膜片钳技术及其应用2010
膜片钳技术的发展及其应用
第27卷 第2期 运城学院学报V o.l27 N o.2 2009年4月 Journa l of Y uncheng U n i versity Apr.2009膜片钳技术的发展及其应用曹建斌(运城学院生命科学系,山西运城044000)摘 要:膜片钳技术是在电压钳技术的基础上发展起来的,来反映细胞膜上离子通道活动的一项技术。
它对通过离子通道的离子电流进行记录,目前已发展出多种记录模式,广泛应用于神经科学、药理学、细胞生物学、生理学和分子生物学等学科领域。
概括了膜片钳技术的基本原理,归纳出该技术的主要操作步骤,并对其发展与应用进行了总结。
关键词:膜片钳;离子通道;电生理;发展及应用中图分类号:Q424 文献标识码:A 文章编号:1008-8008(2009)02-0053-03细胞是构成生物体的基本单位。
在细胞的外周有一层以脂类和蛋白质分子为主要成分的细胞膜,在细胞膜上存在有多种离子通道,细胞通过这些通道与外界进行物质、能量和信息的交流。
离子通道是细胞兴奋性的基础,在细胞内及细胞与细胞之间的信号传递中起着非常重要的作用。
对离子通道的研究来源于生理学实验,英国学者H uxley和K atz[1]最早应用电压钳来研究细胞膜上离子通道的电流变化,但由于该技术对细胞的损伤大,难以使细胞膜各处的生理特性保持一致,因而逐渐被膜片钳技术所取代。
膜片钳技术为生物膜离子通道的门控动力学研究和不同离子通道的通透性以及细胞的生理特性研究提供了直接的手段。
1.膜片钳技术的基本原理膜片钳技术(patch-cla m p techni que)是在电压钳技术的基础上发展起来的,采用记录流过离子通道的离子电流,来反映细胞膜上单一的(或多个的)离子通道分子活动的技术。
该技术可将一尖端经加热抛光的玻璃微电极管吸附只有几平方微米的细胞膜,在玻璃电极尖端边缘与细胞膜之间形成高阻封接,因而可通过微电极直接对膜片(细胞膜小区域)进行电压钳制,而无需使用其它微电极(如图1)。
膜片钳的发展与应用
膜片钳技术的发展与应用崔梦梦（生命科学学院 1241410026）摘要：膜片钳技术是在电压钳技术的基础上发展起来的，该技术的核心是能够记录单一离子通道的电流。
膜片钳可以测量到0.06pA的电流，它具有1um的空间分辨率和10us的时间分辨率。
作为先进的细胞电生理技术，膜片钳一直被奉为研究离子通道的“金标准”。
应用膜片钳技术可以证实细胞膜上离子通道的存在并能对其电生理特性、分子结构、药物作用机稍等进行深入的研究。
此外，将膜片钳技术与其他一些先进的技术结合，使其在药理学、病理学、神经科学、脑科学、细胞生物学和分子生物学等生物科学方面,，得到了越来越广泛的应用。
关键词：膜片钳；离子通道；发展与应用在细胞膜上存在有许多的离子通道，这些离子通道是细胞兴奋性的基础，对细胞内以及细胞之间的信息传递起着非常重要的作用。
为探究离子通道的功能和结构，许多电生理技术被发明创造。
英国学者Huxley和Katz最早应用电压钳来研究细胞膜上离子通道的电流变化，但由于该技术钳制的细胞膜面积很大，包含着大量随机开放和关闭着的离子通道，因而不能测定单一离子通道电流。
所以在1976年德国神经生物学家Erwin Neher和Bert Sakmann 建立起一种新的技术，即膜片钳技术，并且逐渐取代了电压钳技术。
随着膜片钳技术的不断完善，自1981年以来, 该技术已经在不同动物的肝、脾、胃肠、心肌、骨骼肌、神经系统、内分泌等各类细胞上应用并取得了研究成果。
膜片钳技术点燃了细胞和分子水平的生理学研究的革命之火，给生命科学研究带来了巨大的前进动力。
一、膜片钳技术的基本原理膜片钳技术是利用玻璃微电极尖端经抛光后贴附于神经元膜上，与玻璃微电极尖端相接的膜仅含1—3个离子通道，然后通过负压吸引将这片膜与周围的膜实行高阻封接，因此在电极尖端覆盖下的那片膜，在电学上已于膜的其他部分相互分隔。
电极尖端下的膜通道开放所产生的电流流进玻璃微电极吸管，通过一极其敏感的膜片钳放大器，就可测量得到单一离子通道电流。
patch clamp膜片钳技术的原理和应用(超全的哦)
第二部分
一：应用学科
膜片钳技术的应用
膜片钳技术发展至今，已经成为现代细胞电生理的常规 方法，它不仅可以作为基础生物医学研究的工具，而且直 接或间接为临床医学研究服务， 目前膜片钳技术广泛应用于神经（脑）科学、心血管科 学、药理学、细胞生物学、病理生理学、中医药学、植物 细胞生理学、运动生理等多学科领域研究。 随着全自动膜片钳技术（Automatic patch clamp technology）的出现，膜片钳技术因其具有的自动化、高 通量特性，在药物研发、药物筛选中显示了强劲的生命 力。
5.对药物作用机制的研 在通道电流记录中，可分别于不同时间、不同部位（膜内 或膜外）施加各种浓度的药物，研究它们对通道功能的可 能影响，了解那些选择性作用于通道的药物影响人和动物 生理功能的分子机理。这是目前膜片钳技术应用最广泛的 领域，既有对西药药物机制的探讨，也广泛用在重要药理 的研究上。如开丽等报道细胞贴附式膜片钳单通道记录法 观测到人参二醇组皂苷可抑制正常和“缺血”诱导的大鼠大 脑皮层神经元L-型钙通道的开放，从而减少钙内流，对缺 血细胞可能有保护作用。陈龙等报道采用细胞贴附式单通 道记录法发现乌头碱对培养的Wistar大鼠心室肌细胞L-型 钙通道有阻滞作用。
