蛋白质含量测定法PPT课件
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《蛋白质的测定》PPT课件
选择蒸馏时间四—五分钟，自 动完成蒸馏；
滴定，计算氮及蛋白含量。
计算公式
WcV0.014F100 m
W—蛋白质的质量分数，%； c—盐酸规范液的浓度，mol/L； V—试剂滴定耗费规范液量，mL； m—样质量量，g； 0.014—氮的毫摩尔质量，g/mmol； F—蛋白质系数，6.25。
三、微量凯氏定氮法
原理与常量凯氏定氮法一样
设备安装
步骤
采样〔固体采样、液体采样〕 样品预处置 样品分析 样品数据处置 撰写分析报告
2NH2(CH)2COOH ＋ 13H2SO4 ＝ (NH4)2SO4 ＋ 6CO2 ＋ 12SO2 ＋ 16H2O
2NaOH＋ (NH4)2SO4＝ 2NH3↓＋ Na2SO4 ＋ 2H2O
2NH3 + 4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O
(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3
2、仪器和试剂
① 500ml凯氏烧瓶
② 定氮蒸馏安装
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
硫酸铜 ；
硫酸钾；
硫酸；
40g∕L硼酸溶液：
混合指示剂：〔国标〕1g∕L甲基红乙醇溶液与1g∕L 甲基蓝乙醇溶液，临用时按2：1的比例混合。
或者1g∕L甲基红乙醇溶液与1g∕L溴
甲酚绿乙醇溶液，临用时按1：5的比例混合；
400g∕L氢氧化钠；
蛋白质的测定
一、测定食品中蛋白质含量的意义 二、常量凯氏定氮法 三、微量凯氏定氮法 四、自动凯氏定氮仪
一、概述
〔一〕测定意义 1、蛋白质作为三大供能物质，是食品的重要
营养目的。 2、人体组织的构成成分。 3、构成体内各种重要物质 4、蛋白质不是越多越好〔添加肾负担，骨质
滴定，计算氮及蛋白含量。
计算公式
WcV0.014F100 m
W—蛋白质的质量分数，%； c—盐酸规范液的浓度，mol/L； V—试剂滴定耗费规范液量，mL； m—样质量量，g； 0.014—氮的毫摩尔质量，g/mmol； F—蛋白质系数，6.25。
三、微量凯氏定氮法
原理与常量凯氏定氮法一样
设备安装
步骤
采样〔固体采样、液体采样〕 样品预处置 样品分析 样品数据处置 撰写分析报告
2NH2(CH)2COOH ＋ 13H2SO4 ＝ (NH4)2SO4 ＋ 6CO2 ＋ 12SO2 ＋ 16H2O
2NaOH＋ (NH4)2SO4＝ 2NH3↓＋ Na2SO4 ＋ 2H2O
2NH3 + 4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O
(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3
2、仪器和试剂
① 500ml凯氏烧瓶
② 定氮蒸馏安装
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
硫酸铜 ；
硫酸钾；
硫酸；
40g∕L硼酸溶液：
混合指示剂：〔国标〕1g∕L甲基红乙醇溶液与1g∕L 甲基蓝乙醇溶液，临用时按2：1的比例混合。
或者1g∕L甲基红乙醇溶液与1g∕L溴
甲酚绿乙醇溶液，临用时按1：5的比例混合；
400g∕L氢氧化钠；
蛋白质的测定
一、测定食品中蛋白质含量的意义 二、常量凯氏定氮法 三、微量凯氏定氮法 四、自动凯氏定氮仪
一、概述
〔一〕测定意义 1、蛋白质作为三大供能物质，是食品的重要
营养目的。 2、人体组织的构成成分。 3、构成体内各种重要物质 4、蛋白质不是越多越好〔添加肾负担，骨质
血清蛋白质含量的测定ppt课件
4.在浓度小于100g/L时呈良好的线性关系。
蛋白质规范液浓度
血清总蛋白含量=浓度X稀释倍数
得
血清总蛋白含量=〔A测/A标〕X蛋白质规范液浓度X稀释倍 数
临床意义
