龟分枝杆菌混合物 (MCC )。两者 鉴定的主要步骤见图 2。
安徽农业科学, Jou rn al ofAnhu iAgr.i Sc.i 2008, 36( 20): 9880 - 9881, 9884
责任编辑 孙红忠 责任校对 傅真治
细菌分子鉴定技术的研究进展
王浩竹 1, 2, 王正祥 1, 2 *
( 1. 工业生物技术教育部重点实验室和中国高校工业微生物资源数据平台, 江苏无锡 214122; 2. 江南大学生物工程学院, 江苏无锡 214122)
属中种的鉴定。目前 MLSA技术主要应用的是编码 RNA 聚 合酶 A-亚基的 rpoA 基因和编码苯丙氨酰-tRNA 合成酶的 pheS基因[ 19] 。通过 PCR 扩增这两个基因后进行序列分析, 并采用软件分析建立进化树[ 24] 或者进行 GC含量分析 ( 这里 的 GC 含量分析指的是每同义位点发生同义替换的比率或 是非同义位点发生非同义替换的比率 dS /dN )等方法来确定 细菌种属 [19] 。
多位点序列分析技术是一项比多位点测序技术应用更为
普遍的技术。这种技术适合基因型表征更多元化的组, 应用的 是编码蛋白质的基因序列, 这个序列普遍存在, 至少出现在分 类学研究中并且在基因组中是单拷贝的[ 11]。除了上述的两种 常用的基因以外, pm oA和 mxaF[20- 21] 等编码结构和功能蛋白 质的基因可以应用到该方法中来对细菌进行鉴定。 3 针对 23S~ 5S基因间隔序列 ( ITS)的 PCR鉴定方法