膜片钳技术及其应用
膜片钳技术可以用于研究细胞信号转导过程中离子通道和受体的变 化，了解信号转导的机制。
细胞功能调控的研究
膜片钳技术可以用于研究细胞功能调控的机制，例如细胞兴奋性的 调节和细胞内离子浓度的变化。
04 膜片钳技术的优势与局限 性
膜片钳技术的优势
高灵敏度
细胞无损
膜片钳技术具有高灵敏度，能够检测单 个离子通道的活动，从而提供关于细胞 膜电位和离子通道功能的重要信息。
膜片钳技术可以在保持细胞完整性的 情况下进行实验，不会对细胞造成严 重损伤或干扰细胞的正常功能。
实时监测
膜片钳技术可以对细胞膜电位进行实时 监测，从而了解离子通道的动态变化， 有助于深入理解细胞生理和病理过程。
膜片钳技术的局限性
1 2 3
实验条件要求高
膜片钳技术需要高精度的实验设备和条件，包括 低温、低噪声和低阻抗等，这增加了实验的难度 和成本。
03
04
05
膜片钳放大器
微操纵器
细胞培养皿或显 微镜载玻片
电极溶液
细胞内和细胞外 灌流液
用于放大细胞膜电信号， 提高信号的检测灵敏度。
用于精确控制电极的移动 ，以便在细胞膜上定位和 进行膜片钳实验。
用于培养和固定细胞，以 便进行膜片钳实验。
用于填充电极，以保持电 极的湿润和导电性。
用于维持细胞内外环境的 稳定，并排除干扰实验的 物质。
03
在单细胞水平上研究细胞信号转导和离子通道功能，深入了 解细胞生理和病理过程。
膜片钳技术与其他技术的联合应用
结合光学成像技术，利用膜片钳技术对神经元电生理特性进行同时监测和成像，实现多参数的同时测 量。
与基因编辑技术结合，利用膜片钳技术对特定基因表达的离子通道进行功能研究，深入了解基因与离子 通道的关系。
膜片钳技术及其应用2010
机械系统:由
于膜片钳实验 是一个微电和 微操作实验， 任何微小的震 动都会影响电 极和细胞的封 接，导致实验 的失败，因此 一台高质量的 防震台是必须 的。
辅助系统：膜片钳实验系统是一个综合性
的集成系统，除了上面提到的几大系统外， 相关的辅助系统也是必不可少的，辅助系统 的设备好坏，很大程度上左右着实验能否顺 利开展，有的实验室主要系统配置十分主流， 而辅助系统则凑合，这将极大的影响实验， 所谓细节决定成败，用在膜片钳实验中是十 分贴切的。
(1).电压钳模式：在钳制细胞膜
电位的基础上改变膜电位，记录离 子通道电流的变化，记录的是诸如 通道电流；EPSC;IPSC等电流信号。 是膜片钳的基本工作模式.
(2).电流钳模式:向细胞内注入刺
激电流，记录膜电位对刺激电流的 反应。记录的是诸如动作电位， EPSP;IPSP等电压信号。
膜片钳的几种记录模式极其形成：
K+电流
Na+电流
cole
电压钳的原理：用两根尖端直径
0.5um的电极插入细胞内，一根电极用作 记录电极以记录跨膜电位，用另一根电极 作为电流注入电极，以固定膜电位。从而 实现固定膜电位的同时记录膜电流。电位 记录电极引导的膜电位（Vm）输入电压钳 放大器的负输入端，而人为控制的指令电 位（Vc）输入正输入端，放大器的正负输 入端子等电位，向正输入端子施加指令电 位（Vc）时，经过短路负端子可使膜片等 电位，即Vm=Vc,从而达到电位钳制的目的， 并可维持一定的时间。Vc的不同变化将导 致Vm的变化，从而引起细胞膜上电压依赖 性离子通道的开放，通道开放引起的离子 流反过来又引起Vm的变化，致使Vm≠Vc, Vc与Vm的任何差值都会导致放大器有电压 输出，将相反极性的电流注入细胞，以使 Vc=Vm，注入电流的大小与跨膜离子流相 等，但方向相反。因而注入的电流被认为 是标本兴奋时的跨膜电流值（通道电流）。
膜片钳技术及应用
制备玻璃微电极
拉制微电极 材料：硼硅酸盐毛细玻璃管。 要求：玻璃毛胚外径1.3~1.7㎜，内径1.0~1.2
㎜，壁的厚度在0.2㎜以上。管壁越厚，拉 制出的电极尖端管壁也越厚，电极的跨壁 电容就越小，噪声也就越低。
玻璃微电极及膜片的几何形状
电极拉制仪
拉制方法：两步拉制法。
第一步：使玻璃软化，并拉开一个距离，形 成一个细管，即拉制电极的颈部；
高阻封接形成的电流图
膜片钳技术四种基本记录模式
细胞吸附膜片(cell-attached patch) 将两次拉制后经加热抛光的微管电极置于
清洁的细胞膜表面上，形成高阻封接，在细 胞膜表面隔离出一小片膜，既而通过微管电 极对膜片进行电压钳制，高分辨测量膜电流， 称为细胞贴附膜片。由于不破坏细胞的完整 性，
膜片钳技术
向细胞内注射恒定或变化的电流刺激， 纪录由此引起的膜电位的变化，这叫做电流 钳技术。在具体实验中，可通过给予细胞一 系列电流脉冲刺激，诱发细胞产生动作电位。
电压钳技术是通过向细胞内注射一定的
电流，抵消离子通道开放时所产生的离子流， 从而将细胞膜电位固定在某一数值。由于注 射电流的大小与离子流的大小相等、方向相 反。因此它可以反映离子流的大小和方向。
电极液的充灌
对于尖端较细的玻璃微电极，膜片钳实 验中常用的方法是：在微电极尾部施加负压 使尖端充灌电极内液，然后用注射器在微电 极尾部充灌电极内液，最后轻弹微电极杆步 使其内的气泡排出。
充灌长度为电极的1/3。
制备细胞标本
