蜂蜜掺假鉴别技术的研究进展与对策建议

蜂蜜掺假鉴别技术的研究进展与对策建议
袁玉伟，张志恒，叶雪珠，杨桂玲，孙彩霞，于国光
(浙江省农业科学院农产品质量标准研究所，浙江 杭州 310021)
摘 要：蜂蜜掺假是蜂蜜质量安全管理和消费者普遍关心的问题，也影响到蜂蜜产品的出口贸易。

本文介绍了蜂蜜掺假的基本特点和几种鉴别蜂蜜掺假的检测技术，分析认为稳定性碳同位素比值、近红外光谱、色谱技术、酶活性检测、显微镜检、差示扫描量热法和旋光法具有不同的检测特点和适用范围。

基于一种方法难以确证蜂蜜掺假的问题，提出加强多种方法联合检测技术、混合蜂蜜确证技术和构建蜂密产品溯源与指纹图谱库的建议，以保障蜂密产品的质量安全。

关键词：蜂蜜；掺假；检测；鉴别；质量安全
Research Progress in the Detection of Honey Adulteration
YUAN Yu-wei ，ZHANG Zhi-heng ，YE Xue-zhu ，YANG Gui-ling ，SUN Cai-xia ，YU Guo-guang
(Institute of Quality and Standards for Agricultural Products, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, China)
Abstract ：The adulteration of honey is generally concerned by consumers and management departments of safety and quality.The adulteration of honey also affects the export of honey trade. In this paper, some basic characteristics and detection methods of honey adulteration has been reviewed. Stable carbon isotopic ratio technology, near-infrared spectroscopy, chromatogram analysis, enzymatic activity detection, microscopic analysis, differential scanning calorimetry and optical rotation detection were discussed based on their specialties and application ranges. Combinatorial detection methods for honey adulteration were proposed to identify the mixture of honey and set up a traceability system or fingerprint data for honey products, which may be important to ensure safety and quality of honey.
Key words ：honey ；adulteration ；detection technology ；discrimination method ；safety and quality
中图分类号：S896.8 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2010)09-0318-05
收稿日期：2009-09-03
基金项目：农业部科技发展中心项目(2009R19A24C01)
作者简介：袁玉伟(1975—)，男，助理研究员，博士，研究方向为农产品质量安全与法规。

E-mail ：y wy tea@163.co m
中国是蜂蜜生产、消费和出口大国，蜂蜜富含多种营养物质，风味独特，极具保健作用和营养价值，是国内消费和出口贸易的重要农产品之一。

据国家统计局统计，2008年蜂蜜产量在35万t 以上，比2007年增加了10%左右，其中2008年的出口量在8.5万t ，而国内市场的需求量也在20万t 左右。

蜂蜜价格相对较高，产量难以满足市场需求，且种类繁多，成分复杂，很容易造假掺假；而鉴别耗时费力，技术难度大。

因此，蜂蜜中面临的主要质量安全问题就是药物残留超标和掺假造假，而后者占据了蜂蜜市场的20%～30%，有些地区掺假造假的蜂产品占50%左右[1]。

陈兰珍等[2]检测蜂蜜中C4植物糖含量，发现71个样品中掺假蜂蜜有44个，掺假比例高达62%。

美国FDA 于2008年11月19日发出掺假蜂蜜预警，要求对所有国家进口的蜂蜜进行13C/12C 的同位素比值测定，对于掺假蜂蜜进行自动扣留[3]。

因此，蜂蜜的掺假和造假已经影响到蜂蜜产业的健康发展、出口贸易创汇和消费者的权益保护，需要加强对蜂蜜掺假与真伪鉴别技术的研究。

本文对近年来不同的鉴别技术进行综述分析，提出了加强蜂蜜真伪鉴别技术研究的建议。

１蜂蜜掺假的基本方式与检测特点1.1
掺假基本方式
蜂蜜中主要含有葡萄糖和果糖，含量在65%以上，其中果糖含量在30.91%～44.26%，葡萄糖含量在22.89%～40.75%，果糖与葡萄糖比在0.76～1.86，如此大的变化范围，给鉴别和检测蜂蜜掺假问题带来一定的困难[4]。