19
1.清总蛋白增高： ①血液浓缩：腹泻、呕吐等。 ②合成添加：如多发性骨髓瘤等。 2.清总蛋白降低： ①血液稀释：过多注射低渗溶液，各种缘由 引起的水钠潴留。 ②摄入量缺乏和耗费添加：营养不良、慢性 肠胃炎、严重结核病等。 ③合成妨碍：肝脏疾病。 ④蛋白质丧失：严重烧伤时大量血浆渗出， 肾综合症等。
No.3 血清总蛋白含量的测1 定
by:煜.明.奇.婷.远
2
实验目的
1. 熟习血清总蛋白的测定方法〔双缩脲法〕
2. 掌握血清总蛋白测定的临床意义
血清总蛋白
3
血清蛋白
球蛋白 白蛋白
35~50g/L 20~40g/L
4
蛋白质含量测定的几种方法
5
6
凯氏定氮法〔图〕
凯氏定氮法
浓硫酸
样品中的有机氮
可求得蛋白质的量。
留意！
13
1.双缩脲反响并非是蛋白质特有的颜色 反响！
2.凡分子内含有2个或2个以上甲酰基氨 基〔-CONH2-〕 均可呈双缩脲反响。
如： 3HCCONH
NHCOCH3
14
实验试剂
1.生理盐水：NaCl 0.9g 溶于100ml蒸馏水
2.双缩脲试剂：硫酸铜 3.0g溶于500ml蒸馏 水，加酒石酸钾钠9.0g,碘化钾5.0g，完全 溶解后，参与24%NaOH100ml，用蒸馏水 稀释到1L，置聚氯乙烯瓶内盖紧保管。
无机铵盐 +OH-
催化剂
7
NH3
蛋白质含量的测定方法.PPT-
内容一般包括样品名称、送检单位、生产日期 及批号、取样时间、检验日期、检验项目、检验结 果、报告日期、检验员签字、主管负责人签字、检 验单位盖章等。
国家食品检验工职业鉴定
一、食品检验工的职业定义 使用检测设备，用抽样检查方式对粮油及制品、糕点糖
果、乳及乳制品、白酒、果酒、黄酒、啤酒、饮料、罐头食 品、肉蛋及制品、调味品、酱腌制品、茶叶等各类食品的感 官、理化、卫生及食品内包装材料等指标进行检验的人员 二、食品检验工的职业技能鉴定
二、检测结果的表示 1. 固体试样 固体试样中待测组分的含量，一般以质量分数（%）表示 当
待测组分含量很低时，可采用mg·kg-1 、μg·kg-1 表示
2. 液体试样 常用单位是 mol·L-1 、mg·L-1 、mol·kg -1
检测报告的编制
一、原始记录
原始记录必须真实、齐全、清楚，记录方式应 简单明了；原始记录本应统一编号、专用，用钢笔 或圆珠笔填写，不得任意涂改、撕页、散失；原始 记录应统一管理，归档保存，以备查验 二、检验报告
第一章 农产品检测基础
·农产品质量与检测
一、农产品的分类 在农业活动中获得的植物、动物、微生物及其
产品称为农产品，可分为食品原料类（如谷类农作 物的种子、果蔬产品、畜禽及其产品、水产等）和 非食品原料类（如棉、麻、丝、草等） 二、农产品的营养
食品原料类农产品的营养成分通常分为碳水化合 物、蛋白质和氨基酸、脂肪、维生素、有机酸、水 分及矿物元素
农产品中脂肪的检测
二、油脂酸价的测定 酸价是反映油脂质量的主要技术指标之一。
测定方法：热乙醇测定法，即试样溶解在热乙醇中， 用氢氧化钾或氢氧化钠水溶液滴定。
三、油脂碘价的测定 碘价的高低表示油脂中脂肪酸的不饱和程度。测
国家食品检验工职业鉴定
一、食品检验工的职业定义 使用检测设备，用抽样检查方式对粮油及制品、糕点糖
果、乳及乳制品、白酒、果酒、黄酒、啤酒、饮料、罐头食 品、肉蛋及制品、调味品、酱腌制品、茶叶等各类食品的感 官、理化、卫生及食品内包装材料等指标进行检验的人员 二、食品检验工的职业技能鉴定
二、检测结果的表示 1. 固体试样 固体试样中待测组分的含量，一般以质量分数（%）表示 当
待测组分含量很低时，可采用mg·kg-1 、μg·kg-1 表示
2. 液体试样 常用单位是 mol·L-1 、mg·L-1 、mol·kg -1
检测报告的编制
一、原始记录
原始记录必须真实、齐全、清楚，记录方式应 简单明了；原始记录本应统一编号、专用，用钢笔 或圆珠笔填写，不得任意涂改、撕页、散失；原始 记录应统一管理，归档保存，以备查验 二、检验报告
第一章 农产品检测基础
·农产品质量与检测
一、农产品的分类 在农业活动中获得的植物、动物、微生物及其