从理论上来讲，膜片钳实验用的细胞标 本可来自体内各种组织细胞，只要细胞表面 光滑，能与微电极尖端形成高阻封接即可。 但在标本制备上，不同组织细胞间联接牢固 程度不同，采用的分离方法也不完全相同。 大体上包括冲洗、酶解消化或机械分离以及 清洗等步骤。
膜片钳的原理和应用
膜片钳的原理和应用膜片钳的原理膜片钳是一种常见的机械制动器，它的工作原理基于膜片的弹性变形和钳片的夹持作用。
膜片钳由膜片和钳片组成，通过外部力的作用，使膜片产生变形，进而通过钳片的夹持实现制动功能。
膜片钳的主要部件是膜片，膜片通常由弹簧钢或不锈钢材料制成，具有良好的弹性。
当膜片钳受到外部力的作用时，膜片会发生弹性变形，从而产生一定的弹性力，通过这种弹性力的作用，将制动器与被制动器之间产生接触，并通过膜片的变形实现制动。
膜片钳的应用膜片钳由于其结构简单、可靠性高、使用寿命长等特点，被广泛应用于各个领域。
1. 汽车制动系统膜片钳在汽车制动系统中起到至关重要的作用。
汽车制动系统中的制动器通常由膜片钳和摩擦材料组成。
当驾驶员踩下制动踏板时，膜片钳受到踏板力的作用，膜片钳的膜片发生弹性变形，钳片夹持摩擦材料与制动器之间的摩擦面，实现制动效果。
2. 工业机械膜片钳在工业机械中也有广泛的应用。
例如，膜片钳可以用于制动装置，通过膜片的变形实现机械的制动。
此外，膜片钳还可以用于离合器，通过膜片的弹性变形实现传动效果。
3. 制动防抱死系统膜片钳还可以应用于汽车的制动防抱死系统中。
制动防抱死系统通过利用膜片钳的快速反应和可靠的制动效果，实现对车轮的减速和控制，防止车轮抱死，提高行车安全性。
4. 其他领域膜片钳还可以应用于其他领域，如航空航天、医疗设备等。
在航空航天领域，膜片钳可以用于飞机的刹车系统，通过膜片钳的制动作用实现飞机的停止。
在医疗设备中，膜片钳可以用于手术器械的夹持，实现准确和可靠的操作。
总结膜片钳是一种常见的机械制动器，通过膜片的弹性变形和钳片的夹持作用实现制动功能。
膜片钳由于其结构简单、可靠性高、使用寿命长等特点，在汽车制动系统、工业机械、制动防抱死系统以及其他领域都有广泛的应用。
膜片钳的应用使得各个领域的设备和机械能够实现安全、可靠的操作。
膜片钳技术及其发展概论
长时程增强（LTP）记录技术
（实验方法、数据分析）
刘振伟 博士
膜片钳技术实验问题答疑 膜片钳实验观摩
刘振伟 博士 刘 斌 博士
膜片钳技术及其发展概述
东乐科技有限公司
2010.8.1 南昌大学
主要内容
一、膜片钳技术的原理 二、膜片钳技术的发展历史
三、膜片钳技术的发展概况
四、膜片钳技术的仪器构成
一、膜片钳技术的原理
离子通道简介
离子通道是镶嵌在动、植物细胞膜上的一类特殊蛋白质， 它们负责转运细胞膜内外的各种离子，参与各种细胞功 能，主要包括：
维持细胞静息膜电位，产生动作电位，从而调节细胞的 兴奋性、不应性和传导性； 调节细胞内Ca2+、cAMP、cGMP等第二信使 的浓度， 触发肌肉收缩、腺体分泌、基因表达等一系列细胞生理 反应； 参与神经元的突触传递； 维持细胞的正常体积。
缓缓提起电极
在低 C中
全细胞记录模式 （Whole-cell recording）
外面向外记录模式 （Outside-out recording）
内面向外记录模式 （Inside-out recording）
膜 片 钳 技 术 的 基 本 记 录 模 式
（7）全自动膜片钳技术的崛起 传统膜片钳技术的局限 ☆每次只能记录一个细胞，是一项耗时耗力的工作 ☆不适合在药物开发初期和中期进行大量化合物的筛选 ☆不适合需要记录大量细胞的基础实验研究。 全自动膜片钳技术的出现在很大程度上解决了这些问题， 它不仅通量高，一次能记录几个甚至几十个细胞，而且记 录质量均已、稳定，此外从找细胞、形成封接、破膜等整 个实验操作实现了自动化，免除了这些操作的复杂与困难。 这些优点使得膜片钳技术的工作效率大大提高了！
膜片钳技术在各学科研究中的应用
膜片钳技术在各学科研究中的应用在神经科学领域，膜片钳技术被广泛应用于研究神经元和突触的电生理特性。
通过使用膜片钳技术，科学家可以记录神经元膜通道的电流，研究神经信号的传递和调节机制。
例如，陈教授和他的研究团队利用膜片钳技术发现了一种新的神经调节机制，他们发现了一种离子通道蛋白，可以调节神经元的兴奋性，从而对神经信号的传递产生影响1。
在细胞生物学领域，膜片钳技术被用于研究细胞的跨膜运输和信号转导机制。
科学家可以记录细胞膜通道的开放和关闭，研究物质进出细胞的方式和调控机制。
例如，张教授和他的研究团队利用膜片钳技术发现了新的钙离子通道，并研究了其在对细胞生长和凋亡的调控中的作用2。
在代谢疾病领域，膜片钳技术也被用于研究代谢过程中细胞膜通道的变化。
例如，糖尿病患者的肾小管上皮细胞钠通道存在异常，导致钠重吸收增加，从而影响血糖的排泄和代谢。
李教授和他的研究团队利用膜片钳技术发现了这一现象，为糖尿病的治疗提供了新的思路3。
膜片钳技术在各学科研究中都具有广泛的应用前景。
然而，随着科学技术的发展，膜片钳技术仍然面临着一些挑战，例如通道蛋白多样性和复杂性的问题，以及实验数据的分析和解读问题。
未来，随着膜片钳技术的不断改进和新技术的应用，我们相信这些问题会逐渐得到解决。
微光学器件在光通信、生物医学、军事等领域的应用越来越广泛。
