氨基酸组成分析

第三节 特殊氨基酸的保护和定量
不同条件下，各种氨基酸的回收有所不同，但色氨酸均遭 不同条件下，各种氨基酸的回收有所不同， 色氨酸均遭 破坏，通常解决方法有以下5 破坏，通常解决方法有以下5种。 1.水解酸中加添加剂 1.水解酸中加添加剂 这些添加剂包括琉基乙酸和β 琉基乙醇， 这些添加剂包括琉基乙酸和β-琉基乙醇，我们通过实验 色氨酸保护效果较好 认为液相水解时加入巯基乙醇对色氨酸保护效果较好， 认为液相水解时加入巯基乙醇对色氨酸保护效果较好，色氨 酸的回收可达80％。有报道Perkin-Elmer公司针对其产品 酸的回收可达80％。有报道Perkin-Elmer公司针对其产品 ％。有报道 ABI420A的特点 推出试剂十二烷基硫醇， ABI420A的特点，推出试剂十二烷基硫醇，专门保护色氨 的特点， 据称回收率达97％。 酸，据称回收率达97％。 2.有机酸 2.有机酸 3mol/L 巯基乙磺酸(mercaptoethanesulfonic acid) 巯基乙磺酸(mercaptoethanesulfonic 4mol/L甲磺酸 甲磺酸(methane-sulacid)在水解时对 在水解时对色 或4mol/L甲磺酸(methane-sul-fonie acid)在水解时对色 氨酸有一定的保护作用 有一定的保护作用。 氨酸有一定的保护作用。
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第四节 氨基酸组成原位分析
如果蛋白质样品采用电泳法(如 分离， 如果蛋白质样品采用电泳法 如SDS-PAGE)分离，则很难从凝胶中洗 分离 脱下来，可采用电印迹法把样品转移到PVDF膜上，然后在 膜上， 脱下来，可采用电印迹法把样品转移到 膜上 然后在PVDF膜上直 膜上直 接进行盐酸水解和氨基酸分析，称之为原位( 分析。 接进行盐酸水解和氨基酸分析，称之为原位 in situ)分析。因为通常 分析 所用聚丙烯酰胺凝胶分离系统中含大量甘氨酸和Tris盐，易干扰氨基酸 所用聚丙烯酰胺凝胶分离系统中含大量甘氨酸和 盐 原位分析，故改用CAPS缓冲系统以减少影响。另外，在膜上做氨基酸 缓冲系统以减少影响。 原位分析，故改用 缓冲系统以减少影响 另外， 组成分析时可以做一个空白对照，具体操作时将含蛋白条带的PVDF膜 组成分析时可以做一个空白对照，具体操作时将含蛋白条带的 膜 割下，另取一条相同面积的转移膜作为空白，分别置于水解指管中,加入 割下，另取一条相同面积的转移膜作为空白，分别置于水解指管中 加入 70 l含7％(m/V)巯基乙酸的 巯基乙酸的6mol/L盐酸以防止抽真空时膜片的漂 含 ％ 巯基乙酸的 盐酸以防止抽真空时膜片的漂 将水解指管放入水解反应器中，在反应器底部加入200 l含7％巯基 出，将水解指管放入水解反应器中，在反应器底部加入 含 ％ 乙酸的6mol/L盐酸，110℃真空水解 盐酸， 乙酸的 盐酸 ℃真空水解24h，水解结束后用 ，水解结束后用200 l含30 含 甲醇的0.1mol/L盐酸反复三次将氨基酸从 盐酸反复三次将氨基酸从PVDF膜中抽提出来，以便 膜中抽提出来， ％甲醇的 盐酸反复三次将氨基酸从 膜中抽提出来 进行下一步的分析。 进行下一步的分析。
3．碱 ． 用氢氧化钠和氢氧化钡代替酸水解，可保护色氨酸不被破坏。 色氨酸不被破坏 用氢氧化钠和氢氧化钡代替酸水解，可保护色氨酸不被破坏。 4．酶 ． 蛋白酶水解法有时也有应用，其优点是条件温和， 蛋白酶水解法有时也有应用，其优点是条件温和，对天冬酰胺和谷氨 酰胺及色氨酸均无破坏作用，但酶水解法往往不完全， 酰胺及色氨酸均无破坏作用，但酶水解法往往不完全，必须用酸水解法 校正。 校正。 5．光谱法 ． 