产品称为农产品，可分为食品原料类（如谷类农作 物的种子、果蔬产品、畜禽及其产品、水产等）和 非食品原料类（如棉、麻、丝、草等） 二、农产品的营养
食品原料类农产品的营养成分通常分为碳水化合 物、蛋白质和氨基酸、脂肪、维生素、有机酸、水 分及矿物元素
农产品中脂肪的检测
二、油脂酸价的测定 酸价是反映油脂质量的主要技术指标之一。
测定方法：热乙醇测定法，即试样溶解在热乙醇中， 用氢氧化钾或氢氧化钠水溶液滴定。
三、油脂碘价的测定 碘价的高低表示油脂中脂肪酸的不饱和程度。测
蛋白质的测定课件参考.ppt
1.装水至 2/3 容积 处，加甲 基橙数滴 及硫酸数 毫升以保 持酸性
4.NaOH 溶液
4.5.6 5.水洗漏 步操 斗数次 作要 6.夹好漏斗 迅速 夹，水封。
2.管下端 插入液面 下(瓶内先 装硼酸液 及混合指 示剂2滴)
7.水蒸气蒸馏至指示剂变绿色 开始计时，蒸馏10min，将管
8.吸收液用0.01000mol/L HCl标准溶液滴定至
总蛋白质含量 氨基酸组成 蛋白质的营养价值
精选课件
2
5、蛋白质的测定方法
利用蛋白质共性的方法
凯氏定氮法 杜马斯法
福林酚法
利用特定氨基酸残基法
染色法
精选课件
3
第二节 蛋白质的定性测定
一、蛋白质的一般显色反应
电泳或纸层析之后用一些染料与蛋白质结合并 变色。书中列举了 5 种染料。
二、复合蛋白质的显色反应
第一节 概述
1.蛋白质的元素组成（The elements of protein）
▪ C：50-55% N：15-18% O：20-23%
▪ H：6-8% S：0-4%
▪ 微量元素：P、Fe、Zn、Cu
2、基本结构单位：氨基酸
3、蛋白质的变性作用。
精选课件
1
4、蛋白质分析的重要性
▪ 生物活性测定 ▪ 功能性质调查 ▪ 营养标签
精选课件
17
操作方法
▪ 1、制作标准曲线 取10支干试管分成两组，按下表平行操作：
0ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
1
2
3
4
标准蛋白液/ml
0.2 0.4 0.6 0.8
蛋白浓度 /(mg/ml)
2.0 4.0 6.0 8.0
蒸馏水/ml
4.NaOH 溶液
4.5.6 5.水洗漏 步操 斗数次 作要 6.夹好漏斗 迅速 夹，水封。
2.管下端 插入液面 下(瓶内先 装硼酸液 及混合指 示剂2滴)
7.水蒸气蒸馏至指示剂变绿色 开始计时，蒸馏10min，将管
8.吸收液用0.01000mol/L HCl标准溶液滴定至
总蛋白质含量 氨基酸组成 蛋白质的营养价值
精选课件
2
5、蛋白质的测定方法
利用蛋白质共性的方法
凯氏定氮法 杜马斯法
福林酚法
利用特定氨基酸残基法
染色法
精选课件
3
第二节 蛋白质的定性测定
一、蛋白质的一般显色反应
电泳或纸层析之后用一些染料与蛋白质结合并 变色。书中列举了 5 种染料。
二、复合蛋白质的显色反应
第一节 概述
1.蛋白质的元素组成（The elements of protein）
▪ C：50-55% N：15-18% O：20-23%
▪ H：6-8% S：0-4%
▪ 微量元素：P、Fe、Zn、Cu
2、基本结构单位：氨基酸
3、蛋白质的变性作用。
精选课件
1
4、蛋白质分析的重要性
▪ 生物活性测定 ▪ 功能性质调查 ▪ 营养标签
精选课件
17
操作方法
▪ 1、制作标准曲线 取10支干试管分成两组，按下表平行操作：
0ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
1
2
3
4
标准蛋白液/ml
0.2 0.4 0.6 0.8
蛋白浓度 /(mg/ml)
2.0 4.0 6.0 8.0
蒸馏水/ml
蛋白质的定量测定方法PPT课件
以光密度为纵座标，标准蛋白溶液浓度为横座标，绘 制出标准曲线。
2.测定未知样品
取样品溶液4毫升,加蒸馏水4mL混匀，在280nm下 测定其光密度值。
【实验结果】
根据样品溶液的光密度值，在绘制好的标准曲线图中 查出样品溶液的蛋白质含量。