传统的微光学器件制造技术如光刻、干法刻蚀等存在加工成本高、设备复杂等问题，难以满足某些特定场景下的制造需求。
因此，研究一种新型的微光学器件制造技术具有重要的现实意义。
气动膜片式微滴喷射制造技术作为一种具有潜力实现微光学器件高效、低成本制造的技术，逐渐受到研究者的。
气动膜片式微滴喷射制造技术基于气动学原理，通过控制气体和液体的流速、压力等参数，实现液滴的精确喷射。
该技术具有以下优点：可实现高效、低成本的制造，有望替代传统微光学器件制造技术；可通过计算机控制系统实现精确控制，提高制造精度；适用范围广，可用于各种形状和材料的光学器件制造。
膜片钳技术及其在神经科学研究中的应用
膜片钳技术及其在神经科学研究中的应用膜片钳技术是一种在神经科学研究中广泛应用的技术，它可以用来记录和操纵神经元的电活动，为研究神经系统的功能和疾病提供重要的工具。
本文将介绍膜片钳技术的原理和应用，并探讨其在神经科学研究中的重要性。
膜片钳技术是一种通过在神经元的细胞膜上形成一个微小的孔洞，并利用微电极记录神经元内外的电位差的方法。
这种技术可以精确地记录神经元的动作电位，从而了解神经元的兴奋性和抑制性。
膜片钳技术的原理基于电生理学的基本原理，即神经元的电活动是由离子通道的开关控制的。
通过在神经元膜上形成一个微小的孔洞，可以通过微电极记录到神经元内外的电位差，从而了解离子通道的开关状态和神经元的电活动。
膜片钳技术在神经科学研究中有广泛的应用。
首先，它可以用来研究神经元的膜电位和动作电位。
研究人员可以通过在神经元膜上形成一个微小的孔洞，并利用膜片钳记录到神经元内外的电位差，从而了解神经元的电活动。
这对于研究神经元的兴奋性和抑制性非常重要，有助于理解神经元的工作原理和信息传递过程。
膜片钳技术还可以用来研究离子通道的功能。
离子通道是神经元膜上的蛋白质通道，它们控制着离子在神经元膜上的通透性，从而调节神经元的电活动。
通过利用膜片钳技术，研究人员可以记录到离子通道的电流，并分析离子通道的开关状态和功能特性。
这对于研究离子通道的结构和功能非常重要，有助于揭示离子通道与神经系统功能和疾病之间的关系。
膜片钳技术还可以用来研究突触传递和突触可塑性。
突触是神经元之间的连接点，通过突触传递神经信号。
膜片钳技术可以用来记录到突触传递的电位变化，并研究突触的功能特性和可塑性。
这对于理解神经系统的信息传递和学习记忆等高级功能非常重要。
在神经科学研究中，膜片钳技术的应用还包括单细胞蛋白质表达、药物筛选和基因编辑等方面。
通过将膜片钳技术与其他技术结合，研究人员可以进一步探索神经系统的功能和疾病机制，为神经科学研究提供更加全面和深入的理解。
膜片钳技术及应用
膜片钳技术及应用膜片钳技术及应用是一种常见的力学装置，由薄膜片、夹持手柄和支撑结构组成。
膜片钳可用于夹持和固定物体，并且在广泛的领域中有着重要的应用。
下面将对膜片钳的技术原理和应用领域进行详细介绍。
膜片钳的技术原理主要基于材料的力学性质。
一般情况下，膜片钳采用弹性薄膜片作为夹持物体的夹持部分。
当施加外力使薄膜片发生形变时，薄膜片会产生力与形变量成正比的特性，这种力被称为弹性力。
通过调整薄膜片的形变程度和位置，可以达到对不同物体的夹持和固定的目的。
膜片钳的应用领域非常广泛。
以下是一些常见的应用领域：1. 医疗行业：膜片钳被广泛用于医疗器械的设计和制造。
例如，在手术中，膜片钳可以用于夹持和固定组织、血管和器官，以便医生进行手术操作。
膜片钳的特点是夹持力均匀，不会损伤组织和血管。
2. 实验室研究：膜片钳在实验室研究中也有广泛的应用。
例如，在细胞学研究中，膜片钳可以用于夹持、拉伸和操纵细胞，以研究细胞的力学特性和细胞间的相互作用。
此外，膜片钳还可以用于微流体实验中的液滴操纵和胶体粒子的固定。
3. 微机电系统（MEMS）：膜片钳是制作微机电系统中常用的工具。
在MEMS 器件制造过程中，需要对微米级物体进行精确操纵和固定。
膜片钳结构简单，加工工艺成熟，可以实现对微米级物体的夹持和固定。
4. 机械制造：膜片钳在机械制造过程中也有重要的应用。
例如，在精密加工中，膜片钳可以用于夹持和固定零件，以确保加工精度。
另外，膜片钳还可以用于装配过程中的夹持和定位。
总的来说，膜片钳技术及其应用在医疗、实验室研究、微机电系统和机械制造等领域起到了重要的作用。
膜片钳具有结构简单、操作方便、夹持力均匀等特点，使其成为一种广泛使用的力学装置。
随着科技的不断发展，膜片钳的应用领域还将不断扩大，为各个领域的科研和应用带来更多的便利和可能性。
膜片钳技术
膜片钳技术膜片钳技术80年代初发展起来的膜片钳技术(patch clamp technique)为了解生物膜离子单通道的门控动力学特征及通透性、选择性膜信息提供了最直接的手段。
该技术的兴起与应用，使人们不仅对生物体的电现象和其他生命现象更进一步的了解，而且对于疾病和药物作用的认识也不断的更新，同时还形成了许多病因学与药理学方面的新观点。
本文拟对膜片钳的基本原理及在心血管研究中的应用作一综述。
1膜片钳技术基本原理与特点膜片钳技术本质上也属于电压钳范畴，两者的区别关键在于：①膜电位固定的方法不同；②电位固定的细胞膜面积不同，进而所研究的离子通道数目不同。
电压钳技术主要是通过保持细胞跨膜电位不变，并迅速控制其数值，以观察在不同膜电位条件下膜电流情况。