分光光度法和二阶微分光谱法可测定色氨酸，前者应用较早， 分光光度法和二阶微分光谱法可测定色氨酸，前者应用较早，在蛋白 质分子中，如不含半胱氨酸和其他有干扰的发色基团的氨基酸， 质分子中，如不含半胱氨酸和其他有干扰的发色基团的氨基酸，根据其 盐酸胍的中性溶液中的紫外吸收， 在6mol/L盐酸胍的中性溶液中的紫外吸收，测定色氨酸和酪氨酸的含 盐酸胍的中性溶液中的紫外吸收 此经验公式只适用于色氨酸对酪氨酸的比值为0.2～1时的情况。酪 时的情况。 量，此经验公式只适用于色氨酸对酪氨酸的比值为 ～ 时的情况 氨酸常被用来确定蛋白质中芳香族氨基酸的含量，计算公式复杂。 氨酸常被用来确定蛋白质中芳香族氨基酸的含量，计算公式复杂。 Hewlett Packard公司推出的 公司推出的DAD检测器配合其化学工作站软件， 检测器配合其化学工作站软件， 公司推出的 检测器配合其化学工作站软件 能较方便地在线检测并定量肽段中的色氨酸。 能较方便地在线检测并定量肽段中的色氨酸。 虽然蛋白质和多肽的氨基酸分析法对大多数氨基酸是快速、 虽然蛋白质和多肽的氨基酸分析法对大多数氨基酸是快速、准确和灵 敏的，但在半胱氨酸定量时仍遇到很大困难， 敏的，但在半胱氨酸定量时仍遇到很大困难，解决这个问题的途径有两 一种是还原烷化法，另一种是氧化法。 种，一种是还原烷化法，另一种是氧化法。
第二节 蛋白质的水解方法
氨基酸分析的第一步是将蛋白质或多肽水解， 氨基酸分析的第一步是将蛋白质或多肽水解，常规方法是采用 5.7mol/L盐酸在真空状况下于 盐酸在真空状况下于110℃水解 盐酸在真空状况下于 ℃水解24h，也有在 ，也有在150℃下快速水 ℃ 解90min。 。 Waters公司有商品化仪器 水解工作台 出售。将100～500 mol的 公司有商品化仪器(水解工作台 出售。 公司有商品化仪器 水解工作台)出售 ～ 的 蛋白质或肽转移到水解指管中冷冻抽干， 蛋白质或肽转移到水解指管中冷冻抽干，在水解反应器中加入 5.7mol/L盐酸 盐酸200 l，含2％苯酚 m/V)，将指管置于反应器中，抽真 盐酸 ， ％苯酚( ，将指管置于反应器中， 空并充氮气反复三次(图 空并充氮气反复三次 图3.1c，真空控制也是实验重复性的一项重要因 ， 素)110℃保温 ℃保温22h。其中，苯酚是作为一种抗氧化剂来防止半胱氨酸 。其中， (Cys)和甲硫氨酸 和甲硫氨酸(Met)的氧化。如果遇到一些不易裂解的肽键，如 的氧化。 和甲硫氨酸 的氧化 如果遇到一些不易裂解的肽键， Val—Val，Ile—Leu等，水解时间可适当延长至 ， 等 水解时间可适当延长至72h，但长时间水解会 ， 部分破坏含羟基的氨基酸[丝氨酸 丝氨酸(Ser)，苏氨酸 部分破坏含羟基的氨基酸 丝氨酸 ，苏氨酸(Thr)，酪氨酸 ，酪氨酸(Tyr)]。 。
(1)还原烷化法 还原烷化法 产生能抗水解的半胱氨酸衍生物。烷化试剂包括4—乙烯 产生能抗水解的半胱氨酸衍生物。烷化试剂包括 乙烯 吡啶和碘代乙酸。但这些方法有缺点， 吡啶和碘代乙酸。但这些方法有缺点，为了确保试剂接近巯 还原和氧化通常在变性剂存在下进行， 基，还原和氧化通常在变性剂存在下进行，多余试剂和变性 剂要用HPLC、沉淀法或透析去除，每一步都可能造成样品的 剂要用 、沉淀法或透析去除， 损失，特别是对于小肽和微量样品， 损失，特别是对于小肽和微量样品，而且烷化反应如果不仔 细控制条件，可能导致半胱氨酸以外其他残基的衍生。 细控制条件，可能导致半胱氨酸以外其他残基的衍生。 (2)氧化法 氧化法 氧化反应被用来转化半胱氨酸和胱氨酸成为半胱磺酸，过 氧化反应被用来转化半胱氨酸和胱氨酸成为半胱磺酸， 甲酸氧化反应的缺点是它会影响其他氨基酸特别是甲硫氨酸 会转变成甲硫氨酸砜，酪氨酸会降解。 缺点， 会转变成甲硫氨酸砜，酪氨酸会降解。为克服这一 缺点，必 须准备能分析两次的样品量，一次提供半胱氨酸数据， 须准备能分析两次的样品量，一次提供半胱氨酸数据，另一 次则提供其他氨基酸的组成数据。 次则提供其他氨基酸的组成数据。
