质谱成像及其在生物医学领域的应用
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MSI 有 Microprobe 和 Microscope 两种空间信息获取模式。Microprobe 模式较为常用， 在该模式下，离子束或激光逐点照射组织表面，可检测到每个点上分子的 m/z 信息并单独 储存。Microscope 模式则是以非聚焦的激光或离子束扫描组织切片表面，将所得分子的 m/z 值、强度及其在组织上的位置信息一起储存，在该模式下可获得较高的空间分辨率，但它 只能与特定的质量分析器联用[6] (图 1)。根据激光或离子束在组织上取点数量的不同，可将 MSI 分为 profiling 和 imaging 两种方式。Profiling 方式的特点是在组织表面取 5～20 个不连 续的点 (直径约为 1 mm)，该方式的空间分辨率较低，通常用于比较两种组织的异同； Imaging 方式则是在整个组织切片上按照特定的规则选取数千个点 (直径为 30～150 μm) 进 行连续分析，然后将测得的信息进行图像重构，从而获得分子在组织中分布的谱图，其空 间分辨率较高[7]。
摘要：质 谱 成 像 （mass spectrometry imaging， MSI） 是 一种 研 究 生 物 组 织 或 细 胞 中 分 子 组 成 及 分布的新型分析技术， 可在无标记的情况下同时检测并记录样本表面多种分子的空间分布信息。 MSI 包括 4 个基本步骤 ： 样本准备 、 离子化 、 分子的质量分析及图 像 重 构 。 目 前 ， 该 技 术 已 被 广泛应用于研究组织中元素、 代谢物、 蛋白质和药物及其代谢物等的分布 。 本文介绍了 MSI 的 原理、 离子化技术和技术流程， 并综述了 MSI 在生物医学领域中的应用情况。 关键词：质谱成像； 离子化技术； 组织制备 中图分类号：R445 DOI：10.3724/SP.J.1260.2011.01008
MALDI 技术 在 MALDI-MSI 中，组织切片表面的分子需要与基质合理混合，当激光照射在组织切
片表面时，基质吸收激光的能量而使分子发生解吸，解吸后的分子随基质一同进入气相状 态，基质与分子发生质子转移反应后形成离子，随后经质谱检测，再由重构软件构建分子 在组织中分布的谱图 (图 1)。应用该技术时，固定激光束的位置，通过改变载有组织的质 谱靶的位置，就可以实现对整个组织的成像。该技术的空间分辨率受激光点直径和基质结 晶尺寸等因素的影响，具有较大的盐容忍度和质量检测范围，电离产生的分子大部分以准 分子离子形式 ([M＋H]＋或[M－H]－) 存在。MALDI 可与多种质量分析器联用，如飞行时间 (time of flight，TOF)、四极杆飞行时间 (quadrupole time of flight，Q-TOF)、离子阱 (ion trap，IT) 和傅立叶变换离子回旋 (Fourier transform ion cyclotron resonance，FTICR) 等， 其中，MALDI 与 TOF 的联用较多。TOF 具有较高的离子传输率 (50%～100%)、较宽的质 量范围和较好的重现性，但其质量准确性差[10]。FTICR 分析器具有超高的质量分辨率、准 确性和稳定性，且具有串联质谱功能，能准确进行分子的定性分析[11]。MALDI-MSI 常用于 药物及其代谢物、脂类、多肽和完整蛋白质的分析。
www.cjb.org.cn｜ACTA BIOPHYSICA SINICA
1011
主编特约·综述 / Invited Review
生物物理学报 2011 年 第 27 卷 第 12 期
组织切片