常见的掺假物有蔗糖、葡萄糖、果葡糖浆、人工转化糖、淀粉、食盐、饴糖(俗称糖稀)、羧甲基
纤维素钠(CMC-Na)、色素和香精等，主要起到增稠、添色、加香等作用。

蜂蜜掺假引起蜂蜜的安全质量问题造成消费者权益受损和出口贸易受阻。

但是通过常规检测方法很难在感官指标和部分理化指标区分天然蜂蜜和掺假蜂蜜，单凭执行国家标准(GB18796—2005《蜂蜜》)也难以分别其真假[5]。

1.2掺假蜂蜜的检测特点
针对蜂蜜中不同的掺假物所造成蜂蜜某些物化性质的改变，采用相应的检测技术。

如果添加C4植物糖如玉米糖浆和甘蔗糖浆，造成蜂蜜中13C/12C的改变，采用稳定性碳同位素检测技术；由于掺假造成淀粉酶活性的降低，则通过酶活性测定来确定是否掺假；由于纯蜂蜜具有一定特征的近红外光谱和旋光性，掺假后造成光谱位置和特征的改变可以通过近红外光谱仪测定，而旋光性的变化可以通过旋光法测定；掺假蜂蜜中热量特征如玻璃化温度(T g)发生改变，可以通过差示扫描量热法测定。

如果蜂蜜的物理特征发生改变，如掺假蔗糖时常造成蜂蜜中含有甘蔗细胞碎片，可以通过显微镜检法确定；或者通过色谱法测定蜂蜜中糖组分的指纹图谱或添加糖分含量的变化来鉴别蜂蜜掺假与否。

值得注意的是没有一种方法可以完全保证对蜂蜜真伪鉴别结果的准确性，因为蜂蜜本身含有复杂的化学成分，而且化学成分含量也有很大的变化范围，这需要几种方法共同分析以提高鉴别结果的准确性。

２蜂蜜真伪鉴别的检测技术进展
2.1稳定性碳同位素比值(13C/12C)法
由于C3和C4植物中碳循环途径不同，稳定性碳同位素在植物中的分馏程度不同，造成植株中13C/12C不同(用δ13C表示)，一般情况下C3植物的δ13C值在－21‰～－32‰之间；而C4植物的δ13C值在－12‰～－19‰之间。

如蜂蜜中δ13C值低于－23.5‰，一般认为蜂蜜中可能掺入C4植物源的糖分，如果糖、葡萄糖等。

稳定性碳同位素比值检测法可以测定蜂蜜中掺入C4植物源的糖分，但对于掺入的转化糖分(人造甜味剂等)或者C3植物的糖分就很难区分开来。

后来又采用蜂蜜的δ13C值与蛋白质的δ13C值的差值(Δδ13C)来判断蜂蜜掺假与否，如果Δδ13C值高于1‰，则认为最小掺假量为7%。

Padovan等[6]利用13C/12C测定商品蜂蜜的掺假，根据掺入的蔗糖溶液和高果糖浆(HFCs)来确定方法检测限。

结果表明C4植物源蔗糖的δ13C值在－11.82‰～－11.78‰，而HFCs的δ13C值在－9.7‰～－9.78‰；如果掺入1%～10%的蔗糖糖浆，掺假蜂蜜与其蛋白质的Δδ13C值都小于1‰，从判断结果来看仍被认为是“合格”纯蜂蜜；而加入20%、50%和90%的HFCs时，Δδ13C值都大于1‰，判断为不合格产品。

这说明掺入不同糖分对Δδ13C值的影响不同，采用稳定性碳同位素比值法甄别蜂蜜掺假与否仍存在技术上的漏洞。

Elflein等[7]采用耦合元素分析仪/液相色谱和同位素比值质谱法(EA/LC-IRMS)分析蜂蜜中C3和C4植物源转化的糖浆，改进了传统的δ13C和Δδ13C测定法。

传统的LC-IRMS法的检测限分别为1%的C4糖和10%的C3糖，即使采用传统的Δδ13C判定，C3-C4混合糖和C3糖掺假时不容易检出；而采用EA/LC-IRMS法测定蜂蜜中不同糖分的δ13C 和糖分之间的Δδ13C，确定合适范围，可以进一步降低C4糖的检测限，如能将转化糖的检测限从AOAC法的27%降低到EA/LC-IRMS法的8%，还能够检测出蜂蜜中掺入C3糖(大米糖浆)。

2.2近红外光谱法
近红外光谱法是利用蜂蜜中有机化合物的含氢基官能团X—H键对波长为780nm～2500nm具有特征吸收，如不同基团的吸收频谱位置和强度不同，结合统计分析和建立模型对特征组分进行定性和定量分析。

Downey 等[8]利用近红外光谱进行蜂蜜掺有果糖和葡萄糖的分析，掺假果糖和葡萄糖的比例分别为0.7:1、1.2:1和2.3:1，采用κ-NN(κ-最邻近分类法)、SIMCA(软独立建模分类法)和判别偏最小二乘法DPLS进行建模判定分析。