影响氨基酸分析结果的三大因素是：水解、衍生、色谱。 影响氨基酸分析结果的三大因素是：水解、衍生、色谱。 水解是第一步，水解的完全与否对结果影响很大。 水解是第一步，水解的完全与否对结果影响很大。在实验中 通常采用一些标准蛋白质，如细胞色素c(Cyt c)、核糖核酸 通常采用一些标准蛋白质，如细胞色素 、 或胰岛素(insulin)为标样进行水解、衍生和色 为标样进行水解、 酶(RNase)或胰岛素 或胰岛素 为标样进行水解 谱分析来计算回收， 谱分析来计算回收，从而考验蛋白质分析的可靠程度和评价 方法的适用性。 方法的适用性。 但由于各种蛋门质含有的氨基酸多少不同，并且每一种氨 但由于各种蛋门质含有的氨基酸多少不同， 基酸的量也不一样，有的氨基酸含量可多到十几个， 基酸的量也不一样，有的氨基酸含量可多到十几个，有的 氨基酸含量只有1～ 个 这影响到氨基酸的回收。 氨基酸含量只有 ～2个，这影响到氨基酸的回收。生物应 用公司（ 用公司（ABI）曾设计过一种“测试肽”，即人工合成 种 ）曾设计过一种“测试肽” 即人工合成18种 不 同氨基酸的肽(除 同氨基酸的肽 除Gln、Asn外)，这样每种氨基酸出现的频 、 外 ， 率都是1，用此肽来校正回收，看来机会均等， 率都是 ，用此肽来校正回收，看来机会均等，是一种可以 采纳的方法，但在实际样品中，不太可能出现这种理想情 采纳的方法，但在实际样品中， 况。
第三章
氨基酸组成分析
氨基酸是一种小分子的两性化合物，分子质量在 ～ 氨基酸是一种小分子的两性化合物，分子质量在75～ 200Da之间，其化学通式为 之间， 之间 其化学通式为R-CH(NH2)-COOH，在生物体 ， 内出现的氨基酸都是L型 内出现的氨基酸都是 型，仅在少数微生物来源的多肽中出 型氨基酸。 现D型氨基酸。 型氨基酸 氨基酸分析技术的发展始于1820年，由Braconnot最早 氨基酸分析技术的发展始于 年 最早 将甘氨酸从白明胶水解物中分离出来，但直到21世纪 世纪， 将甘氨酸从白明胶水解物中分离出来，但直到 世纪，用 化学方法或微生物方法测定氨基酸， 化学方法或微生物方法测定氨基酸，仍是一项持续数周或数 月的繁琐的工作。 月的繁琐的工作。 色谱技术的引入为氨基酸分析打开了一扇新的大门。 色谱技术的引入为氨基酸分析打开了一扇新的大门。 1941年，Martin等运用色层法分析氨基酸，主要采用乙酰 等运用色层法分析氨基酸， 年 等运用色层法分析氨基酸 化氨基酸在硅胶柱上或滤纸上半定量；随后， 化氨基酸在硅胶柱上或滤纸上半定量；随后，Moore、 、 Stein应用离子交换柱直接分离游离的氨基酸，在1958年， 应用离子交换柱直接分离游离的氨基酸， 应用离子交换柱直接分离游离的氨基酸 年 Spackman、Stein、Moore制造了自动化的氨基酸分析 、 、 制造了自动化的氨基酸分析 使氨基酸定量分析进入了一个崭新的阶段， 仪，使氨基酸定量分析进入了一个崭新的阶段，至今仍是 经典的方法。 经典的方法。
第一节 氨基酸组成分析的目的
现代分离提纯技术的发展使蛋白质操作微量化， 现代分离提纯技术的发展使蛋白质操作微量化，但也给 定量带来了困难， 定量带来了困难，一般很难通过常规的称量或测蛋白质溶液 的光吸收值来准确定量蛋白质。 在280nm的光吸收值来准确定量蛋白质。所以如果在蛋白 的光吸收值来准确定量蛋白质 质酶解或测序前， 质酶解或测序前，取蛋白质样品的一部分进行氨基酸组成分 根据结果便可以推算出蛋白量的可靠值。 析，根据结果便可以推算出蛋白量的可靠值。 另外，在蛋白质测序中有时遇到测不出结果的情况， 另外，在蛋白质测序中有时遇到测不出结果的情况， 一种可能是蛋白质的N端封闭 端封闭， 一种可能是蛋白质的 端封闭， 另一种可能则是样品本身不是蛋白质或绝大部分是非蛋白质 物质， 物质， 解决这个问题的很好途径便是做氨基酸组成分析以确定样品 的成分。 的成分。 除了蛋白质研究和重组蛋白需要测定氨基酸组成外， 除了蛋白质研究和重组蛋白需要测定氨基酸组成外，医学 上也需要测定血液或各种体液中的游离氨基酸。 上也需要测定血液或各种体液中的游离氨基酸。