高效液相色谱分类及工作原理

阳离子交换： 阳离子交换：
R
SO3 H
- +
+
M
+
R
SO3-M+
+ H+
阴离子交换：
R
NR3+Cl-
+
X
-
R
NR3+X-
+ Cl-
一般形式：
R一A＋B ＝ R－B＋A
达平衡时，以浓度表示的平衡常数（ 达平衡时，以浓度表示的平衡常数（离子交换反应 的选择系数）： 的选择系数）：
KB / A
[B]r [ A] = [B][ A]r
X + nSad = Xad + nS
达平衡时,有 达平衡时 有
Kad
[ X ad ][S] = n [ X ][Sad ]
n
其中Kad为吸附平衡常数，值大表示组分在吸附剂 为吸附平衡常数， 其中 为吸附平衡常数 上保留强，难于洗脱。 值小,则保留值弱 上保留强，难于洗脱。Kad值小 则保留值弱，易 值小 则保留值弱， 于洗脱。试样中各组分据此得以分离。 于洗脱。试样中各组分据此得以分离。Kad值可通 值可通 过吸附等温线数据求出。 过吸附等温线数据求出。
这类固定相的多孔层厚度小、孔浅， 这类固定相的多孔层厚度小、孔浅，相 对死体积小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较大， 对死体积小，出峰迅速、柱效亦高；颗粒较大， 渗透性好，装柱容易， 渗透性好，装柱容易，梯度淋洗时能迅速达平 较适合做常规分析。由于多孔层厚度薄， 衡，较适合做常规分析。由于多孔层厚度薄， 最大允许量受限制。 最大允许量受限制。
柱之内径
长度
填充材料粒度
使用压力
分离时间
㈡与气相色谱法比较，HPLC的优点 与气相色谱法比较， 的优点
1.分析对象广 分析对象广 气相色谱只限于分析气体和沸点较低的化 合物； 合物 ； HPLC不受样品挥发性和热稳定性 不受样品挥发性和热稳定性 的限制，适用于高沸点、热稳定性差、 的限制 ， 适用于高沸点 、 热稳定性差 、 摩 尔质量大的物质。原则上讲， 尔质量大的物质 。 原则上讲 ， 几乎可以分 析除永久气体外所有的有机和无机化合物。 析除永久气体外所有的有机和无机化合物 。
2.固定相 固定相
（l）多孔型离子交换树脂 它主要是聚苯乙烯和二乙烯苯基的交联 聚合物，直径约为5 20μm μm， 聚合物，直径约为5～20μm，有微孔型和大 孔型之分。 孔型之分。 （2）薄膜型离子交换树脂 它是在直径约对30μm的固体惰性核上， 凝聚1～2μm厚的树脂层。 （3）表面多孔型离子交换树脂 它是在固体情性核上，覆盖一层微球硅 胶，再在上面涂一层很薄的离子交换树脂。
• 高压液相色谱对于挥发性低、热稳定性差、分 高压液相色谱对于挥发性低、热稳定性差、 子量大的高分子化合物以及离子型化合物的分 离尤为有利。如氨基酸、多肽、蛋白质、 离尤为有利。如氨基酸、多肽、蛋白质、生物 核酸、甾体、类脂、维生素、 碱、核酸、甾体、类脂、维生素、抗菌素等均 可进行分离分析定量。 可进行分离分析定量。
（4）离子交换键合固定相 ） 它是用化学反应将离子交换基团键合 到惰性载体表面。它也分为两种类型。 到惰性载体表面。它也分为两种类型。 一种是键合薄壳型，其载体是薄壳玻珠。 一种是键合薄壳型，其载体是薄壳玻珠。 另一种是键合微粒载体型，它的载体是 另一种是键合微粒载体型， 多孔微粒硅胶。 多孔微粒硅胶。后者是一种优良的离子 交换固定相，它的优点是机械性能稳定， 交换固定相，它的优点是机械性能稳定， 可使用小粒度固定相和高柱压来实现快 速分离。 速分离。
3.流动相 流动相
流动相称作洗脱剂。 一般把吸附色谱中流动相称作洗脱剂 一般把吸附色谱中流动相称作洗脱剂。 在吸附色谱中对极性大的试样往往采用极 性强的洗脱剂； 性强的洗脱剂；对极性弱的试样宜用极性 弱的洗脱剂。 弱的洗脱剂。
三、离子交换色谱法（IEC） 离子交换色谱法（ ）
