猫泛白细胞减少症、杯状、疱疹、冠状病毒、血巴尔通体PCR检测方法
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10报告
根据检测结果，出具报告。
附录A
（规范性附录）
猫泛白细胞减少症病毒、杯状病毒、疱疹1型病毒的多重PCR检测
采用PCR方法，特异性扩增猫泛白细胞减少症病毒(FPV)的NS基因序列、猫杯状病毒(FCV)的ORF2基因序列以及猫1型疱疹病毒(FHV-I)的TK基因序列，用于猫泛白细胞减少症病毒、杯状病毒、疱疹1型病毒的多重检测。
A.1RNA和DNA的提取
按照试剂盒说明书分别提取病毒RNA和DNA。将RNA反转录为cDNA。将提取的DNA和反转得到的cDNA于-20℃保存、备用。
A.2PCR反应
以FCV的cDNA和FPV、FHV-I的DNA混合物作为多重PCR的模板进行PCR扩增，扩增引物见表1，PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min，30个循环；72℃10min。
表A.1多重PCR引物序列
Primers Sequences(5'-3')Length
FPV ATGGTTGGTGACTCTTTGTTT392bp
TACATTTGATTGACACTTCCC
FCV AACCTGCGCTAACGTGCTT922bp
CAGTGACAATACACCCAGAA
FHV-I GACGTGGTGAATTATCAG290bp
CAACTAGATTTCCACCAGG
A.3PCR产物
1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
附录B
（规范性附录）
猫冠状病毒RT-PCR检测方法
采用RT-PCR方法，特异性扩增猫冠状病毒ORF1b基因片段，用于猫冠状病毒的检测。
B.1病毒RNA的提取和cDNA第一链的合成
按照病毒RNA提取试剂盒操作方法进行RNA的提取，按照cDNA第一链合成试剂盒操作方法将RNA反转录为cDNA，得到的cDNA于-20℃保存、备用。
B.2PCR反应引物
上游引物序列（5’-3’）：GTGATGCTATCATGACTAG
下游引物序列（5’-3’）：CACCATTACAACCTTCTAA
B.3PCR反应条件
95℃预变性2min；95℃变性30s，48℃退火35s，72℃延伸45s，30个循环；72℃延伸5min。
B.4PCR产物
PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测,目的片段大小为417bp。
附录C
（规范性附录）
猫白血病病毒巢式RT-PCR检测方法
采用巢式RT-PCR方法，特异性扩增猫白血病病毒基因片段，用于猫白血病病毒的检测。
C.1病毒RNA的提取和cDNA第一链的合成
按照病毒RNA提取试剂盒操作方法进行RNA的提取，按照cDNA第一链合成试剂盒操作方法将RNA反转录为cDNA，得到的cDNA于-20℃保存、备用。
C.2PCR反应引物
C.2.1第一次反应引物
上游引物序列（5’-3’）：ACAGCAGAAGTTTCAAGGCC
下游引物序列（5’-3’）：GACCAGTGATCAAGGGTGAG
C.2.2第二次反应引物
上游引物序列（5’-3’）：GCTCCCCAGTTGACCAGAGT
下游引物序列（5’-3’）：GCTTCGGTACCAAACCGAAA
C.3PCR反应
C.3.1第一次PCR反应
以制备的cDNA为模板，进行第一次PCR反应，条件如下：95℃预变性2min；95℃变性45s，58℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸7min。
C.3.2第二次PCR反应
以第一次PCR产物为模板，进行第二次PCR反应，条件如下：95℃预变性2min；95℃变性45s，58℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸7min。
C.4PCR产物
PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测,目的片段大小为601bp。
附录D
（规范性附录）
猫免疫缺陷病毒巢式RT-PCR检测方法
采用巢式RT-PCR方法，特异性扩增猫免疫缺陷病毒pol基因片段，用于猫免疫缺陷病毒的检测。
D.1病毒RNA的提取和cDNA第一链的合成
按照病毒RNA提取试剂盒操作方法进行RNA的提取，按照cDNA第一链合成试剂盒操作方法将RNA反转录为cDNA，得到的cDNA于-20℃保存、备用。
D.2PCR反应引物
D.2.1第一次反应引物
上游引物序列（5’-3’）：TGGCCWYTAWCWAATGAAAARATWGAAGC
下游引物序列（5’-3’）：GTAATTTRTCTTCHGGNGTYTCAAATCCCC
D.2.2第二次反应引物
上游引物序列（5’-3’）：TGAAAARATWGAAGCHTTAACAGAMATAG
下游引物序列（5’-3’）：GTAATTTRTCTTCHGGNGTYTCAAATCCCC
D.3PCR反应
D.3.1第一次PCR反应
以制备的cDNA为模板，进行第一次PCR反应，条件如下：95℃预变性2min；95℃变性45s，58℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸7min。
D.3.2第二次PCR反应
以第一次PCR产物为模板，进行第二次PCR反应，条件如下：95℃预变性2min；95℃变性45s，58℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸7min。
D.4PCR产物
PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测,目的片段大小为578bp。