组织切片时的环境温度、切片厚度及其转移方式，是影响实验重复性和分子相对位置 的关键因素。样本一般使用冰冻切片机切片，环境温度则因组织而异，通常控制在－5～ －25℃的范围内，对于脂质含量较高的组织 (如脑)，可选择更低的温度。进行组织切片时， 过薄的切片易于撕裂，过厚的切片导电性差且需长时间干燥，所以切片厚度通常控制在一 个细胞大小的范围 (10～20 μm) 内，以保证大部分细胞的细胞器暴露出来[23]。切片完成后， 需要将样本转移至质谱靶。目前，切片转移至质谱靶的方法有：1) 将切片通过导电双面胶 带黏附至靶上；2) 室温下，直接将冰冻组织切片粘到靶上 (融裱法)。前种方法应避免空气 进入，后种方法应避免水洗时引入杂质或损坏组织，实际操作中后种方法较为常用。研究 表明，组织切片一旦移出冰冻切片机，组织中的蛋白质就可能降解，在融裱阶段发生的任 何变化都可能导致质谱成像结果的不准确[24]，此外，融裱效果与下游处理过程也密切相关。 因此，切片转移后需立即真空干燥 30 min，以避免蛋白质的位置在潮湿环境中发生改变。
1009
主编特约·综述 / Invited Review
生物物理学报 2011 年 第 27 卷 第 12 期
次离子电离 (secondary ion mass spectrometry，SIMS) 技术。MALDI 是一种温和的电离技 术，1997 年首次与成像方法结合，被应用于研究生物组织中分子的分布[1]。DESI 为 2004 年 提出的新型离子化技术，可在常压下使分析物电离[8]。SIMS 已于 1960 年被用于有机材料的 分析，由于其检测质量范围的限制，直到近期才被用于生物学领域。
单独成斑
组织切片
覆盖基质 整体喷雾
基质干燥
激光或离子束点状扫描 质
谱
分
析
∑ 根据谱图
的空间位 置重构出 图像
Microprobe模式
激光或离子束大面积扫描
＋
检测器同时记录空间 信息和质谱结果
∑ Microscope模式
图 1 质谱成像原理及流程[2,9] Fig.1 Principles and workflow of MSI in profiling and imaging modes[2,9]
1008
郭帅等：质谱成像及其在生物医学领域的应用
主编特约·综述 / Invited Re来自百度文库iew
MSI的技术原理
MSI过程包括 4 个基本步骤：样本制备、离子化技术的选择、分子的质量分析和图像重 构。首先，将组织样本在低温条件下切片后转移至具有导电性的靶上，喷涂基质并干燥， 通过离子束或激光照射，使组织切片表面的分子解吸并离子化，然后由质谱的质量分析器 测定这些离子化分子的 m/z 值，利用软件将测得的质谱信息转化为像素点，最终重构出组 织表面上的分子分布图像。
1010
ACTA BIOPHYSICA SINICA｜Vol.27 No.12｜Dec. 2011
郭帅等：质谱成像及其在生物医学领域的应用
主编特约·综述 / Invited Review
种方法均扩展了 SIMS 的质量检测范围，使其可用于脂类、多肽等生物分子分布的研究。 SIMS-MSI 具有较高的空间分辨率，但其质量检测范围较小，质荷比 m/z 超过 1000 时灵敏 度会显著降低。
主编特约·综述 / Invited Review www.cjb.org.cn
生物物理学报 2011 年 12 月 第 27 卷 第 12期: 1008-1018 ACTA BIOPHYSICA SINICA Vol.27 No.12 Dec. 2011: 1008-1018
质谱成像及其在生物医学领域的应用
DESI 技术 DESI 是一种可在常压下使用的离子化技术。电喷雾产生的带电液滴作用于组织切片表
面，在表面产生可溶解多种分子的次级带电液滴，离子化的分子在空气中直接进入质谱仪 并测得 m/z 值[8,12]，其气相离子的产生方式与电喷雾离子化技术相似，主要形成多电荷带电 离子 ([M＋nH]n＋或[M－nH]n－)。DESI 可与线性离子阱 (linear ion trap，LIT) 和 TOF 等多种质 量分析器联用[13,14]。与 MALDI 相比，其空间分辨率 (200～500 μm) 和灵敏度都较低，但其 具有在常压下使用的优点，可有效保持分析物原来的某些特性。DESI-MSI 主要用于脂类、 药物及其代谢产物、植物中生物碱、水藻中抗菌分子等分布的研究。
郭 帅, 李智立
中国医学科学院基础医学研究所，北京协和医学院基础学院，北京 100005
收稿日期：2011-10-21；接受日期：2011-10-26 基金项目：国家自然科学基金重大项目(91029701) 通讯作者：李智立，电话：(010)65296479，E-mail：lizhili@ibms.pumc.edu.cn