此法是利用离子交换原理和液相色谱技 此法是利用离子交换原理和液相色谱技 术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一 种分离分析方法。 种分离分析方法。凡在溶液中能够电离的物 通常都可用离子交换色谱法进行分离。 质，通常都可用离子交换色谱法进行分离。 它不仅适用无机离子混合物的分离， 它不仅适用无机离子混合物的分离，亦可用 于有机物的分离，例如氨基酸、核酸、 于有机物的分离，例如氨基酸、核酸、蛋白 质等生物大分子。因此，应用范围较广。 质等生物大分子。因此，应用范围较广。
缺点：仪器设备费用昂贵，操作严格。 缺点：仪器设备费用昂贵，操作严格。
第二节
HPLC的主要类型 的主要类型
液一液分配色谱法（ 一、液一液分配色谱法（LLPC） ）
在液-液色谱中 流动相和固定相都是 在液 液色谱中,流动相和固定相都是 液色谱中 液体,它能适用于各种样品类型的分离和分 液体 它能适用于各种样品类型的分离和分 无论是极性的和非极性的， 析，无论是极性的和非极性的，水溶性和 油溶性的，离子型的和非离子型的化合物。 油溶性的，离子型的和非离子型的化合物。
2.固定相 固定相
液液色谱的固定相由载体和固定液 组成。常用的载体有下列几类： 组成。常用的载体有下列几类： （1）全多孔型载体：由硅胶、硅藻土等 ）全多孔型载体：由硅胶、 材料制成，直径约100 µm的全多孔型颗 材料制成，直径约 的全多孔型颗 粒。 这类固定相由于颗粒很细， 这类固定相由于颗粒很细，孔仍然 较浅，传质速率快，易实现高效、高速。 较浅，传质速率快，易实现高效、高速。 特别适合复杂混合物分离及痕量分析。 特别适合复杂混合物分离及痕量分析。
㈠经典LC与HPLC比较 经典 与 比较
经典LC 经典LC 1~5cm 50~100cm 50~100cm 150µm~200µ 150µm~200µm 1~10atm 10atm 0.5h~天 h~天 HPLC ~0.4cm 15~50cm 15~50cm 4µm~10µm m~10µ 50~200atm 50~200atm ~10min 10min
2．固定相 ．
液 － 固吸附色谱所用固定相多是一些 吸附活性强弱不等的吸附剂，如硅胶、 吸附活性强弱不等的吸附剂 ， 如硅胶 、 氧 化铝、聚酸胶等。由于硅胶的优点较多， 化铝 、 聚酸胶等 。 由于硅胶的优点较多 ， 如线性容量较高，机械性能好，不溶胀， 如线性容量较高 ， 机械性能好 ， 不溶胀 ， 与大多数试样不发生化学反应等，因此， 与大多数试样不发生化学反应等 ， 因此 ， 以硅胶用得最多。 以硅胶用得最多。 目前最广泛使用的还是5～10 µm的全 目前最广泛使用的还是5 多孔型微粒填料。 多孔型微粒填料。
第一节 高效液相色谱法概述
一、理论基础：速率理论 理论基础：
B H = A + + Cu u
A为涡流扩散项 B/u分子扩散项 Cu项即传质阻力项
二、HPLC技术 技术
采用高压输液泵，高效微粒固定相和高 采用高压输液泵， 灵敏度检测器。 灵敏度检测器。
三、HPLC特点 特点
高压、高速、高效、高灵敏度、 高压、高速、高效、高灵敏度、样品回 收方便。 收方便。
二、液一固吸附色谱法(LSAC) 液一固吸附色谱法(LSAC)
液一固吸附色谱是以固体吸附剂作 为固定相， 为固定相，吸附剂通常是些多孔的固体 颗粒物质，在它们的表面存在吸附中心。 颗粒物质，在它们的表面存在吸附中心。 液固色谱实质是根据物质在固定相上的 吸附作用不同来进行分离的。 吸附作用不同来进行分离的。
（2）表面多孔型载体（薄壳型微珠载 ）表面多孔型载体（ ）：由直径为 由直径为30 体）：由直径为 ~ 40µm的实心玻璃球 µ 的实心玻璃球 和厚度约为1 的多孔性外层所组成。 和厚度约为 ~ 2 µm的多孔性外层所组成。 的多孔性外层所组成 目前，这种载体粒度为5 目前，这种载体粒度为 ~ 10 µm。 。
⑶化学键合固定相：它是将各种不同有机基 化学键合固定相：
团通过化学反应键合到载体表面的一种方法。 团通过化学反应键合到载体表面的一种方法。 它代替了固定液的机械涂渍， 它代替了固定液的机械涂渍，因此它的产 生对液相色谱法迅速发展起着重大作用， 生对液相色谱法迅速发展起着重大作用，可以 认为它的出现是液相色谱法的一个重大突破。 认为它的出现是液相色谱法的一个重大突破。 它是目前应用最广泛的一种固定相。 它是目前应用最广泛的一种固定相。 据统计，约有3/4以上的分离问题是在化学 据统计，约有3/4以上的分离问题是在化学 3/4 键合固定相上进行的。 键合固定相上进行的。