因此只能用来研究整个细胞膜或一大块细胞膜上所有离子通道活动。
目前电压钳主要用于巨大细胞的全性能电流的研究，特别在分子克隆的卵母细胞表达电流的鉴定中发挥着其他技术不能替代的作用。
该技术的主要缺陷是必须在细胞内插入两个电极，对细胞损伤很大，在小细胞如中枢神经元，就难以实现，又因细胞形态复杂，很难保持细胞膜各处生物特性的一致。
膜片钳的基本原理则是利用负反馈电子线路，将微电极尖端所吸附的一个至几个平方微米的细胞膜的电位固定在一定水平上，对通过通道的微小离子电流作动态或静态观察，从而研究其功能。
膜片钳技术实现膜电流固定的关键步骤是在玻璃微电极尖端边缘与细胞膜之间形成高阻密封，其阻抗数值可达10～100 GΩ(此密封电阻是指微电极内与细胞外液之间的电阻)。
由于此阻值如此之高，故基本上可看成绝缘，其上之电流可看成零，形成高阻密封的力主要有氢健、范德华力、盐键等。
此密封不仅电学上近乎绝缘，在机械上也是较牢固的。
又由于玻璃微电极尖端管径很小，其下膜面积仅约1 μm2，在这么小的面积上离子通道数量很少，一般只有一个或几个通道，经这一个或几个通道流出的离子数量相对于整个细胞来讲很少，可以忽略，也就是说电极下的离子电流对整个细胞的静息电位的影响可以忽略，那么，只要保持电极内电位不变，则电极下的一小片细胞膜两侧的电位差就不变，从而实现电位固定。
膜片钳技术及应用
膜片钳技术的应用领域
神经科学
研究神经元离子通道与动作电 位的产生和传播，以及药物对
神经元功能影响。
心血管
研究心脏离子通道与心律失常 的关系，以及抗心律失常药物 的作用机制。
药理学
研究药物对离子通道的作用机 制和效果，以及新药的开发和 筛选。
其他领域
膜片钳技术还可应用于内分泌 、免疫等领域，研究相关细胞
利用膜片钳技术，可以研究神经元在长期和短期内的电生理变化，了 解学习、记忆等认知过程的神经机制。
药物筛选与开发中的应用
药物作用机制的研究
膜片钳技术可以用于研究药物对离子通道或受体电流的影响，从 而揭示药物的作用机制。
药物筛选
通过膜片钳技术，可以在细胞或组织水平上快速筛选出具有特定 药理作用的药物候选物。
物或其他因素对细胞膜功能的影响。
03 膜片钳技术的应用实例
神经科学研究中的应用
神经元电活动的记录
膜片钳技术可以用来记录单个神经元在静息状态和刺激下的膜电位 变化，从而研究神经元的兴奋性和电生理特性。
突触传递的研究
通过膜片钳技术，可以记录突触后电位，研究神经递质释放、受体 激活和信号转导等过程。
神经可塑性的研究
在医学诊断与治疗中的应用
疾病诊断
膜片钳技术可用于检测细胞膜离子通道的异常变化，从而对某些 疾病进行早期诊断，如癌症、神经退行性疾病等。
药物研发
通过膜片钳技术可以研究药物对离子通道的作用机制，为新药研发 提供有力支持。
个体化治疗
根据患者的离子通道基因变异情况，膜片钳技术可以为个体化治疗 提供精准的用药建议。
高通量与高灵敏度
通过改进膜片钳技术的设计和材料，有望实现高通量和高灵敏度的检测， 从而能够同时记录多个细胞或同一细胞的不同活动，提高实验的效率和 精度。
膜片钳记录和分析技术
膜片钳记录和分析技术2010-12-15 16:41 来源：美国分子仪器点击次数：232186关键词：膜片钳细胞信号分享到：・收藏夹・腾讯微博* 新浪微博« 开心网习夏细胞是动物和人体的基本组成单元，细胞与细胞内的通信，是依靠其膜上的离子通道进行的, 离子和离子通道是细胞兴奋的基础，亦即产生生物电信号的基础，生物电信号通常用电学或电子学方法进行测量。
由此形成了一门细胞学科-电生理学(electrophysiology )，即是用电生理的方法来记录和分析细胞产生电的大小和规律的科学。
早期的研究多使用双电极电压钳技术作细胞内电活动的记录。
现代膜片钳技术是在电压钳技术的基，上发展起来的1976年德国马普生物物理研究所Neher和Sakmann创建了膜片钳技术(patch clamp recording technique )。
这是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜单一的(或多个的离子通道分子活动的技术)。
以后由于吉欧姆阻抗封接(gigaohm seal, 109W)方法的确立和几种方法的创建。
这种技术点燃了细胞和分子水平的生理学研究的革命之火，它和基因克隆技术( gene cloning )并架齐驱，给生命科学研究带来了巨大的前进动力这一伟大的贡献，使Neher和Sakmann获得1991年度的诺贝尔生理学与医学奖、膜片钳技术发展历史1976年德国马普生物物理化学研究所Neher和Sakmann首次在青蛙肌细胞上用双电极钳制膜电位的同时，记录到ACh激活的单通道离子电流，从而产生了膜片钳技术。
1980年Sigworth等在记录电极内施加5-50 cmH20的负压吸引，得到10-100GW10-100G? 的高阻封接（Giga-seal ），大大降低了记录时的噪声实现了单根电极既钳制膜片电位又记录单通道电流的突破。
1981年Hamill和Neher等对该技术进行了改进，引进了膜片游离技术和全细胞记录技术，从而使该术更趋完善，具有1pA的电流灵敏度、1g m的空间分辨率和10g s的时间分辨率1983年10月，《Single-Channel Recording》一书问世，奠定了膜片钳技术的里程碑。