SIMS 技术 SIMS 技术的原理是利用高能初级离子 (如 Ar＋、Ga＋、In＋) 撞击组织表面，使初级离子
穿入样本表面并将动能传递给被分析的原子或分子，当原子或分子的动能大于与组织表面 的相互作用能时，次级离子就从组织表面释放出来。该离子化技术包括静态和动态两种模 式，前者的初级离子束能量低于 1012 ions/cm2，主要与组织的单层分子作用，常用于定性分 析[15]；后者则使用强初级离子束，主要与组织的深层区域作用，对样本具有破坏性，常用 于定量分析[16]。采用 SIMS 技术时，样本处理过程简单，切片可直接转移至质谱靶而不需额 外洗涤，减少了分子的损失和扩散。目前有两种样本处理方法可显著增强该技术次级离子 产生的能力：1) 将一层薄金属原子喷涂于组织表面，形成金属辅助 SIMS (metal assisted SIMS，MetA-SIMS)[17]；2) 将温和吸收能量的基质涂于组织表面，形成 ME-SIMS[18]。这两
MSI离子化技术
MSI离子化方式的选择与 MSI 的空间分辨率和信号强弱密切相关。目前主要有三种离 子化技术：MALDI、解吸电喷雾电离 (desorption electrospray ionization，DESI) 技术和二
www.cjb.org.cn｜ACTA BIOPHYSICA SINICA
组织切片
(切片转移至质谱靶)
组织预处理
(切片清洗 / 原位酶解)
基质喷涂
(基质及喷涂方式选择)
MALDI-MSI
对照
染色
图 2 质谱成像的样本制备流程[19] Fig.2 Sample preparation workflow of MSI[19]
组织样本收集与储存
获得新鲜的组织样本后，为避免组织中杂质的干扰和目标分子的降解或移位，需要将 组织中的残留血液细心清除并迅速存于低温环境[20,21]。快速冷冻会使组织由于不同部分的降 温速率不同而破裂，所以，一般将组织轻轻包入铝箔，用液氮预冷后，再存储于低于－80℃ 的温度下。存储时，通常还需将组织用塑料薄膜包裹或放入 EP 管中，以防止变形。MSI 也 可用福尔马林或石蜡包埋法储存的样本，但石蜡包埋法存储会引起组织内蛋白质的亚甲基 交联，阻碍目标蛋白质分子的离子化，因此，在分析石蜡包埋组织中的蛋白质时，需先消 除亚甲基交联[22]。研究表明，组织在－80℃条件下的存储时间超过一年，就难以获得有效的 谱图[23]。
引言
质谱成像 (mass spectrometry imaging，MSI) 是一种新型的成像技术，应用这一技术， 可以直接从生物组织切片表面获得多种蛋白质或小分子代谢物的空间分布信息。这种原位 分析技术的原理是利用激光或离子束使组织切片表面的分子离子化，然后通过质谱测定这 些离子化分子的质荷比 (ratio of mass to charge，m/z)，再由软件重构出分析物在组织中分 布的图谱。该技术最早于 1997 年被应用于研究生物组织中蛋白质的分布[1]，目前已被广泛 用于蛋白质组、脂组和药物代谢等研究领域[2]。MSI 技术与传统影像学方法相比具有以下优 势：1) 在保持较高空间分辨率的情况下，可以同时检测组织切片表面的多种生物分子，其 中，基质辅助激光解吸 / 电离 (matrix-assisted laser desorption/ionization，MALDI) MSI 的 空间分辨率可达 8 μm[3]，纳米二次离子 (nano secondary ion mass spectrometry，NanoSIMS) MSI 的空间分辨率可达 50 nm[4]；2) 具有较高的灵敏度和较宽的质量检测范围，可检测组织 中低浓度的生物分子、药物和完整蛋白质；3) 检测前无需知道被检测成分的信息，且不需 要特征性标记；4) 样本处理过程较简单，例如，应用 MALDI-MSI 时只需简单洗涤组织并 喷涂基质，利用基质增强 SIMS (matrix enhance SIMS，ME-SIMS) 分析组织时，则无需对 样本进行预处理[5]。本文将从 MSI 的原理、样本制备及其在生物医学领域的应用等方面， 简述 MSI 技术的发展现状。
