β-葡聚糖酶

植物β－1，3－葡聚糖酶的研究进展

β-1,3-葡聚糖酶参与了植物的多种生长发育过程，包括细胞分裂、小孢子发生、花粉萌发、育性、韧皮部胼胝质去除、受精、种子萌芽及植物生长调控等过程。20世纪70年代以前，对β-1,3-葡聚糖酶的研究主要集中于它对植物本身不同发育阶段的作用，随着分子生物学技术在植物抗病基因工程中的逐步应用，β-1,3-葡聚糖酶基因的抗病研究取得了快速发展。目前，β-1,3-葡聚糖酶基因在植物抗病基因工程研究中已被认为是最具吸引力的基因之一。

1 β-1,3-葡聚糖酶基本生物学特性和分类

已知的β-1,3-葡聚糖酶均属于糖基水解酶第十七家族，其成员具有共同的氨基酸序列结构：(LIVM)一x一(LIVM-FVW)3一(STAG)-E-(ST)-G- W-P-(Srr)-X-G．(Lan等，1998)，β-1,3-葡聚糖酶分为外切酶和内切酶，目前主要研究的是内切酶。它的分子量为32-37kD，等电点从酸性到碱性。它的作用底物为以β-1,3-苷键连接起来的多聚糖，以随机作用方式将多聚糖分解成为糊精或寡聚糖。各种类型的β

-1,3-葡聚糖酶已从多种植物中分离出来。根据其等电点、定位、mRNA表达模式及序列的同源性等特点可将其分为四种不同类型。I类葡聚糖酶为碱性，主要存在于液泡中，体外具较强抑菌活性。碱性β-1,3-葡聚糖酶通常具有1个液泡定位的羧基末端多肽(carboxyl terminal polypetide，CTPP)结构，CTPP中往往含有糖基化位点即CTPP切除信号氨基酸结构， CTPP的缺乏使得β-l,3-葡聚糖酶分泌到胞外，因此，CTPP存在与否成为β-1,3-葡聚糖酶分类的重要依据。现已分离出三种编码I类葡聚糖酶的cDNA，它的前体蛋白含有N一端信号肽及C一端液泡导向肽序列。在根及老叶中组成型表达．占可溶性蛋白的5％-10％，且主要分布在叶的表皮细胞层中。受病源菌、乙烯、水杨酸、伤口、UV等因素诱导，但被auxin ／cytokine所抑制，并受发育的调节。Ⅱ类葡聚糖酶具有较低等电点，被称为酸性葡聚糖酶。主要分布在细胞间隙，在体外无抑菌活性，它的氨基酸序列中不具有C一端延伸序列。与I类酶有55％同源性，但Ⅱ类酶与I类酶在血清学上具有相似性。它主要包括PR2(又称PR-36)。PR-N，PR-O(又称PR-37)，能被病原菌诱导，I类葡聚糖酶与Ⅱ类葡聚糖酶相比．只有54％~59％的同源性。Ⅲ类酶属于分布在胞外的诱导物释放型β-1,3-葡聚糖酶(PR-Q’)，分子量为35KD(又称PR-35)。PR-Q’由烟草花叶病毒(TMV)诱导表达，其诱导速度慢于或相同于Ⅱ类葡聚糖酶，持续时间也较短嘲。Ⅳ类葡聚糖酶为酸性胞外非诱导型β-1,3-葡聚糖酶(PR-O’)，分子量为25KD,是一种二聚体，不能被病原物诱导㈣。与Ⅱ类、Ⅲ类酶相似性较小，且与前三种酶均不能发生抗血清交叉反应。

2 β-1,3-葡聚糖酶抗病机制研究

植物受病原物侵染时常产生一些PR蛋白进行抵御，β-1,3-葡聚糖酶即是其中之一。PR类蛋白是由植物寄主基因编码的、在病理或相关条件下诱导产生的蛋白质,PR类蛋白与植物系统获得性抗性fSystemic acquired resistence,SARl和系统诱导性抗性fInduced Systemic Resistance ISRl的建立密切相关。根据蛋白质之间氨基酸序列的相似程度，目前已经发现的PR蛋白可分为十一类，β-1,3-葡聚糖酶属于PR2类，在植物的抗病过程中扮演着重要角色。β-1,3-葡聚糖是真菌细胞壁的重要结构成分。许多真菌的菌丝尖端β-1,3-葡聚糖暴露在表面，能够直接受到β-1,3-葡聚糖酶的攻击。体外抑菌实验表明，β-1,3-葡聚糖酶对菌丝生长具有抑制作用。不过，只有液泡定位的碱性葡聚糖酶能够降解菌丝壁，从而抑制生长，而胞间定位的类型则没有抑菌活性。当然，真菌也合成一些葡聚糖酶抑制蛋白fGlucanase Inhibitor Protein RIPl，RIP特异性地抑制寄主内源葡聚糖酶的活性旧，这反映了植物与微生物共进