第8页/共24页
【实验目的】
三、微量凯氏定氮法
学习凯氏定氮法的原理和操作技术。
蛋白质染料复合物具有很高的吸光值，因此大大提高了蛋白质测定 的灵敏度，最低检出量为1μg蛋白。染料与蛋白质结合迅速，大约为2 分钟，结合物的颜色在1小时内稳定。所以本法操作简便，快速，灵敏 度 高 ， 稳 定 性 好 ， 是 一 种 测 定 蛋第白20质页/含共量24页的 常 用 方 法 。
【实验材料】
2. 测定未知样品：取2支试管，分别准确吸取1毫升样品溶液，各加
5毫升Fo1in酚试剂甲，摇匀，室温放置10分钟后，再各加1毫升 Fo1in酚试剂乙，立即摇匀，放置30分钟，在500nm处测定光密度值 。
【实验结果】
根据未知样品溶液的光密度值，在绘制好的标准曲线图中查出样品
溶液中的蛋白质含量。
第5页/共24页
Folin酚试剂法操作简便，灵敏度高，样品中蛋白
质含量高于5μg即可测得，是测定蛋白质含量应用得最
பைடு நூலகம்
广泛的方法之一。
第2页/共24页
【实验材料】
1.实验器材
100毫升容量瓶2只；移液管1毫升4支，5毫升2支；分光光度计。
2.实验试剂
(1)Fo1in酚试剂甲：将lg碳酸钠溶于／L氢氧化钠溶液中，再把 硫酸铜(CuSO4∙5H2O)溶于100mL1％酒石酸钾(或酒石酸钠)溶液，然后 将前者50mL与后者lmL混合。混合后1日内使用有效。
2.测定未知样品
取样品溶液4毫升,加蒸馏水4mL混匀，在280nm下 测定其光密度值。
【实验结果】
根据样品溶液的光密度值，在绘制好的标准曲线图中 查出样品溶液的蛋白质含量。
第8页/共24页
【实验目的】
三、微量凯氏定氮法
学习凯氏定氮法的原理和操作技术。
蛋白质染料复合物具有很高的吸光值，因此大大提高了蛋白质测定 的灵敏度，最低检出量为1μg蛋白。染料与蛋白质结合迅速，大约为2 分钟，结合物的颜色在1小时内稳定。所以本法操作简便，快速，灵敏 度 高 ， 稳 定 性 好 ， 是 一 种 测 定 蛋第白20质页/含共量24页的 常 用 方 法 。
【实验材料】
2. 测定未知样品：取2支试管，分别准确吸取1毫升样品溶液，各加
5毫升Fo1in酚试剂甲，摇匀，室温放置10分钟后，再各加1毫升 Fo1in酚试剂乙，立即摇匀，放置30分钟，在500nm处测定光密度值 。
【实验结果】
根据未知样品溶液的光密度值，在绘制好的标准曲线图中查出样品
溶液中的蛋白质含量。
第5页/共24页
Folin酚试剂法操作简便，灵敏度高，样品中蛋白
质含量高于5μg即可测得，是测定蛋白质含量应用得最
பைடு நூலகம்
广泛的方法之一。
第2页/共24页
【实验材料】
1.实验器材
100毫升容量瓶2只；移液管1毫升4支，5毫升2支；分光光度计。
2.实验试剂
(1)Fo1in酚试剂甲：将lg碳酸钠溶于／L氢氧化钠溶液中，再把 硫酸铜(CuSO4∙5H2O)溶于100mL1％酒石酸钾(或酒石酸钠)溶液，然后 将前者50mL与后者lmL混合。混合后1日内使用有效。
蛋白质含量的测定(共4张PPT)
第三页，共4页。
样品的测定
吸取提取液和稀释250倍的血清液各1.0mL于试管中（三次重复），分别 加5.0mL试剂甲，放置10分钟后，加试剂乙0.5mL，立即混匀，恒温37度 反应20分钟，测A750的值。
管号
1 2 3
小白 菜
T或A
管号
1 2 3
血清 T或A
☆小白菜用mg／g，血清用mg／mL。
／mL）
μg
1 样品（小白菜）液的提取
其中双缩脲法和Folin-酚法
0
1.0 0
2 以1号为参比，测A750的值。
0.2 0.8 50
进—一Fo步lin掌-酚握试分剂光法光（度L法ow—ry—法求3）标和准考曲马线斯、0亮.准蓝4确法测（定Br未od知0fo.样rd6品法、）正100
4 其中双缩脲法和Folin-酚法
蓝色反应（钼蓝和钨蓝的混合物）。由于蛋白质中含有带酚基
的酪氨酸，故有此颜色反应。因此，用Folin-酚法测定蛋白质 含量灵敏度较高。
第二页，共4页。
实验步骤 1.标准曲线的制作：按下表操作
管
BSA
H2O Pr.