样本制备
MSI 的样本制备极其重要，将直接关系到研究结果的准确性和重复性。样本制备主要 包括样本的收集和储存、组织切片、组织预处理、基质选择和基质喷涂等方面。图 2 给出 了使用不同 MSI 离子化技术时的样本制备过程。
m/z834.4PS(40:6) DESI-MSI/SIMS-MSI
样本收集与储存
摘要：质 谱 成 像 （mass spectrometry imaging， MSI） 是 一种 研 究 生 物 组 织 或 细 胞 中 分 子 组 成 及 分布的新型分析技术， 可在无标记的情况下同时检测并记录样本表面多种分子的空间分布信息。 MSI 包括 4 个基本步骤 ： 样本准备 、 离子化 、 分子的质量分析及图 像 重 构 。 目 前 ， 该 技 术 已 被 广泛应用于研究组织中元素、 代谢物、 蛋白质和药物及其代谢物等的分布 。 本文介绍了 MSI 的 原理、 离子化技术和技术流程， 并综述了 MSI 在生物医学领域中的应用情况。 关键词：质谱成像； 离子化技术； 组织制备 中图分类号：R445 DOI：10.3724/SP.J.1260.2011.01008
MALDI 技术 在 MALDI-MSI 中，组织切片表面的分子需要与基质合理混合，当激光照射在组织切
片表面时，基质吸收激光的能量而使分子发生解吸，解吸后的分子随基质一同进入气相状 态，基质与分子发生质子转移反应后形成离子，随后经质谱检测，再由重构软件构建分子 在组织中分布的谱图 (图 1)。应用该技术时，固定激光束的位置，通过改变载有组织的质 谱靶的位置，就可以实现对整个组织的成像。该技术的空间分辨率受激光点直径和基质结 晶尺寸等因素的影响，具有较大的盐容忍度和质量检测范围，电离产生的分子大部分以准 分子离子形式 ([M＋H]＋或[M－H]－) 存在。MALDI 可与多种质量分析器联用，如飞行时间 (time of flight，TOF)、四极杆飞行时间 (quadrupole time of flight，Q-TOF)、离子阱 (ion trap，IT) 和傅立叶变换离子回旋 (Fourier transform ion cyclotron resonance，FTICR) 等， 其中，MALDI 与 TOF 的联用较多。TOF 具有较高的离子传输率 (50%～100%)、较宽的质 量范围和较好的重现性，但其质量准确性差[10]。FTICR 分析器具有超高的质量分辨率、准 确性和稳定性，且具有串联质谱功能，能准确进行分子的定性分析[11]。MALDI-MSI 常用于 药物及其代谢物、脂类、多肽和完整蛋白质的分析。
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生物物理学报 2011 年 第 27 卷 第 12 期
组织切片
组织切片时的环境温度、切片厚度及其转移方式，是影响实验重复性和分子相对位置 的关键因素。样本一般使用冰冻切片机切片，环境温度则因组织而异，通常控制在－5～ －25℃的范围内，对于脂质含量较高的组织 (如脑)，可选择更低的温度。进行组织切片时， 过薄的切片易于撕裂，过厚的切片导电性差且需长时间干燥，所以切片厚度通常控制在一 个细胞大小的范围 (10～20 μm) 内，以保证大部分细胞的细胞器暴露出来[23]。切片完成后， 需要将样本转移至质谱靶。目前，切片转移至质谱靶的方法有：1) 将切片通过导电双面胶 带黏附至靶上；2) 室温下，直接将冰冻组织切片粘到靶上 (融裱法)。前种方法应避免空气 进入，后种方法应避免水洗时引入杂质或损坏组织，实际操作中后种方法较为常用。研究 表明，组织切片一旦移出冰冻切片机，组织中的蛋白质就可能降解，在融裱阶段发生的任 何变化都可能导致质谱成像结果的不准确[24]，此外，融裱效果与下游处理过程也密切相关。 因此，切片转移后需立即真空干燥 30 min，以避免蛋白质的位置在潮湿环境中发生改变。
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生物物理学报 2011 年 第 27 卷 第 12 期