式中[A]r，[B]r 分别代表树脂相中洗脱剂离子 ， 式中 （A）和试样离子（B）的浓度，[A]、[B]则代表 ）和试样离子（ ）的浓度， 、 则代表 它们在溶液中的浓度。 它们在溶液中的浓度。 KB/A越大，说明 离子交换能力越大，越易保 越大，说明B离子交换能力越大 离子交换能力越大， 离子电荷越大， 留而难于洗脱。一般说来， 离子电荷越大 留而难于洗脱。一般说来，B离子电荷越大，水 合离子半径越小， 值就越大。 合离子半径越小， KB/A值就越大
1．离子交换原理 ．
离子交换色谱法是利用不同待测离子对 固定相亲和力的差别来实现分离的。 固定相亲和力的差别来实现分离的 。 其固定 相采用离子交换树脂， 相采用离子交换树脂 ， 树脂上分布有固定的 带电荷基团和可游离的平衡离子。 带电荷基团和可游离的平衡离子 。 当待分析 物质电离后产生的离子可与树脂上可游离的 平衡离子进行可逆交换， 平衡离子进行可逆交换 ， 其交换反应通式如 下：
3．流动相 ．
根据所使用的流动相和固定相的极性程 将其分为正相分配色谱 反相分配色谱。 正相分配色谱和 度，将其分为正相分配色谱和反相分配色谱。
正相分配色谱：流动相的极性小于固定相的极性， 正相分配色谱：流动相的极性小于固定相的极性， 它适用于极性化合物的分离。 它适用于极性化合物的分离。其 流出顺序是极性小的先流出 是极性小的先流出， 流出顺序是极性小的先流出，极 性大的后流出。 性大的后流出。 反相分配色谱：流动相的极性大于固定相的极性， 反相分配色谱：流动相的极性大于固定相的极性， 它适用于非极性化合物的分离， 它适用于非极性化合物的分离， 其流出顺序与正相色谱恰好相反
1．分离原理 ．
当流动相通过固定相（吸附剂） 当流动相通过固定相（吸附剂）时，吸附剂 表面的活性中心就要吸附流动相分子。同时， 表面的活性中心就要吸附流动相分子。同时，当 试样分子（ ） 被流动相带入柱内， 试样分子 （ X）被流动相带入柱内 ， 只要它们在 固定相有一定程度的保留就要取代数目相当的已 被吸附的流动相溶剂分用）于是， 被吸附的流动相溶剂分用）于是，在固定相表面 发生竞争吸附: 发生竞争吸附
⒉流动相对分离起作用 气相色谱的流动相仅起运载作用， 气相色谱的流动相仅起运载作用，对 组分不产生相互作用力； 组分不产生相互作用力；HPLC的流动相对 的流动相对 组分产生相互作用力， 组分产生相互作用力，相当于增加了一个 控制和改进分离条件的参数。 控制和改进分离条件的参数。
⒊经常在室温条件下操作 气相色谱法一般在较高温度下进行
第三章 高效液相色谱法
High Performance Liquid Chromatography，HPLC
• 生物材料和生物体液是目前所知道撮复杂的化 学物质的混合物，所含成分在一万种以上， 学物质的混合物，所含成分在一万种以上，其 分子量从18到几百万 到几百万， 分子量从 到几百万，而且其中有意义的化学 成分的含量又往往很低，因此， 成分的含量又往往很低，因此，必须要有一种 高分辨、高灵敏度的分离鉴定手段， 高分辨、高灵敏度的分离鉴定手段，气相色谱 和高压液相色谱具有以上特点，它们可通过对 和高压液相色谱具有以上特点， 生物样品和生物体液样品的有关成分的提取、 生物样品和生物体液样品的有关成分的提取、 分离、分析定量， 分离、分析定量，进行对疾病的早期快速诊断 的研究，病理病因的研究， 的研究，病理病因的研究，以及药物在体内代谱的分离原理基本与液液 萃取相同， 萃取相同，都是根据物质在两种互不相溶 的液体中溶解度的不同， 的液体中溶解度的不同，具有不同的分配 系数。 系数。所不同的是液液色谱的分配是在柱 中进行的， 中进行的，使这种分配平衡可反复多次进 造成各组分的差速迁移， 行，造成各组分的差速迁移，提高了分离 效率，从而能分离各种复杂组分。 效率，从而能分离各种复杂组分。