蓝色反应（钼蓝和钨蓝的混号合物）。（300μg
含量
样品（小白菜）液的提取 是一般实验室中经常使用的方法。
蛋白质含量的测定
—Folin-酚试剂法（Lowry法）和考马斯亮蓝法
（Brodford法）
一 Folin-酚试剂法（Lowry法） 目的和要求
学习Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法。
进一步掌握分光光度法——求标准曲线、准确测定未知样品、正 确使用仪器
第一页，共4页。
原理
蛋白质浓度可以从它们的物理化学性质，如折射率、比重、紫 外吸收等测定而得知：或用化学方法，如定氮、双缩脲反应、 Folin-酚试剂反应等方法来求算。其中双缩脲法和Folin-酚法
BCA法测定蛋白质含量ppt课件
C测=A测/ A标×C标
在 日 常 生 活 中，随 处都可 以看到 浪费粮 食的现 象。也 许你并 未意识 到自己 在浪费 ，也许 你认为 浪费这 一点点 算不了 什么
2.利用标准曲线法进行换算测定物浓度（标准曲线法）
❖ 配制一系列的
A
标准管，然后
绘出标准曲线。
A待测
❖ 再测出测定管 的吸光度，在 标准曲线上查 找到对应浓度。
二.实验原理
A562∝M蛋白质
紫蓝色
562nm
在 日 常 生 活 中，随 处都可 以看到 浪费粮 食的现 象。也 许你并 未意识 到自己 在浪费 ，也许 你认为 浪费这 一点点 算不了 什么
二.实验原理
采用标准曲线法计算待测液含量
作图人：
仪器型号：722型分光光度计
时间：
A待测
波长：562nm
45°
二.实验原理
在碱性条件下，蛋白质将Cu2+还原为Cu+， Cu+与两分子 BCA（二辛可酸）反应形成紫蓝色的络合物，测定其在 562nm处的吸光度值，并与标准曲线对比，即可计算待测
在 日 常 生 活 中，随 处都可 以看到 浪费粮 食的现 象。也 许你并 未意识 到自己 在浪费 ，也许 你认为 浪费这 一点点 算不了 什么
5 测定管
m(ug)
0 15 30 45 60 75
吸光度 (A)
仪器名称、型号编号： 波长： 测定日期： 测定人：
在 日 常 生 活 中，随 处都可 以看到 浪费粮 食的现 象。也 许你并 未意识 到自己 在浪费 ，也许 你认为 浪费这 一点点 算不了 什么
四.注意事项
1、实验分组，两人一组 2、试剂盘的摆放：专管专用，防止污染 3、准确量取试剂，正确使用吸量管 4、正确操作722型分光光度计，此次由于 溶液体积较少，比色皿不需要待测溶液润洗 5、正确绘制标准曲线，标明名称、仪器、 作图人、时间等 6、实验原始数据书写规范，三线表 7、待测液(小牛血清)已经稀释了500倍，
在 日 常 生 活 中，随 处都可 以看到 浪费粮 食的现 象。也 许你并 未意识 到自己 在浪费 ，也许 你认为 浪费这 一点点 算不了 什么
2.利用标准曲线法进行换算测定物浓度（标准曲线法）
❖ 配制一系列的
A
标准管，然后
绘出标准曲线。
A待测
❖ 再测出测定管 的吸光度，在 标准曲线上查 找到对应浓度。
二.实验原理
A562∝M蛋白质
紫蓝色
562nm
在 日 常 生 活 中，随 处都可 以看到 浪费粮 食的现 象。也 许你并 未意识 到自己 在浪费 ，也许 你认为 浪费这 一点点 算不了 什么
二.实验原理
采用标准曲线法计算待测液含量
作图人：
仪器型号：722型分光光度计
时间：
A待测
波长：562nm
45°
二.实验原理
在碱性条件下，蛋白质将Cu2+还原为Cu+， Cu+与两分子 BCA（二辛可酸）反应形成紫蓝色的络合物，测定其在 562nm处的吸光度值，并与标准曲线对比，即可计算待测
在 日 常 生 活 中，随 处都可 以看到 浪费粮 食的现 象。也 许你并 未意识 到自己 在浪费 ，也许 你认为 浪费这 一点点 算不了 什么
5 测定管
m(ug)
0 15 30 45 60 75
吸光度 (A)
仪器名称、型号编号： 波长： 测定日期： 测定人：
在 日 常 生 活 中，随 处都可 以看到 浪费粮 食的现 象。也 许你并 未意识 到自己 在浪费 ，也许 你认为 浪费这 一点点 算不了 什么
四.注意事项
1、实验分组，两人一组 2、试剂盘的摆放：专管专用，防止污染 3、准确量取试剂，正确使用吸量管 4、正确操作722型分光光度计，此次由于 溶液体积较少，比色皿不需要待测溶液润洗 5、正确绘制标准曲线，标明名称、仪器、 作图人、时间等 6、实验原始数据书写规范，三线表 7、待测液(小牛血清)已经稀释了500倍，
最新实验一蛋白质含量测定ppt课件
生物化学与分子生物学基础实验
TU1800 紫外可见分光光度计
波长范围：200－1100nm 钨灯：340－1100nm
测光系统：单光束
氘灯：200－340nm
功能指标：光度测量 光谱扫描 定量测量
生物化学与分子生物学基础实验
注意事项
1 测紫外吸收要用石英比色皿 ！ 2 定量实验取液要准确。 3 从低浓度到高浓度依次测量，比色皿不要润 洗。 因此3ml溶液足够测定。 4 测量完毕，请把光度计的盖打开 ！ 5 每次实验时提交上一次的实验报告。
生物化学与分子生物学基础实验
生物化学与分子生物学基础实验