结果表明，κ-NN法分析适合每一组中样品数量不对称时较为敏感，真样品的假阴性率为12%，而假样品的假阳性率为2.67%；SIMCA分析4个主成分，针对未掺假蜂蜜的特征模型确定了全部的25个真样品，而掺假蜂蜜样品尚未全部确定；DPLS分析适合用于未掺假蜂蜜和掺假量在7%以内的假蜂蜜判定，真蜂蜜的分辨率为96%，而假蜂蜜的分辨率高达99%。

陈兰珍等[2]提出一种用傅里叶变换近红外光谱结合DPLS快速鉴别蜂蜜真伪的新方法，首先采集27个纯蜂蜜和44个掺假蜂蜜的近红外光谱数据，然后5次随机划分建模集样本和验证集样本，并对建模样本进行不同光谱预处理，选择并优化不同波段范围和主成分数量，用DPLS法建立了5组蜂蜜样本的真伪鉴别模型，5组校正模型中真蜂蜜和掺假蜂蜜的总体识别准确率分别为91.49%、94.68%、92.98%、93.86%、94.87%；预测样本的识别准确率为86.96%～93.75%，假蜂蜜的识别率高于真蜂蜜的识别率，这与真蜂蜜样本的数据量少有关系。

2.3色谱分析法
色谱分析法是针对蜂蜜中不同糖组分或掺假组分进行分离检测，可以是单组分检测也可以是多组分的指纹图谱分析。

张存洁等[9]利用高效液相色谱法(HPLC)测定蜂蜜中高果糖浆(HFS)，该法根据蜂蜜和HFS中高寡糖不同，通过活性炭-硅藻土层析柱分离、浓缩后，采用HPLC示差检测器测定，C3植物的HFS(大米和甘薯)最低检测限可以达到2.5%，线性范围在2.5%～30%，弥
补了传统AOAC法只能测定掺假10%的C4植物HFS的不足。

Cordella等[10]采用高效离子交换色谱-脉冲安培检测器(HPAEC-PAD)分析植物源蜂蜜的糖分特征，改变了以往采用单一组分分析，采用新的化学计量法同时分析主要和次要糖分，以及每种蜂蜜中糖分的总色谱图，来描述不同植物源蜂蜜(槐花蜜、薰衣草花蜜、迷迭香蜜、枞树蜜、栗子蜜和T T F多花蜜)的指纹图谱。

同时采用数学法将原始数据进行数据矩阵构建，采用主成分分析(PC A)、线性区别分析(LD A)和人工神经网络(ANN)来区分不同蜂蜜特征数据，其中LDA和ANN能很好的区分蜂蜜类别，鉴别准确率为93%和100%。

由于玉米淀粉转换为玉米糖浆时，多聚糖不容易被酶水解转化，糖浆中存在少量多聚糖，而真蜂蜜中多聚糖很难检出或数量很低，可以将多聚糖作为标记物来鉴别蜂蜜是否掺假。

Megherbi等[11]采用HPAEC-PAD分析蜂蜜中添加玉米糖浆，将样品采用反相固相萃取去除单糖和少量低聚糖(DP3～6)，浓缩多聚糖(DP11～17)后进行检测，该方法可以检测出蜂蜜中掺入1%的玉米糖浆量。

2.4淀粉酶活性测定
蜂蜜中淀粉酶的活性受到贮存温度、时间和所添加物性质的影响，例如随着贮存温度和时间的升高和延长，淀粉酶的活性降低；添加蔗糖和淀粉也会造成天然蜂蜜中淀粉酶的含量降低，而添加的诺维信耐温淀粉酶(Supra-Termamyl(r) Supra)却不受温度和时间的影响，这给利用淀粉酶活性测定蜂蜜是否掺假带来一定的难度。

李军生等[12]研究储存温度和时间对蜂蜜淀粉酶值和蛋白质含量的影响，发现在高温(37、45℃)下储存，天然蜂蜜的淀粉酶(DN)值和蛋白质的含量逐渐下降，而假蜂蜜中的淀粉酶值(诺维信耐温淀粉酶)和蛋白质的含量基本不变；通过测定蜂蜜淀粉酶值和蛋白质含量的变化可以用于鉴别真假蜂蜜。