膜片钳技术及其应用实例
2、CdCl2和NiCl2对小鼠生精细胞Ca2+电流的作用比较
激活曲线： 分析细胞膜电位的 变化引起激活离子 通道数的变化。半 数激活电压 (-49.430.62)mV， 斜率因子 (6.050.55)mV， 在-65mV到-10mV 通道开放。
Normalizedcurentamplitude/conductane
小鼠生精细胞T型Ca2+通道复活特征
5
二、膜片钳技术
1976年 德国马普生物物理化学研究所Neher和Sakmann 在青蛙肌细胞上记录记录到ACh激活的单通道离子电流 1980年 Sigworth等用负压吸引，得到10-100GΩ的高 阻封接（Giga-seal），大大降低了记录时的噪声 1981年 Hamill和Neher等引进了膜片游离技术和全细 胞记录技术 1983年10月，《Single-Channel Recording》一书问 世，奠定了膜片钳技术的里程碑。
4、硝苯地平(nifedepine)对小鼠生精细胞T型钙电流的作用
不同浓度硝苯地平对小鼠 粗线期精母细胞T型Ca2+电 流的作用
在本试验条件下，我们记录到的小鼠生精细胞内向 电流经过通道电生理学特性和药理学特性两个角度 鉴定，证实记录到的为T型Ca2+电流，无L型Ca2+通道 电流成分。并结合精子发生特点，提示精子顶体反 应时Ca2+的内流主要由胞膜T型Ca2+通道完成。
膜片钳技术的发展及应用
膜片钳技术的发展及应用生命科学学院2010级李积锋1241410007【摘要】膜片钳技术是一种广泛应用于生命科学研究的先进电生理技术，为解决生物信息的跨膜信号传导为题提供了先进的研究手段。
膜片钳技术是在电压钳技术的基础上发展起来的,来反映细胞膜上离子通道活动的一项技术。
它对通过离子通道的离子电流进行记录,目前已发展出多种记录模式,广泛应用于神经科学、药理学、细胞生物学、生理学和分子生物学等学科领域。
概括了膜片钳技术的基本原理,归纳出该技术的主要操作步骤,并对其发展与应用进行了总结。
【关键词】膜片钳离子通道电生理1976年[1]德国马普生物物理研究所Neher和Sakmann创建了膜片钳技术。
这是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜单一的或多个的离子通道分子活动的技术。
它和基因克隆技术并架齐驱，给生命科学研究带来了巨大的前进动力。
这一伟大的贡献，使Neher和Sakmann获得1991年度的诺贝尔生理学与医学奖。
细胞是动植物和人体的基本组成单元，离子通道是细胞与外界以及与细胞内通信的重要手段。
离子和离子通道是细胞兴奋的基础，亦即产生生物电信号的基础。
生物电信号通常用电学方法进行测量，因而形成了一门学科—细胞电生理学。
最近50年，三次主要的技术革命推动了细胞电生理学的进展：细胞内记录，电压钳技术和膜片钳技术。
一．膜片钳技术发展历史1976年德国马普生物物理化学研究所Neher和Sakmann首次在青蛙肌细胞上用双电极钳制膜电位的同时，记录到ACh激活的单通道离子电流，从而产生了膜片钳技术。
1980年Sigworth等在记录电极内施加5-50 cmH2O的负压吸引，得到10-100GΩ的高阻封接，大大降低了记录时的噪声实现了单根电极既钳制膜片电位又记录单通道电流的突破。
1981年Hamill和Neher等对该技术进行了改进，引进了膜片游离技术和全细胞记录技术，从而使该技术更趋完善，具有1pA的电流灵敏度、1μm的空间分辨率和10μs 的时间分辨率。
膜片钳的基本原理与应用(+protocals)
举例 二
细胞分泌研究----电位依赖性分泌
50 p A 0 -50 -100 7.96 7.92 p F 7.88 7.84 7.80 1 s 2 3
10uM forskolin
control
举例 三
细胞分泌----离子依赖性研究 --------with FLASH technology
[Ca ]i=4.72μM R=4.3/s Amp=119.9fF
二、历史和荣誉
Sakmann, Neher et al revolutionized the field of electrophysiology in 1981 with their paper “Improved patch-clamp techniques for high resolution current recording from cells and cell- free membrane patches” (Pflügers Arch. 391, 85-100). In 1991, Neher and Sakmann were rewarded for their pioneering efforts in patch-clamp recording when they jointly won the Nobel Prize in Physiology or Medicine. Some companys have close relationship with Neher such as HEKA etc.