Folin-酚试剂法（Lowry法）
实验步骤
0 1234567
标准蛋白（1mg/ml）ul 0 20 40 80 120 160 200 0
待测样品 ul
-
- - - - - - 200
蒸馏水 ul
1000 980 960 920 880 840 800 800
Folin-酚试剂甲 ml
3、所有的样品（包括标准样品），都必须在规定时间 内测试。时间过长，得到的吸光值会有变化，导致测出 的样品浓度与实际的浓度不符。
生物化学与分子生物学基础实验
722型光栅分光光度计
光 源
单 色
样
光
读
品
电
数
器
池
源
单
件元
测量完毕，请把光度计的盖打开 ！
讲解完毕后，每个组出一个同学去 127听老师讲解仪器使用。
生物化学与分子生物学基础实验
Folin-酚试剂法（Lowry法）
• 酸、铜离子螯合剂（如EDTA、柠檬酸等）、还原剂（如巯基乙 醇、DTT、苯酚等）干扰本反应。
蛋白质检测方法ppt课件
✓优点：极高的显色灵敏度 和良好的检出限
✓缺点：水合茚三酮和不同 的氨基酸显色程度有所差 异，蛋白质水解程度的不 同容易对测量结果造成较 大误差。此外，茚三酮显 色剂的稳定性较差，不利 于长期存储
15
严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
18
严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
4
严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
免疫印迹法检 测样品中特异 蛋白质的基本 流程
5
样品的凝胶电泳 蛋白印迹 封闭反应
与特异性抗体（一抗）孵育 与酶耦联的二抗孵育 显色或化学发光显影 观察和记录结果
✓ 优点：简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后能回 收
✓ 缺点:准确度较差、专一性差、干扰物质多，若样品中 含有嘌呤、 嘧啶及核酸等能吸收紫外光的物质，会出 现较大的干扰
7
严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
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近红外光谱法
✓ 原理：当红外光照射样品分子时，极性共价键选择性地吸 收某些波长的光后产生振动能级跃迁，吸收光子的频率与跃 迁前后的能量差相关，吸收的强度取决于化学键振动的非谐 性。分子的基频振动产生的吸收谱带位于波长2500-25000nm 的中红外区域，发生780-1100nm 的短波近红外区11002500nm 的长波近红外区的吸收谱带对应着基频振动的倍频 和组合频。含氢基团（X-H）的振动跃迁非谐性常数最高， 其在有机物的近红外吸收光谱中占主导地位。 ✓ 优点：绝大多数的有机物都有吸收响应，所以测量时几乎 无需进行样品前处理 ✓ 缺点：吸收系数小，其检测限通常不到 0.1%，不利于对蛋 白质的衡量分析
✓缺点：水合茚三酮和不同 的氨基酸显色程度有所差 异，蛋白质水解程度的不 同容易对测量结果造成较 大误差。此外，茚三酮显 色剂的稳定性较差，不利 于长期存储
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免疫印迹法检 测样品中特异 蛋白质的基本 流程
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样品的凝胶电泳 蛋白印迹 封闭反应
与特异性抗体（一抗）孵育 与酶耦联的二抗孵育 显色或化学发光显影 观察和记录结果
✓ 优点：简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后能回 收
✓ 缺点:准确度较差、专一性差、干扰物质多，若样品中 含有嘌呤、 嘧啶及核酸等能吸收紫外光的物质，会出 现较大的干扰
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近红外光谱法
✓ 原理：当红外光照射样品分子时，极性共价键选择性地吸 收某些波长的光后产生振动能级跃迁，吸收光子的频率与跃 迁前后的能量差相关，吸收的强度取决于化学键振动的非谐 性。分子的基频振动产生的吸收谱带位于波长2500-25000nm 的中红外区域，发生780-1100nm 的短波近红外区11002500nm 的长波近红外区的吸收谱带对应着基频振动的倍频 和组合频。含氢基团（X-H）的振动跃迁非谐性常数最高， 其在有机物的近红外吸收光谱中占主导地位。 ✓ 优点：绝大多数的有机物都有吸收响应，所以测量时几乎 无需进行样品前处理 ✓ 缺点：吸收系数小，其检测限通常不到 0.1%，不利于对蛋 白质的衡量分析
蛋白质含量的测定 考马斯亮蓝染色法(共20张PPT)
光源
0.575
单色器
吸收池
检测器 显示器
第6页，共20页。
➢ 光源
不同的光源都有其特有的发射光谱，因此可采用不同的发光体作为仪器的光源
钨灯的发射光谱：钨灯光源所发出的320～1100nm波长的光谱，光通过三棱镜折射
