蛋白质含量测定法PPT课件

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根据表4，以A280为纵坐标，SBA浓 度为横坐标，作图4。
0.7
0.6
0.5
表1 考马斯亮兰标准法实验表格
管号
1
2
3
4
5
6
7
8
标准蛋白质 （1.03mg/ml） 0 0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10
9
10
未知蛋白质 （约0.5mg/ml）
0.04 0.08 0.10
蒸馏水
考马斯亮兰 G-250试剂
0.1 0.09 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0.06 0.02 0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
根据表3，以A595为纵坐标，SDS浓度为 横坐标，作图3。
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图3 考马斯亮兰SDS干扰实验
A595
考马斯亮兰SDS干扰实验图
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
SDS浓度
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由上图可以看出，十二烷基硫酸钠(SDS)对 考马斯亮兰法测蛋白质含量有干扰，同是 0.103mg/ml的标准蛋白与3.0ml考马斯亮兰， 但随着SDS浓度的增加，其混合液的595nm 处的吸收峰逐渐降低，而后有一小段回升， 最后趋于渐近线。
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SDS干扰实验
取5支试管，分别编号后按表1-5剂量依次 加入标准蛋白、SDS、去离子水和考马斯 亮兰染料。每支试管加完后，立即在漩涡 混合器上混合。
加完染料20min后，使用753分光光度计 （狭缝4），塑料比色皿，在595nm处测量 吸光度A595。
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实验数据与结果分析
标准方法的数据和图
图1 考马斯亮兰标准法
y = 6.1884x + 0.2287 R 2 = 0.9942
0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12
标准蛋白质量/（μg）
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微量法的数据和图
表2 考马斯亮兰微量法实验表格
管号12345678910标准蛋白质（0.103mg/ml） 00.10.20.40.60.81.0未知蛋白质（约0.5mg/ml） 0.40.81.0蒸馏水1.00.90.80.60.40.200.60.20 考马斯亮兰G-250试剂 3.03.03.03.03.03.03.03.03.03.0对应的吸光度 A59500.0880.1840.2920.4110.5420.6310.171 0.2890.362
的多少成正比。可以测238nm处吸收值，通过标准曲线法 来测定蛋白质稀溶液的浓度。
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[器材与试剂]
（一） 器材 1．SPECORD200分光光度计 2．漩涡混合器 3．试管12支 （二） 试剂 标准蛋白质溶液，用牛血清清蛋白（BSA），
配制成1.03mg/ml。
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[实验数据与结果分析]
根据表2，以A595为纵坐标，标准蛋白质量/ （μg）为横坐标，作图2。
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图2 考马斯亮兰微量法
A595
0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1
0 0
图2 考马斯亮兰微量法
y = 6.0579x + 0.0305 R 2 = 0.9919
0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 标准蛋白质量/（μg）
（一）紫外280nm吸收法数据和图
表4 紫外280nm光吸收法
管号123456BSA (1.03mg/ml)体积 01.02.03.04.05.0H2O5.04.03.02.01.00BSA 浓度（mg/ml） 00.2060.4120.6180.8241.03A28000.1580. 2700.3790.5140.645
考马斯亮兰G-250染料试剂：称100mg考马 斯亮兰，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入 120ml 85% 的磷酸，用水稀释至1升。
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实验方法
标准方法
取10支试管，分别编号后按 表1-1 剂量依 次加入标准蛋白（或未知蛋白）、去离子 水和考马斯亮兰染料。每支试管加完后， 立即在漩涡混合器上混合。
蛋白质含量测定法
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考马斯亮兰法（Bradford法）
实验原理 考马斯亮蓝G-250染料+碱性芳香族氨基酸 在磷酸的作用下，最大吸收为595nm(兰色）
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器材与试剂
722型和753型可见光分光光度计
漩涡混合器
试管16支
标准蛋白质溶液，用牛血清清蛋白（BSA）， 配制成1.03mg/ml和0.103mg/ml。
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SDS干扰数据和图
表3 考马斯亮兰SDS干扰实验表格
管号123456标准蛋白质（1.03mg/ml） 0.10.10.10.10.10.1SDS (1mg/ml)00.10.20.40.60.8蒸馏水 0.90.80.70.50.30.1考马斯亮兰G-250试 剂3.03.03.03.03.03.0对应的吸光度 A5950.4230.3360.2750.2000.2130.198
对应的吸光度 A595
0.200 0.311 0.362 0.483 0.624 0.752 0.845 0.387 0.501
根据表1，以A595为纵坐标，标准蛋白质. 量/（μg）为横坐标，作图1。
0.572
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图1 考马斯亮兰标准法
A595
1 0.8 0.6 0.4 0.2
0 0
图1 考马斯亮兰标准法
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紫外吸收法
[实验原理]
280nm的光吸收法：蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和 色氨酸在280nm处有最大吸收。
215nm与225nm的吸收差法：蛋白质因为含量低而不能使
用280nm的光吸收测定时，可用215nm与225nm吸收值之 差，通过标准曲线法来测定蛋白质稀溶液的浓度。
肽键测定法：蛋白质溶液在238处的光吸收强弱，与肽键
加完染料20min后，使用722分光光度计 （灵敏度4），塑料比色皿，在595nm处测 量吸光度A595。
用标准蛋白浓度（mg/ml）为横坐标，用
A595为纵坐标，进行直线拟合，得到标准
曲线。根据测得的未知样品的A595，查表
即可求得未知样品. 的蛋白质含量。
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微量法
取10支试管，分别编号后按 表1-3 剂量依 次加入稀释的标准蛋白（或未知蛋白）、 去离子水和考马斯亮兰染料。其他步骤同 上，不过使用753分光光度计（狭缝4）。