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蛋白运输
------利用 利用PHOTOIMAGE技术研究细胞分泌、神经传导中的蛋白运输 技术研究细胞分泌、 利用 技术研究细胞分泌 作用
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膜片钳（Patch Clamp)：在利用电压钳观测
了动作电位期间膜电导的变化之后，人们一直想搞清 楚膜电导变化的机制，当时的实验证明，离子的跨膜 流动的速度很快，膜电导又具有离子选择性，并可被 某些药物特异性地阻断，这些现象提示离子可能是通 过一些专一性的“孔道”样结构通过细胞膜的，于 是提出了“离子通道”的假设。为了证实离子通道的 存在，也为了克服电压钳的缺点，Erwin Neher和 Bert Sakmann在电压钳的基础上发明了膜片钳 （patch clamp）。并利用该技术首次在蛙肌膜上记录 到PA级(10-12A)的乙酰胆碱激动的单通道电流,首次证 明了离子通道的存在.并证明在完整细胞膜上记录到 的膜电流是许多单通道电流总和的结果。这一技术的 问世，给细胞生物学的研究带来了一场革命，被誉为 与分子克隆技术并驾齐驱的划时代的伟大发明。二人 因此而获得诺贝尔生理或医学奖。
电子学部件:放大器；计 算机接口，数据采集、分 析系统。 光学部件和光电接口：显 微镜；监视器等。 机械系统:防震台等。 辅助系统：电极拉制器； 切片机；孵育槽；灌流系 统等
电子学部件：由于膜片钳检测的是PA级的微电 流信号，因此需要特殊的放大器及模数转换器， 目前国内使用的主流放大器主要是美国AXON 公司的200B和Multiclamp700B放大器及德国 HEKA公司的EPC10放大器。 200B是电容反馈 式放大器，噪声低，适合做单通道膜片钳， Multiclamp700B和EPC10可通过软件进行操作， 自动化程度高。
(2).电流钳模式:向细胞内注入刺
激电流，记录膜电位对刺激电流的 反应。记录的是诸如动作电位， EPSP;IPSP等电压信号。
膜片钳的几种记录模式极其形成：
膜电位或膜电流
全细胞记录式
细胞贴附式 各种记录模式的形成过程
内面向外式
外面向外式
单通道电流
各种记录方式的用途及其优缺点：
膜片钳实验的基本过程：
指令电位 （Vc)
+
_
Vo
电位记录电极 （Vm)
电流注入电极 (I)
电压钳的缺点：电压钳技术目前主要用于巨大细胞的全细胞
电流研究，特别在分子克隆的卵母细胞表达电流的鉴定中发挥其它技术 不能替代的作用。但也有其致命的弱点： 1、微电极需刺破细胞膜进入细胞，以致造成细胞浆流失，破坏了细 胞生理功能的完整性； 2、不能测定单一通道电流。因为电压钳制的膜面积很大，包含着大 量随机开放和关闭着的通道，而且背景噪音大，往往掩盖了单一通道的 电流。 3、对体积小的细胞(如哺乳类中枢神经元，直径在10－30μm之间)进 行电压钳实验，技术上有更大的困难。由于电极需插入细胞，不得不将 微电极的尖端做得很细，如此细的尖端致使电极阻抗很大，常常是60～ 8OMΩ或120～150MΩ（取决于不同的充灌液）。这样大的电极阻抗 不利于作细胞内电流钳或电压钳记录时在短时间（0.1μs）内向细胞内 注入电流，达到钳制膜电压或膜电流之目的。再者，在小细胞上插入的 两根电极可产生电容而降低测量电压电极的反应能力
电压钳
都是通过钳制膜电位而记录离子通道电流
钳制方法不同
所用电极不同 钳制面积不同 记录的通道数不同
高阻封接
低阻抗电极2-15MΩ 小片膜 一个或几个
细胞内插入电极
高阻抗电极10-100MΩ 整个或大块细胞膜 所有通道
第二部分:膜片钳实验系统组成
根据实验要求，可组建不 同的实验系统。但也有一 些共同的基本组成部件， 其中包括
部位删除、添加或改变残基的序列，然后检测突变后的功能改变 。
离子通道结构研究：目前，绝大
多数离子通道的一级结构得到了阐明 ，但最根本的还是要搞清楚各种离子 通道的三维结构，在这方面，美国的 二位科学家彼得· 阿格雷和罗德里克· 麦 金农做出了一些开创性的工作，他们 利用X光绕射方法得到了K离子通道的 三维结构，二位因此获得2003年诺贝 尔化学奖。有关离子通道结构不是本 PPT的重点，可参考杨宝峰的≪离子通 道药理学≫和Hill的≪ Ionic Channels Of Excitable Membranes ≫.
第三部分：膜片钳实验基础
前面两部分介绍了膜片钳技术的原理及膜片钳的系 统组成，在此基础上本部分简要介绍： 膜片钳放大器的工作模式 膜片钳的记录方式
膜片钳实验基本过程
膜片钳记录的信息
膜片钳放大器的工作模式：
(1).电压钳模式：在钳制细胞膜
电位的基础上改变膜电位，记录离 子通道电流的变化，记录的是诸如 通道电流；EPSC;IPSC等电流信号。 是膜片钳的基本工作模式.
.
