微生物检验操作规程

盛年不重来，一日难再晨。及时宜自勉，岁月不待人。微生物检验操作规程

1. 目的

建立微生物检验标准操作规程，保证检验操作规范化。

2. 范围

适用于本公司相关的微生物检验活动的全过程。

3. 职责

3.1 微生物检验员负责微生物检验的全过程；

3.2 QC主管负责监督检查本规程的有效实施。

4. 操作规程

4.1 微生物检验玻璃器皿吸管的洗涤

4.1.1 一般的玻璃器皿（例如培养皿、试管、三角瓶等），可用毛刷及洗涤剂洗去灰尘、油垢，然后用自来水、蒸馏水充分冲洗，直至玻璃器皿内壁均匀分布一层薄的水膜，即器壁既不挂水珠也无条纹，即洗涤达到标准。

4.1.2 玻璃器皿内有污迹不能洗净时，可浸泡于洗液中，待器皿中有机物氧化分解后，取出用自来水、蒸馏水冲洗干净，备用。

4.1.3 新购的玻璃器皿先用2％盐酸浸泡，再用用自来水、蒸馏水充分冲洗。

4.2 器皿的包扎

4.2.1 试管：塞上胶塞，然后用牛皮纸或报纸把试管头包扎起来。做发酵试验时，将试管头塞上专用的耐高温PVC试管帽。

4.2.2 三角瓶、抽滤瓶：将三角瓶（抽滤瓶）口塞上胶塞，然后用牛皮纸把塞头部包起来。

4.2.3 吸管：将耐高温的移液枪头装盒，用用牛皮纸或报纸包裹。

4.2.4 平皿：10个为一组，用牛皮纸包裹。

4.3消毒和灭菌：

4.3.1 化学灭菌：此法适用于微生物操作过程中不能加热、紫外线的地方。如人手等。

（1）用75%的乙醇溶液或0.1%新洁尔灭擦拭或浸泡。

（2）一般用1～2%的甲醛液浸泡软管和用具。

（3）一般成品漂白粉的有效成分是25～32% 。使用时配成有效成份的2%溶液洒在地面或容器内，（对金属有腐蚀作用）放置10～15min后冲洗即可。

（4）氯灭菌剂的能力以有效氯表示，将氯水配制成50～100PPm 的有效氯溶液，可用于浸泡，冲洗和表面杀菌。但氯对金属有腐蚀作用。

4.3.2 物理灭菌：

4.3.2.1 干热灭菌：适用于干燥的玻璃器皿（吸管、平皿等）、金属器具（镊子等）、固体试液、液状石蜡等。灭菌条件一般选用在160℃干热空气灭菌2h。

（1）器具用牛皮纸或灭菌袋包（装）扎，放入金属容器内。

（2）器具在干燥箱加热前放入，每个器具之间留有足够的空隙，使热

空气能畅通。

（3）关闭箱门接通电源，打开通气孔，使箱内湿空气能逸出，至箱内温度达到100℃时关闭。（4）加热至160℃，保持2小时。

（5）切断电源，冷却至60℃时，打开箱门，取出灭菌器具，并打开箱顶通气口。

注：灭菌时必须注意温度不能超过180℃，以免使棉花、报纸烘焦；灭菌时不得打开箱门；干燥箱未冷却时，不要取出里面器具，防止内外温差过大造成玻璃器具爆炸

璃器具爆炸。

4.3.2.2 湿热灭菌：适用于容器、培养基、无菌衣、胶塞以及其他遇高温和潮湿不发生变化或损伤的物品。详见《压力蒸汽灭菌器操作规程》。

（1）装入培养基的瓶用胶塞盖上，再用牛皮纸包扎。

（2）瓶中的培养液不要超过1L，否则灭菌不彻底。

（3）容器的上部应留有足够的空间（一般不超过装量的2/3），以便产生气泡。

（4）器具用牛皮纸包裹。

（5）器具的组合和包裹应允许灭菌蒸汽接触所用物品。

（6）各类器具装入灭菌器时，相互间要留有空隙以使蒸汽自由流动。

4.4 无菌操作的准备工作及注意事项

4.4.1 微生物室应定期按《微生物实验室管理规程》清洁。

4.4.2 微生物室使用前，应先打开紫外灯灭菌20～30min。