后，可得到由红、橙、黄、绿、蓝、靛、紫组成的连续色谱；该色谱可作为 可见光分光光度计的光源
吸收光谱，可以鉴别溶液中所含的物质 Ø当光线通过某种物质的溶液时，透过的光的强度减弱。因为有一部分光在溶液的表面反射，一 部分光被组成此溶液的物质所吸收，只有一部分光可透过溶液，则：
入射光=反射光+吸收光+透过光
Ø如果我们用蒸馏水（或组成此溶液的溶剂）作为“空白”去校正反射等因素造成的入射光 的损失，则：
入射光=吸收光+透过光
第4页，共20页。
Ø朗伯-比尔（Lambert-Beer）光吸收定律
u设 I0为经过空白校正后入射光的强度，I t为透过光的强度 u根据实验得知：It= I0 ·10－εbc，式中：c 表示吸收物质的摩尔浓度；b表示吸收物质的光径， 用cm表示；ε表示吸收物质的摩尔消光系数，它表示物质对光的吸收特性，不同物 质的ε数值不同，所以 It/ I0= 10－εbc u令 T（透射比）= It/ I 0 ， 则T=10－εbc ，lg（1 / T）=εbc ulg（l / T）为物质的吸光度（A），则A = 1g（1 / T）＝εbc，此式说明了物质的吸光度 与吸收物质的浓度和光程成正比，这就是Lambert-Beer光吸收定律
蛋白质含量的测定 考马斯亮光光度技术的一般原理
ü学习722型可见光分光光度计的操作 ü熟悉考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量的原理和方法
蛋白质含量测定ppt课件
（三）蛋白质的胶体性质
蛋白质是生物大分子，分子量可自1万至100万之 巨，其分子的直径可达1～100nm，为胶粒范围之 内。蛋白质溶液是相当稳定的亲水胶体，因为蛋 白质颗粒外面形成一层水化层，同时这些颗粒带 有相同电荷，相互排斥。蛋白质水溶的沉淀反应 如果加入适当的试剂使蛋白质分子处于等 电点状态或失去水化层（消除相同电荷， 除去水膜），蛋白质胶体溶液就不再稳定 并将产生沉淀。
（二）蛋白质的两性电离 蛋白质是由氨基酸组成，其分子末端除有自由的 α-NH2和α-COOH外，许多氨基酸残基的侧链上 尚有可解离的基因，这些基团在溶液一定pH条件 下可以解离成带负电荷或正电荷的基团。当蛋白 质溶液在某一pH时，蛋白质解离成正负离子的趋 势相等，即成兼性离子，净电荷为零，此时溶液 的pH称为蛋白质的等电点（isoelectric point,PI）。 蛋白质溶液的pH大于等电点时，该蛋白质颗粒带 负电荷，小于等电点时则带正电。 电泳：带电颗粒在电场中移动的现象。 电泳种类：自由界面电泳、区带电泳（纸电泳、 凝胶电泳等）
4. 若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，有 些蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功 能，称为复性(renaturation)。所示。但是许多蛋 白质变性后，空间构象严重被破坏，不能复原， 称为不可逆性变性。 5. 蛋白质经强酸、强碱作用发生变性后，仍能 溶解于强酸或强碱溶液中，若将pH调至等电点， 则变性蛋白质立即结成絮状的不溶解物，此絮状 物仍可溶解于强酸和强碱中。如再加热则絮状物 可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸 和强碱中，这种现象称为蛋白质的凝固作用 (protein coagulation)。
H2NCH2COOH +3H2SO4 → 2CO2 + 3SO2 + 4H2O + NH3 (l) (1) 2NH3 +H2SO4 → (NH4)2SO4 (2) (NH4)SO4 +2NaOH → 2H2O+Na2SO4 +2NH3 (3) 此法灵敏度低,适用于0.2-1.0mg 氮,误差为2%, 费时8-10小时,将氮转化为氨,用酸吸收后滴 定.
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SDS干扰数据和图
表3 考马斯亮兰SDS干扰实验表格
管号123456标准蛋白质（1.03mg/ml） 0.10.10.10.10.10.1SDS (1mg/ml)00.10.20.40.60.8蒸馏水 0.90.80.70.50.30.1考马斯亮兰G-250试 剂3.03.03.03.03.03.0对应的吸光度 A5950.4230.3360.2750.2000.2130.198
（一）紫外280nm吸收法数据和图
表4 紫外280nm光吸收法
管号123456BSA (1.03mg/ml)体积 01.02.03.04.05.0H2O5.04.03.02.01.00BSA 浓度（mg/ml） 00.2060.4120.6180.8241.03A28000.1580. 2700.3790.5140.645
根据表3，以A595为纵坐标，SDS浓度为 横坐标，作图3。
.
11
图3 考马斯亮兰SDS干扰实验
A595
考马斯亮兰SDS干扰实验图
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
SDS浓度
.
