膜片钳实验技术入门---基本原理与操作

膜片钳实验技术入门------基本原理与操作

关兵才 李国华 刘理望

按：本文乃于2003年根据较旧型号的仪器写成，后被《机能实验科学》 （郑先科主编，北大医学版，2006）收入。因新旧仪器基本原理和操作步骤大同小异，现对原文略作修改和标注，供同学们参考。

【实验目的】

1. 了解膜片钳技术的基本原理和操作。

2. 初步学习电压依赖性离子通道电流的基本记录方法。

【实验原理】

一、膜片钳技术原理简介

膜片钳(patch clamp)是一种主要用于检测细胞膜离子通道活动的电生理技术，按工作方式可区分为电压钳(voltage clamp)和电流钳是最基本的工作方式，即对细胞膜电位进行人为控制，如将膜电位钳制于某一固定水平，或在此基础上再施以阶跃(step)式或斜坡式(ramp)电压刺激，同时记录跨膜电流，从而分析细胞膜通道的活动。电流钳即人为控制经微电极对细胞进行注射的电流（等于离子通道电流与细胞膜电容电流之和），同时记录膜电位及其变化。若注射电流为零即常用的零位钳流，用于测量细胞膜静息电位，若注射方波脉冲刺激电流，用于诱发、观测动作电位。另外，膜片钳技术还常用于观测细胞膜电容, 从而推测分泌细胞的活动情况。下面主要介绍其电压钳工作方式的基本原理。（注：在电生理资料中，因通常将细胞外液和记录系统的“地”点相连作为参考点即零电位点，所以电位和电压两个概念经常混用。）

根据膜片钳实验中受检细胞膜的型式（configuration）不同，又可将膜片钳分为全细胞式(whole-cell)、细胞贴附式(cell-attached 或on-cell)、内面朝外式(inside-out)、外面朝外式(outside-out)等四种模式。

(一)全细胞式

1．电压钳制和电流记录的实现

图9-9为全细胞式膜片钳工作原理示意图。

图9-9 全细胞膜片钳实验原理示意图

A1：运算放大器；A2：单倍增益差动放大器；R f：反馈电阻；V p：电极电位（A1反向输入端电位）；

V c：A1同向输入端电位；C in：输入端杂散电容；C p：电极电容；Rs：串联电阻；C m：细胞膜电容；R m：细胞膜电阻；E m：细胞膜内在电位(指钳压时的细胞膜诸通道状态决定的内在Goldman-Hodgkin-Katz平衡电位)；V o：A2输出端电位；V-offset：偏移电位补偿电位；C c：用于电容补偿的电容；V c(app)：表观钳制

电压即欲施加于受试膜片的电压；图中⊕和表示求和电路

将充有电解质溶液的玻璃微电极（glass microelectrode或 recording pipette）利用负压紧密吸附于细胞表面，形成吉欧即千兆欧（109Ω）级高阻封接，进一步对微电极内施加负压、将

放大器（以下简称运放）A1在深度负反馈工作状态下的“虚短路（virtual short circuit）”原理实现，即只要A1工作于线性范围内，其反向输入端的电位V p总是等于同向输入端的电位V c，这两个输入端之间虽非短路却类似于短路。因此，只要人为对V c予以控制，则V p总是“跟随”V c而变，使V p=V c(严格讲并不一定完全相等，多数情况下二者十分接近，其差异对于研究细胞膜电生理而言完全可以忽略)。该“虚短路”现象，实质是由于A1对两个输入端间出现的电位差高度敏感，V p和V c之间欲出现明显差异时（如跨膜离子流动引起V p变化时，或人为改变V c时），通过负反馈电阻R f迅速对反相输入端“补充”或“卸除”电荷来调节V p，使之总与V c十分接近或相等。图中A2为单倍增益差动放大器，其输出端电位V o等于两输入端电位之差。结合运放A1的“虚短路”原理和单倍增益差动放大器A2的工作特点，可得：

V1 = V p-IR f = V c-IR f

V o = (V1-V c) ×1= (V c-IR f )-V c = -IR f

其中I为流经反馈电阻R f的电流，另据运放的“虚断路(virtual open circuit)”原理，即通过其两个输入端进入或流出运放的电流极小，类似断路，若各种补偿调节完成后，则跨膜电流基本上等于流经R f的电流I。可见，A1、R f和A2构成一个“电流-电压转换器(current-voltage converter)”，将跨膜电流在A2的输出端以电位V o（= -IR f）的形式测得。

2．参数的补偿

为了使膜电位的钳制准确而快速地实现，并使输出信号较好地反映离子通道的电流，需进行多种参数补偿，下面只介绍和实验操作密切相关的几种：

(1) 电容补偿(capacitance compensation)：在监视细胞封接、破膜过程以及研究电压门控离子通道的特性时，须在V c端施加阶跃电压刺激，如常用的方波电压刺激，即先后施加两个方向相反的阶跃刺激。只要有电位的阶跃，由于微电极、放大器输入端及其间的连接等均可造成对地“杂散电容(stray capacitance)”而产生时间常数短的“快电容充放电电流”；在全细胞模式又因细胞膜电容(membrane capacitance)的存在而出现时间常数较大的“慢电容充放电电流”（有些放大器在参数设计名称上有异，详见下面的注释）。这些电容电流既非我们欲记录的信号，且其作为电流伪迹会对一些快电流信号（如钠电流）的记录产生干扰，此外还有可能使放大器饱和（即超出放大器的线性工作范围使记录结果失真），故需将其从放大器输出端信号中消除。补偿的原理为在运放A1的反向输入端接一电容C c，电容另一端接由方波刺激电压驱动的指数电位发生电路（exponential voltage generator），调节此电路的增益和时间常数，使其向C c注射的电流和欲消除的电容电流同步性对等补偿，这相当于将电容电流“引流”到C c支路，从而不再因流经R f而在输出端体现。

(2) 串联电阻补偿(series resistance compensation)：因为电极尖端直径小，而且在全细胞模式时有细胞膜残片阻挡在电极口处，故有数兆乃至十余兆的电阻值，因此电阻与全细胞