糖化酶的生产流程设计方案说明

糖化酶的生产流程设计方案

糖化酶即葡萄糖淀粉酶(1 ,4 - α- 葡聚糖葡聚糖水解酶, EC. 3. 2. 1. 3) ,是淀粉糖化工艺的主要酶类,被广泛地应用于食品、医药、发酵等工业。目前,糖化酶的生产菌种主要为

黑曲霉。根据使用的生产菌种不同及发酵工艺不同,工业

生产中,糖化酶的发酵生产水平在35 000～55 000UPmL 不等。糖化酶的工业化生产从过去的固体发酵沿革到上世纪90 年

代初,液体发酵工艺逐步取代了原固体发酵工艺。液体发酵

工艺的建立与应用极大地改善了发酵产品质量并大幅度提升

了糖化酶的发酵生产水平。但现有糖化酶发酵生产技术共同

存在不足之处,其中种子制备周期和发酵生产周期很长是一

个较突出的问题,如实验室的种子制备需要15d 以上,发酵周

期通常200h 以上。

生产流程图

一、试验菌种的分纯

1、培养基

（1）固体培养基，察氏培养基+1％酵母膏+1％蛋白胨；（2）初筛培养基，玉米粉：麸皮：米糠：硫酸胺=7:3:2:0.16 （3）诱变后培养基，玉米粉：麸皮：米糠：硫酸胺=8：3:1.5:2:0.16，水80ml。

（2）原料：玉米粉、麸皮等

（3）菌种分纯

将麸皮采集菌种取出一部分，置入装有10mL生理盐水和若干玻璃珠的小三角瓶内，振荡15分钟，将上清液一次稀释成10-1、10-2、10-3，各取0.1mL做平板划线，29℃培养5~6天，分别挑取单个菌落接入斜面，29℃培养一周。

以大连某厂的生产用菌B-11为对照，对分离菌株做摇床发酵试验，96h后测定糖化力，配合镜检，确定诱变的出发菌株。

二、试验菌株的诱变

用生理盐水洗下成熟出发株的孢子、倒入5mL麦汁种1％酵母膏的三角瓶中，振荡1.5h，使孢子活化，后3500r/min.离心分离15分钟，用pH7.2磷酸缓冲液洗涤一次，再用缓冲液5ML洗转入小三角瓶内（内有数枚无菌玻璃珠），振荡10分钟，使孢子分散均匀，过滤，制成单孢子悬浮液，将浓度调至106个/ml

取10ml孢子悬浮液于9cm平板中，紫外线（UV）照射诱变2分钟（避光操作），紫外线动率15W，室温，搅拌，照射距离30cm。

向经紫外线处理的菌液中加入硫酸二乙酯（DES）稀液（原液

1ml，95％乙醇4ml配制）0.1ml，32℃恒温处理15分钟，不断摇动平皿，处理后立即稀释至10-2、10-3（中止反应），各取0.1~0.2ml 涂平板，29℃培养5天后挑取单菌接入试管。

摇床发酵试验，优选出糖化力高的新菌株UD-7等。

三、糖化酶的制备

(一)材料：菌种：黑曲霉

仪器：恒温培养箱离心机水浴锅恒温液体振荡

培养器小型液体发酵罐分光光度计等

试剂：链霉素0．1％苯甲酸钠乳酸氢氧化钠硫酸

铵等

（二）设备

LRH-250 型生化培养箱上海一恒科技有限公司；

TGL-16C 型台式高速离心机上海安亭科学仪器厂；

1086型精密水浴锅德国GFL公司；HYG-II型迴转式恒

温调速摇瓶机上海新星自动化控制设备成套厂；UV-

2100 型紫外分光光度计 UNICO(上海)仪器公司；LS-

350L 型立式压力蒸气灭菌锅上海医用核子仪器厂；

MP2000D 型电子天平精科仪器(上海)有限公司；DG-

2B 多功能恒温箱上海医疗器械修造厂；超净工作台

苏净集团安泰公司。

(三)方法

液体深层发酵

工艺流程：试管斜面菌种一种子扩大培养一液体深

层通风发酵一过滤一离心一干燥一粗酶制剂一酶活测定配方：斜面种子培养基：蔗糖30g硫酸铵3g磷酸

氢钾lg硫酸镁0．5g硫酸铁0．Olg水1000ml琼脂2％

液体摇瓶扩大培养基：玉米面4％。豆饼粉3％

麦麸1％ Kel O．5g水lO00ml 自然PI-I通风

恒温液体深层通风发酵培养基：玉米粉10％豆饼

粉4％麦麸l％水lO00ml PH4．5

1．粗酶提取

发酵液一过滤一盐析一固形物一烘干一加入淀粉添

充剂一磨粉一粗酶制剂。

2．酶活力测定

酶活力测定方法

(一)钢圈法：5ml 3％琼脂倒皿一再加5ml

可溶性淀粉与3％琼脂一放入三个灭过菌的钢圈分

别滴人不同浓度的酶液一定期测定透明圈直径。(二)比色法：lOml 20％可溶性淀粉 5ml柠

檬酸PH4．8 (对照不加酶液。处理加lm1) 加lml

10％NaOH终止反应，对照补加lml酶液一滤纸过渡一

比色。

四、结果与分析

（一）结果

1．钢圈实验结果如下表：

2．DNS测定结果如下表

(二)分析

用液体深层发酵生产糖化酶，由于黑曲霉具很强的抗污染力，生产力强，易培养，所以菌种培养条件一般很好控制，不会受到污染，而发酵条件难以控制。这正是提高酶活的关键。据中科院研究认为，酶的形成时刻与培养时间无关，而与培养基的PH变化有关，只有当PH从3．0回升时才能开始检测出酶活力，PH回升到4．5以后酶开始大量形成。

五、包装与保存

（一）保存

将用容器装好的食品级糖化酶放入钴源辐照室的某一位置，根据该位置剂量率的大小，来确定辐照时间，使吸收剂量控制在１０００－１００００戈瑞之间。辐照后的糖化酶制剂放在２５℃以下的温度条件下贮藏一年，活性保存率仍在９０％以上，该发明使食品级糖化酶不需加工成粉剂贮存，而是直接贮存，以备使用。

（二）包装

用无毒塑料桶和纸箱包装