12
由上图可以看出，十二烷基硫酸钠(SDS)对 考马斯亮兰法测蛋白质含量有干扰，同是 0.103mg/ml的标准蛋白与3.0ml考马斯亮兰， 但随着SDS浓度的增加，其混合液的595nm 处的吸收峰逐渐降低，而后有一小段回升， 最后趋于渐近线。
蛋白质含量测定法
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1
考马斯亮兰法（Bradford法）
实验原理 考马斯亮蓝G-250染料+碱性芳香族氨基酸 在磷酸的作用下，最大吸收为595nm(兰色）
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2
器材与试剂
722型和753型可见光分光光度计
漩涡混合器
试管16支
标准蛋白质溶液，用牛血清清蛋白（BSA）， 配制成1.03mg/ml和0.103mg/ml。
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13
紫外吸收法
[实验原理]
280nm的光吸收法：蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和 色氨酸在280nm处有最大吸收。
215nm与225nm的吸收差法：蛋白质因为含量低而不能使
用280nm的光吸收测定时，可用215nm与225nm吸收值之 差，通过标准曲线法来测定蛋白质稀溶液的浓度。
肽键测定法：蛋白质溶液在238处的光吸收强弱，与肽键
.
16
根据表4，以A280为纵坐标，SBA浓 度为横坐标，作图4。
0.7
0.6
0.5
加完染料20min后，使用722分光光度计 （灵敏度4），塑料比色皿，在595nm处测 量吸光度A595。
用标准蛋白浓度（mg/ml）为横坐标，用
A595为纵坐标，进行直线拟合，得到标准
曲线。根据测得的未知样品的A595，查表
即可求得未知样品. 的蛋白质含量。
4
微量法
取10支试管，分别编号后按 表1-3 剂量依 次加入稀释的标准蛋白（或未知蛋白）、 去离子水和考马斯亮兰染料。其他步骤同 上，不过使用753分光光度计（狭缝4）。
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5
SDS干扰实验
取5支试管，分别编号后按表1-5剂量依次 加入标准蛋白、SDS、去离子水和考马斯 亮兰染料。每支试管加完后，立即在漩涡 混合器上混合。
加完染料20min后，使用753分光光度计 （狭缝4），塑料比色皿，在595nm处测量 吸光度A595。
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6
实验数据与结果分析
标准方法的数据和图
对应的吸光度 A595
0.200 0.311 0.362 0.483 0.624 0.752 0.845 0.387 0.501
根据表1，以A595为纵坐标，标准蛋白质. 量/（μg）为横坐标，作图1。
0.572
7
图1 考马斯亮兰标准法
A595
1 0.8 0.6 0.4 0.2
0 0
图1 考马斯亮兰标准法
考马斯亮兰G-250染料试剂：称100mg考马 斯亮兰，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入 120ml 85% 的磷酸，用水稀释至1升。
.
3
实验方法
标准方法
取10支试管，分别编号后按 表1-1 剂量依 次加入标准蛋白（或未知蛋白）、去离子 水和考马斯亮兰染料。每支试管加完后， 立即在漩涡混合器上混合。
图1 考马斯亮兰标准法
y = 6.1884x + 0.2287 R 2 = 0.9942
0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12
标准蛋白质量/（μg）
.
8
微量法的数据和图
表2 考马斯亮兰微量法实验表格
管号12345678910标准蛋白质（0.103mg/ml） 00.10.20.40.60.81.0未知蛋白质（约0.5mg/ml） 0.40.81.0蒸馏水1.00.90.80.60.40.200.60.20 考马斯亮兰G-250试剂 3.03.03.03.03.03.03.03.03.03.0对应的吸光度 A59500.0880.1840.2920.4110.5420.6310.171 0.2890.362
表1 考马斯亮兰标准法实验表格
管号
1
2
3
4
5
6
7
8
标准蛋白质 （1.03mg/ml） 0 0.01 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10
9
10
未知蛋白质 （约0.5mg/ml）
பைடு நூலகம்0.04 0.08 0.10
蒸馏水
考马斯亮兰 G-250试剂
0.1 0.09 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0.06 0.02 0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
根据表2，以A595为纵坐标，标准蛋白质量/ （μg）为横坐标，作图2。
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9
图2 考马斯亮兰微量法
A595
0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1
0 0
图2 考马斯亮兰微量法
y = 6.0579x + 0.0305 R 2 = 0.9919
0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 标准蛋白质量/（μg）
的多少成正比。可以测238nm处吸收值，通过标准曲线法 来测定蛋白质稀溶液的浓度。
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14
[器材与试剂]
（一） 器材 1．SPECORD200分光光度计 2．漩涡混合器 3．试管12支 （二） 试剂 标准蛋白质溶液，用牛血清清蛋白（BSA），
配制成1.03mg/ml。
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[实验数据与结果分析]