4.4.3 微生物室应备有专用剪刀、镊子、接种针，每次使用前后应灭菌消毒。

4.4.4 微生物室应备有75%酒精棉球；新洁尔灭消毒液内浸纱布数块，备用。

4.4.5 进入微生物，换专用鞋，穿好洁净服，离室时脱去洁净服和专用鞋，洁净服和专用鞋只准在微生物室内使用，不准穿到其它地方去，并定期洗换和消毒灭菌。

4.4.6 样品检验前应在原始记录本上记录名称、批号等内容，并在所用平皿或试管上详细记录样品序号、检验日期等内容。

4.4.7 无菌操作前，用75%的酒精棉球擦手。

4.4.8 操作要正确迅速，所用的器皿均应是经过严格灭菌的器皿。

4.4.9 检验完毕，立即清理工作台，弃去不需要物品，打开紫外灯灭菌20～30min。

4.5 微生物检验用培养基、溶液的配制、使用与储存

配制方法参见培养基说明书或检验标准项下规定配制。

4.5.1 水：电导率在25℃时不超过25μs/cm，除非另有规定要求。

4.5.2 称重和溶解：

保存培养基的时间需视培养基中水份蒸发的程度及有无污染而定，已制备好的培养基要保存于冰箱中。在冰箱中存放的培养基在使用前要先置于室温30min，使其与室温一致再使用，因为气体的溶解度可因温度上升而降低，特别是乳糖胆盐发酵管内的倒管会因温度上升而出现气泡，这一点必须注意。

4.5.3 pH 的测定和调整：

用pH计测pH，必要时在灭菌前进行调整，除特殊说明外，培养基灭菌后冷却至25℃时，pH应在标准pH±0.2范围内。一般使用浓度约为40g/L（约1mol/L）的氢氧化钠溶液或浓度约为36.5 g/L（约1mol/L）的盐酸溶液调整培养基的pH。

4.5.4 分装：将配好的培养基分装到适当的容器中，容器的体积应比培养基体积最少大20%。

4.5.6 培养基的使用：

经过高压的培养基应尽量减少重新加热时间，融化后避免过度加热。融化后应短暂置于室温中（如2 min）以避免玻璃瓶破碎。

融化后的培养基放入47℃～50℃的恒温水浴锅中冷却保温，且应尽快使用，放置时间一般不应超过4 h。未用完的培养基不能重新凝固留待下次使用。敏感的培养基尤应注意，融化后保温时间应尽量缩短，如有特定要求可参考指定的标准。

4.5.7平板的制备和储存

倾注融化的培养基到平皿中，使之在平皿中形成厚度至少为3 mm（直径90 mm的平皿，通常要加入18 mL～20 mL琼脂培养基）。将平皿盖好皿盖后放到水平平面使琼脂冷却凝固。如果平板需储存，或者培养时间超过48h或培养温度高于40℃，则需要倾注更多的培养基。凝固后的培养基应立即使用或存放于暗处和（或）5℃±3℃冰箱的密封袋中，以防止培养基成分的改变。在平板底部或侧边做好标记，标记的内容包括名称、制备日期和（或）有效期。也可使用适宜的培养基编码系统进行标记。

将倒好的平板放在密封的袋子中冷藏保存可延长储存期限。为了避免冷凝水的产生，平板应冷却后再装入袋中。储存前不要对培养基表面进行干燥处理。

对于采用表面接种形式培养的固体培养基，应先对琼脂表面进行干燥：揭开平皿盖，将平板倒扣于烘箱或培养箱中（温度设为25℃～50℃）；或放在有对流的无菌净化台中，直到培养基表面的水滴消失为止。注意不要过度干燥。商品化的平板琼脂培养基应按照厂商提供的说明使用。

4.6 检验方法

做样前，将灭菌好的吸管、培养皿等放入操作台上，操作台、微生物室紫外线灭菌30min，然后关紫外线灭菌灯，开启净风循环30min后开始做样。

详见附录各检测方法

附录1 菌落总数测定

附录2 霉菌和酵母计数