化的一种关系。更为重要的是，在水解过程中由真菌细胞壁释放出来的寡糖能够作为植物多种抗病反应的激发因子。激发子作为病原菌——植物相互识别的重要信号分子，是指能诱导植物产生任何防卫反应的因子fHahn 1996)。杜良成和王钧(1992)的研究已证实病菌来源的激发子可诱导植物B-1,3-葡聚糖酶不同程度的表达。SA作为一种非生物激发子，可诱导植物PR基因表达。被用于PR基因启动子的调控机制研究ffShah和 Klessig，1996)。激发子和SA诱导植物的全面抗病反应，可作为诱导物诱导与抗病反应有关的酶类如苯丙氨酸解氨酶(PAL)、4一香豆酸-CoA联结酶)等的积累，由此对植保素、木质素等抗病物质的合成与积累，增强植物的抗病性起促进作用。这方面的报道集中在大豆与大豆疫病菌的互作研究中。在大豆中，已经发现葡聚糖激发子结合蛋白GEBP fGlucan Elicitor Binding Protein GEBP)，定位于大豆根部细胞的质膜上，能够特异性地结合β-1,3-葡聚糖酶降解过程中释放出来的寡糖激发子，诱导植物的防卫反应。

3 β－l,3-葡聚糖酶在植物中的发育调节及其可诱导性

β-1,3-葡聚糖酶是重要的水解酶，它们不仅在植物抗病中起作用，还在植物发育中起作用，包括谷类发芽、胚轴和胚芽鞘发育、韧皮部运输和胼胝质的运动、微管组织运输调节和细胞壁生物合成、花的发育、小孢子形成、花粉管发育、果实成熟、植物衰老以及固定和愈创性葡聚糖的清除以及调控胚乳发育、育性调控及种子后成熟．也用于研究转化体基因沉默现象等方面。这些不同的发育过程均与β-1,3一葡聚糖酶有密切关系， Leubner Metzger等利用反义基因技术揭示了3-1,3-葡聚糖酶在打破烟草种子休眠中所起的重要作用。Stieglitz(1977)在研究Lilium的小孢子发育过程中发现，β-1,3-葡聚糖酶在小孢子从四分体状态释放出来之前有一个增长的峰值。随后小孢子的胼胝质壁被溶解，释放出成熟的花粉类。已证实此过程中内切葡聚糖酶起关键作用。但此酶在小孢子成熟之前如何被准确诱导的机理还不清楚。将修饰过的β-1,3-葡聚糖酶导人烟草中使其在绒毡层中提前表达，使转基因植株育性降低。而在牵牛及高粱体中一些雄性不育突变体中发现是因为葡聚糖酶在小孢子发育过程中提前释放．从而造成小孢子发育异常。Van de Rhee(1993)对碱性葡聚糖酶5’调控序列的研究表明：在1476b0的启动子序列中，1476至44bp之间的片段对发育调控的表达是必需的。

在正常植物体中葡聚糖酶在整株植物中的分布是不均衡的，根部和基部老叶中含有很高的酶活性，而顶部幼叶中几乎检测不到，究其原因，可能是由于发育调节或激素对它的控制作用。Felix(1985)研究认为，组织培养中，烟草中一种特异的内切β-1,3-葡聚糖酶受到生长素和分裂素的调节。当两种激素同时加人培养基时，90％的酶活性被抑制，而当从前者培养基移人加有一种激素或不加激素的培养基时，此酶的表达量到第七天时比前者增加了约10倍。Eichholz(1983)认为是激动素(kinetin)阻碍了B-1,3-葡聚糖酶的重新合成p回。 Felix(1986)则认为阻碍β-1,3-葡聚糖酶的合成并不是激动素独立作用的结果，而是由于分裂素和生长素两者生理浓度共同决定。

β-1,3-葡聚糖酶基因的表达不仅与病原菌侵染有关，还与其他生物或非生物诱导物有关。非生物诱导包括物理因素和化学因素。1987年Dean R．A．发现，机械或干冰损伤、电磁处理可不同程度地诱导烟草对霜霉病(Peronosporatabacina)的抗性；紫外线处理各种豆类的下胚轴可使植株叶片获得对炭疽病fColletotrichumlinderthianum)的抗性。后来陆续报道X一射线、局部热处理等也具有诱导抗病性的功能。已有100多种化学物质被用作诱导因子，较早使用的是乙酰水杨酸钠、多聚腺苷酸等，可以诱发烟草对TMV的抗性，由此形成了20世纪70-80年代对诱导抗性研究的第一个热潮。董汉松等在烟草抗赤星病的研究中建立了诱导因子谱，同时也发现有诱导感病性的化学物质，如马来酰肼等，表明感病性也和抗病性一样，可以由不同的物质诱导产生。生物诱导包括：(1)真菌。这类因子包括病原和非病原菌、致病力不同的菌株及其不同结构和分子组分，前人已有不少综述。在烟草抗赤星病诱导中，已从全国各烟区分离的209个赤星菌株中选出致病力弱的菌株用作诱导因子，并已成功地用于大田试验，取得良好效果。(2)细菌。可用作诱导因子的细菌包括死体和活体，病原细菌和非病原细菌及细菌的不同成分，如菌