次离子电离 (secondary ion mass spectrometry，SIMS) 技术。MALDI 是一种温和的电离技 术，1997 年首次与成像方法结合，被应用于研究生物组织中分子的分布[1]。DESI 为 2004 年 提出的新型离子化技术，可在常压下使分析物电离[8]。SIMS 已于 1960 年被用于有机材料的 分析，由于其检测质量范围的限制，直到近期才被用于生物学领域。
单独成斑
组织切片
覆盖基质 整体喷雾
基质干燥
激光或离子束点状扫描 质
谱
分
析
∑ 根据谱图
的空间位 置重构出 图像
Microprobe模式
激光或离子束大面积扫描
＋
检测器同时记录空间 信息和质谱结果
∑ Microscope模式
图 1 质谱成像原理及流程[2,9] Fig.1 Principles and workflow of MSI in profiling and imaging modes[2,9]
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郭帅等：质谱成像及其在生物医学领域的应用
主编特约·综述 / Invited Re来自百度文库iew
MSI的技术原理
MSI过程包括 4 个基本步骤：样本制备、离子化技术的选择、分子的质量分析和图像重 构。首先，将组织样本在低温条件下切片后转移至具有导电性的靶上，喷涂基质并干燥， 通过离子束或激光照射，使组织切片表面的分子解吸并离子化，然后由质谱的质量分析器 测定这些离子化分子的 m/z 值，利用软件将测得的质谱信息转化为像素点，最终重构出组 织表面上的分子分布图像。
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ACTA BIOPHYSICA SINICA｜Vol.27 No.12｜Dec. 2011
郭帅等：质谱成像及其在生物医学领域的应用
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种方法均扩展了 SIMS 的质量检测范围，使其可用于脂类、多肽等生物分子分布的研究。 SIMS-MSI 具有较高的空间分辨率，但其质量检测范围较小，质荷比 m/z 超过 1000 时灵敏 度会显著降低。
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生物物理学报 2011 年 12 月 第 27 卷 第 12期: 1008-1018 ACTA BIOPHYSICA SINICA Vol.27 No.12 Dec. 2011: 1008-1018
质谱成像及其在生物医学领域的应用
DESI 技术 DESI 是一种可在常压下使用的离子化技术。电喷雾产生的带电液滴作用于组织切片表
面，在表面产生可溶解多种分子的次级带电液滴，离子化的分子在空气中直接进入质谱仪 并测得 m/z 值[8,12]，其气相离子的产生方式与电喷雾离子化技术相似，主要形成多电荷带电 离子 ([M＋nH]n＋或[M－nH]n－)。DESI 可与线性离子阱 (linear ion trap，LIT) 和 TOF 等多种质 量分析器联用[13,14]。与 MALDI 相比，其空间分辨率 (200～500 μm) 和灵敏度都较低，但其 具有在常压下使用的优点，可有效保持分析物原来的某些特性。DESI-MSI 主要用于脂类、 药物及其代谢产物、植物中生物碱、水藻中抗菌分子等分布的研究。
郭 帅, 李智立
中国医学科学院基础医学研究所，北京协和医学院基础学院，北京 100005
收稿日期：2011-10-21；接受日期：2011-10-26 基金项目：国家自然科学基金重大项目(91029701) 通讯作者：李智立，电话：(010)65296479，E-mail：lizhili@ibms.pumc.edu.cn
SIMS 技术 SIMS 技术的原理是利用高能初级离子 (如 Ar＋、Ga＋、In＋) 撞击组织表面，使初级离子