这种方法需要定期检测蜂蜜中蛋白质含量和淀粉酶活性变化才能验证蜂蜜真伪，虽然简单，但比较费时。

而纳文娟等[13]利用淀粉酶活性变化测定蜂蜜中添加的蔗糖和淀粉，由于掺入的蔗糖和淀粉转化为还原糖时需要消耗淀粉酶，造成DN值降低。

添加5%和10%的蔗糖，DN吸光度达到0.235的时间分别为60、68min；而添加5%和10%的淀粉，所需时间分别是70、74min。

不同蜂蜜中淀粉酶活性差异大，例如槐花蜜的淀粉酶活性可以达到17.9mL/(g・h)，高于国家标准8.0mL/(g・h)，单纯依靠酶活性测定很容易出现假阳性和假阴性结果。

2.5显微镜检验法
借助显微镜观察蜂蜜中存在的淀粉粒、花粉和蔗糖碎片(薄壁细胞、单细胞环和表皮细胞)数量、特征，来判断蜂蜜的质量、来源和掺假与否。

纯天然蜂蜜中也存在少量淀粉颗粒，但掺入饴糖或淀粉转化糖就可能存在大量淀粉颗粒，淀粉率的高低是蜂蜜品质的标志之一。

陈光哲等[14]采用显微镜法观察碘液染色的蜂蜜沉淀物，显蓝色的规则或不规则的颗粒为淀粉粒，每个视野内最好为8～10个。

颜伟玉等[15]采用显微镜观察醋酸酐分解法处理的蜂蜜，观察蜂蜜中的花粉数量和形态来鉴别蜂蜜的纯度与种类，发现芝麻蜜的花粉百分含量为74%，荞麦蜜的花粉含量为85%；如果蜂蜜中不含有花粉，则说明不是纯正蜂蜜，从花粉的形态可以判断蜂蜜的种类。

Kerkvliet等[16]利用显微镜法检测蜂蜜中掺假的蔗糖、酸水解甘蔗糖浆或饲喂蜜蜂的糖，添加的蔗糖具有很多特征颗粒如来自甘蔗茎的薄壁细胞(50～100μm)、石细胞(长100～200μm)、表皮细胞、环细胞(直径30～50μm)和甘蔗淀粉粒，先采用化学数据分析发现10个样品中全部或部分掺假，至少是经过加热；而采用显微镜检分析表明所有数据都掺假，虽然甘蔗片碎片和蔗糖含量直接没有显著的相关性，但有8个样品中含有大量蔗糖碎片和HMF，因此镜检扫描可以作为辅助手段来检测蜂蜜中添加的少量蔗糖、转化糖浆和饲喂蜜蜂的糖。

Kerkvliet等[17]利用显微扫描分析蜂蜜中掺假蔗糖的薄壁细胞、单细胞环和表皮细胞，每10g 样品中含有的去核薄壁细胞大约3000～30000个，石细胞和单细胞环的数量大约是几百个；显微扫描法和δ13C 检测法存在一定的相关性，薄壁细胞及石细胞的掺假率和δ13C检测法的相关性r=0.776，而表皮细胞数的相关性是0.6。

通过该法可以检测蔗糖的掺假限量为1%，如果10g样品中含有150个薄壁细胞和石细胞或者10个单环细胞，则掺假程度超过7%；需要指出的是该法不能用于玉米糖浆的掺假检测。

镜检法虽然简单便于操作，但往往需要良好的专业基础知识和规范的前处理技术，而且工业糖浆中可以过滤减少掺假蔗糖中的细胞碎片，给镜检法扫描蔗糖掺假带来一定难度，可以将镜检法作为蜂蜜掺假与否的辅助检测手段。

2.6差示扫描量热法(DSC)
DSC是根据纯蜂蜜和掺假糖浆具有不同的热力学特征，一是测定掺假蜂蜜的热力学特征参数，如玻璃化温度(T g)、熔化焓(ΔH)和比热容(ΔC p)具有不同的温度范围，分别是－45～－39℃、40～90℃和(100～200)℃～(180～220)℃；二是测定蜂蜜掺假后所造成热力学特征参数如温度范围的振幅和位点的变化，来判断其是否掺假。

Cordella等[18]采用DSC测定了甜菜糖浆、甘蔗糖浆、糖类代用品等掺假物，以及槐花蜜、薰衣草花蜜和枞树蜜的热力学特征曲线，发现纯花蜜和糖浆的T g差值大于10℃，如蜂蜜掺有甘蔗糖浆和甜菜糖浆则T g发生明显移位，可以利用T g变化来区分花蜜和糖浆；而甘蔗糖浆和甜菜糖浆的T g为(－33.0±2)℃，枞树蜜的T g 为(－37.5±0.3)℃，则很难采用T g区分糖浆和枞树蜜
露。