离子通道功能观察的两种技术
对离子通道功能的研究，主要采用记录离子通 道电流来间接反映离子通道功能，目前有如下 两种技术 电压钳(Voltage clamp)技术 膜片钳(patch clamp)技术
电压钳技术(Voltage Clamp)：
电压钳技术，是20世纪初由Cole发明， H明动作电位的产生机制，即 动作电
1、液体配制：主要根据研究通道的不同，配制相应的液体，基本原则是保 持两个平衡：渗透压平衡和酸碱平衡。所有液体在使用前必须过滤。 2.标本制备 3.记录
4、资料分析：
（1）一般电学性质：通过I-V关系计算单通道电导，观察通道有无整流。通 过离子选择性、翻转电位或其它通道激活条件初步确定通道类型。（2）动 力学：开放时间、开放概率、关闭时间、通道的时间依赖性失活、开放与 关闭类型（簇状猝发（Burst）样开放与闪动样短暂关闭（flickering））， 化学门控性通道的开、关速率常数等。（3）通过对全细胞激活曲线或失活 曲线的分析，可得到半数激活或失活电压Vh及斜率因子K。（4）药理学： 阻断剂、激动剂或其它调制因素对通道活动的影响。 （5）综合分析得到最 后结论。
位的峰电位是由于膜对钠的通透性发生了一过性的增 大过程。但当时没有直接测定膜通透性的方法，于是就用膜对 某种离子的电导来代表该种离子的通透性，膜电导测定的
依据是电学中的欧姆定律，如膜的 Na 电导 GNa 与电化学驱动力 （Em-ENa)和膜电流INa的关系GNa= INa/ （Em-ENa).因此可通 过测量膜电流，再利用欧姆定律来计算膜电导，但是，利用膜电 流来计算膜电导时，记录膜电流期间的膜电位必须保持不变，否 则膜电流的变化就不能代表膜电导的变化。这一条件是利用电压 钳技术实现的。下张幻灯中的右边两张图是Hodgkin和 Huxley在 半个世纪以前利用电压钳记录的抢乌贼的动作电位和动作电位过 程中的膜电流的变化图，他们的实验首次证明参与动作电位的离 子流由Na, k ,漏（Cl）三种成分组成。并对这些离子流进行了定 量分析。这一技术对阐明动作电位的本质和离子通道的的研究做 出了极大的贡献。
核心部分是一场效应管运算放 大器构成的 I-V 转换器，他的正 负输入端子为等电位。向正输 入端子施加指令电位（ Vc ）时， 经过短路负端子可使膜片等电 位，从而达到电位钳制的目的。 离子通道电流可作为 I-V 转换器 内的高阻抗反馈电阻的电压降 而被检测出。
膜片钳与电压钳的区别
膜片钳
相同点 不同点
(Neher)
(Sakmann)
膜片钳是从Patch Clamp的翻译，Patch是小片，小
块的意思，这里指膜片，这个膜片可大可小，大到 整个细胞膜，小到细胞膜上的一平方微米，Clamp是 钳，夹的意思，这里指固定，钳制的意思，指通过 将patch上的膜电位人为地控制在某一水平，或从一 个水平瞬间跃迁到另一水平，从而记录patch上的单 个离子通道或整个细胞膜上某一种类的离子通道的 电流，从而通过记录离子通道电流来反映离子通道 的功能
膜片钳（Patch Clamp)的基本原理：
利用尖端直径0.5-1um的玻璃电极吸附到 细胞膜表面，通过负压吸引使电极尖端 和细胞膜形成紧密封接，使与电极尖开 口处相接的细胞膜小片区域（patch）与 其周围在电学上绝缘，在此基础上固定 膜电位(clamp)，然后对电极尖端下面积 仅为几平方微米的细胞膜片上一个或几 个离子通道的电流进行记录。从而将电 生理学技术提高到记录和研究单个蛋白 质的分子水平
机械系统:由
于膜片钳实验 是一个微电和 微操作实验， 任何微小的震 动都会影响电 极和细胞的封 接，导致实验 的失败，因此 一台高质量的 防震台是必须 的。
辅助系统：膜片钳实验系统是一个综合性
的集成系统，除了上面提到的几大系统外， 相关的辅助系统也是必不可少的，辅助系统 的设备好坏，很大程度上左右着实验能否顺 利开展，有的实验室主要系统配臵十分主流， 而辅助系统则凑合，这将极大的影响实验， 所谓细节决定成败，用在膜片钳实验中是十 分贴切的。
如何研究离子通道
对离子通道的研究主要从结构、功能以及结构与功能的关系三方 面进行研究
1.结构研究：分子生物学方法确定蛋白质序列；X光绕射方法
确定其三维立体结构。
2. 功能研究：电生理测定通过离子通道的电流或测量细胞膜
电流或膜电位的变化，反映离子通道个体或群体的分子活动。
3.结构和功能相结合：利用基因突变技术在一级结构的特定
膜片钳技术与应用
重庆医科大学儿童医院儿研所 陈恒胜
第一部分：膜片钳基础及原理 第二部分：膜片钳实验系统组成 第三部分：膜片钳实验基础 第四部分：膜片钳的应用
细胞膜的结构和离 子通道：细胞膜由脂
质双分子层和蛋白质组 成，蛋白质又包括整合 蛋白和表面蛋白。
离子通道是一种特殊的膜蛋白，它横跨整个 膜结构，是细胞内部与部外联系的桥梁和细 胞内外物质交换的孔道，当通道开放时，细 胞内外的一些无机离子如Na,k Ca 等带电离 子可经通道顺浓度梯度或电位梯度进行跨膜 扩散，从而形成这些带电离子在膜内外的不 同分布态势，这种态势和在不同状态下的动 态变化是可兴奋细胞静息电位和动作电位的 基础。这些无机离子通过离子通道的进出所 产生的电活动是生命活动的基础，只有在此 基础上才可能有腺体分泌、肌肉收缩、基因 表达、新陈代谢等生命活动。离子通道结构 和功能障碍决定了许多疾病的发生和发展。 因此，了解离子通道的结构、功能以及结构 与功能的关系对于从分子水平深入探讨某些 疾病的病理生理机制、发现特异性治疗药物 或措施等均具有十分重要的理论和实际意义.