穿入样本表面并将动能传递给被分析的原子或分子，当原子或分子的动能大于与组织表面 的相互作用能时，次级离子就从组织表面释放出来。该离子化技术包括静态和动态两种模 式，前者的初级离子束能量低于 1012 ions/cm2，主要与组织的单层分子作用，常用于定性分 析[15]；后者则使用强初级离子束，主要与组织的深层区域作用，对样本具有破坏性，常用 于定量分析[16]。采用 SIMS 技术时，样本处理过程简单，切片可直接转移至质谱靶而不需额 外洗涤，减少了分子的损失和扩散。目前有两种样本处理方法可显著增强该技术次级离子 产生的能力：1) 将一层薄金属原子喷涂于组织表面，形成金属辅助 SIMS (metal assisted SIMS，MetA-SIMS)[17]；2) 将温和吸收能量的基质涂于组织表面，形成 ME-SIMS[18]。这两
MSI离子化技术
MSI离子化方式的选择与 MSI 的空间分辨率和信号强弱密切相关。目前主要有三种离 子化技术：MALDI、解吸电喷雾电离 (desorption electrospray ionization，DESI) 技术和二
www.cjb.org.cn｜ACTA BIOPHYSICA SINICA
组织切片
(切片转移至质谱靶)
组织预处理
(切片清洗 / 原位酶解)
基质喷涂
(基质及喷涂方式选择)
MALDI-MSI
对照
染色
图 2 质谱成像的样本制备流程[19] Fig.2 Sample preparation workflow of MSI[19]
组织样本收集与储存
获得新鲜的组织样本后，为避免组织中杂质的干扰和目标分子的降解或移位，需要将 组织中的残留血液细心清除并迅速存于低温环境[20,21]。快速冷冻会使组织由于不同部分的降 温速率不同而破裂，所以，一般将组织轻轻包入铝箔，用液氮预冷后，再存储于低于－80℃ 的温度下。存储时，通常还需将组织用塑料薄膜包裹或放入 EP 管中，以防止变形。MSI 也 可用福尔马林或石蜡包埋法储存的样本，但石蜡包埋法存储会引起组织内蛋白质的亚甲基 交联，阻碍目标蛋白质分子的离子化，因此，在分析石蜡包埋组织中的蛋白质时，需先消 除亚甲基交联[22]。研究表明，组织在－80℃条件下的存储时间超过一年，就难以获得有效的 谱图[23]。
引言
质谱成像 (mass spectrometry imaging，MSI) 是一种新型的成像技术，应用这一技术， 可以直接从生物组织切片表面获得多种蛋白质或小分子代谢物的空间分布信息。这种原位 分析技术的原理是利用激光或离子束使组织切片表面的分子离子化，然后通过质谱测定这 些离子化分子的质荷比 (ratio of mass to charge，m/z)，再由软件重构出分析物在组织中分 布的图谱。该技术最早于 1997 年被应用于研究生物组织中蛋白质的分布[1]，目前已被广泛 用于蛋白质组、脂组和药物代谢等研究领域[2]。MSI 技术与传统影像学方法相比具有以下优 势：1) 在保持较高空间分辨率的情况下，可以同时检测组织切片表面的多种生物分子，其 中，基质辅助激光解吸 / 电离 (matrix-assisted laser desorption/ionization，MALDI) MSI 的 空间分辨率可达 8 μm[3]，纳米二次离子 (nano secondary ion mass spectrometry，NanoSIMS) MSI 的空间分辨率可达 50 nm[4]；2) 具有较高的灵敏度和较宽的质量检测范围，可检测组织 中低浓度的生物分子、药物和完整蛋白质；3) 检测前无需知道被检测成分的信息，且不需 要特征性标记；4) 样本处理过程较简单，例如，应用 MALDI-MSI 时只需简单洗涤组织并 喷涂基质，利用基质增强 SIMS (matrix enhance SIMS，ME-SIMS) 分析组织时，则无需对 样本进行预处理[5]。本文将从 MSI 的原理、样本制备及其在生物医学领域的应用等方面， 简述 MSI 技术的发展现状。
样本制备
MSI 的样本制备极其重要，将直接关系到研究结果的准确性和重复性。样本制备主要 包括样本的收集和储存、组织切片、组织预处理、基质选择和基质喷涂等方面。图 2 给出 了使用不同 MSI 离子化技术时的样本制备过程。
m/z834.4PS(40:6) DESI-MSI/SIMS-MSI
样本收集与储存