另外ΔH不适合区分不同蜜源的蜜，而糖浆具有很大ΔH3，可以综合ΔH2和T g来区分蜂蜜和糖浆；基于糖浆的类型，方法检出限为5%～10%，但对于糖类代用品掺假则不易检出。

2.7旋光法检验
不同种类的蜂蜜一般都具有稳定的旋光性，大多数为左旋，由于掺入不同旋光性的糖分，旋光度发生变化，甚至左旋变为右旋。

史琦云等[19]采用旋光法检验蜂蜜中掺入的糖类，测定16种蜂蜜掺入4种糖类(饴糖、蔗糖、果糖和转化糖)后旋光度的变化，发现加入澄清剂醋酸铅对蜂蜜的旋光度影响不显著，16种蜂蜜中具有右旋光性的有沙枣蜜、荞麦蜜和野茴香蜜，其余的均具有左旋光性；旋光度发生改变与掺入糖的类别和浓度有关，掺入饴糖和蔗糖的蜂蜜旋光度发生右旋变化，而掺入果糖后蜂蜜发生左旋趋势。

通过建立不同掺假糖类浓度与旋光度变化的回归方程，可以判定蜂蜜的真伪与掺假的浓度。

该方法简单易行，但是容易受到样品的pH值和测定条件稳定性的影响。

３加强蜂蜜真伪鉴别研究的建议
3.1联合多种检测方法确证蜂蜜掺假
随着蜂蜜中掺假糖分的来源多样，造假技术也越来越复杂。

很难通过单一的检测技术来保证检测结果的准确性，例如单纯依靠检测蜂蜜中δ13C和蜂蜜与蛋白质间的Δδ13C很难判断蜂蜜是否掺假，应该开展多组分间的Δδ13C检测，甚至考虑是否引入其他稳定性同位素如15N、18O、2H等；将色谱技术与碳同位素检测、近红外光谱分析技术联合，构建多组分分析的δ13C范围和近红外光谱特征库；如Simuth等[20]先采用化学法分离和确证蜂蜜中蜂王浆(RJ)蛋白，采用蛋白质印迹分析(Western Blotting)化学免疫法检测真蜂蜜中的蜂王浆蛋白质，并确认蜂毒明肽-1和蜂毒明肽-2是主要的蜂王浆蛋白组分，该实验步骤比较繁琐，如采用试纸条方式快速检测这些特征蛋白将是一种值得研究的方法。

3.2亟需加强对混合蜂蜜的确证技术研究
由于不同蜂蜜的价格不同，消费者对蜂蜜种类的喜好不同。

企业采用不同种类蜂蜜的混配，混淆标识要求，提高蜂蜜价格。

从某种意义上虽然没有掺入外源的糖分造成蜂产品伪劣，但在一定程度上也存在假冒问题，消费者权益受到侵害。

由于单纯依靠稳定性碳同位素检测技术很难区分，而且不同蜂蜜的近红外光谱特征和旋光性也类似，单纯依靠显微镜检法不能有效确定掺假蜜中添加外源花粉，因此，建议加强对不同蜂蜜混合的鉴别技术研究。

如采用显微镜检法快速确定蜂蜜中的花粉特征，再结合感官评价和主成分分析来区分不同植物源花蜜。

Tewari等[21]采用中红外检测和主成分分析与人工神经网络分析处理数据，能有效识别苜蓿蜜、荞麦蜜和椴树蜜等植物源花蜜，并构建了蜂蜜品种预测模型。

3.3构建并完善蜂产品的溯源体系和指纹图谱库
我国蜂蜜的产地多样、蜜源种类繁多，单纯依靠分析检测技术很难辨认蜂蜜的真伪。

从管理层面上构建蜂产品的溯源体系，全程监管蜂蜜产品的去向，动态跟踪不同地域、季节和时间蜂产品的分布，规范蜂蜜准入和标识制度，减少掺假蜂蜜问题发生后的追溯难题。

通过不同蜂蜜产品中稳定性同位素(2H、13C、15N、18O)、光谱、色谱和理化指标的系统测定，确定不同产地和植物源蜂蜜的稳定性同位素的比值范围，以及红外光谱和色谱测定的光谱特征和组分谱图，甚至是测定其理化指标，从而研究不同蜂蜜种类、添加组分和混合后特征变化规律，并采用计算机辅助识别技术构建数据模型，预测掺假蜂蜜的类别和特征。

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