农杆菌侵染烟草叶片表皮细胞实验步骤

农杆菌侵染烟草叶片表皮细胞实验步骤

整理人：早熟组赵凤利

一、准备试剂：

1.加有三抗的YEB或LB液体培养基，用于摇菌；

2.渗透液(50ml)：250mg D-glucose，5ml MES 原液，5ml Na3PO4·12H2O 原液，5ul 1M 乙酰丁香酮原液，加dH2O至50ml。

1). 500 mM MES (Sigma)：4.88 g溶于50ml dH2O，保存于4℃

2). 20 mM Na3PO4·12H2O (BDH)：0.38 g 溶于50ml dH2O，保存于4℃

3). 1M 乙酰丁香酮：0.196 g，加DMSO至1 ml，可分装成小剂量，存于-20℃。

二、实验步骤：

1.将检测成功的农杆菌菌液过夜扩摇，28℃,200rpm；

2.取1-1.5 ml 菌液，加到灭菌的1.5ml离心管中；

3.1000 g，10 min，沉淀菌体(室温)，去上清，加1 ml 渗透液，悬浮菌体；

4.重复步骤3，进一步除去少量的抗生素；

5.取少量悬浮菌液稀释10倍，测定OD600值，并乘以10，作为悬浮菌液的OD600值；

注：如果悬浮菌液的OD600值在1.5-2.0之间，说明有大量的死菌细胞，将降低转化的效率。

6.确定悬浮菌液对渗透液的滴定度，计算稀释系数，使最终悬浮菌液(用于侵染)为0.5-5.0 ml，OD600为0.01-0.1，通常0.5-1.0 ml的最终悬浮菌液就能满足侵染了；

如：需要OD600=0.1的500 ul最终悬浮菌液，而测定的悬浮菌液的OD600=0.4，则最终悬浮菌液中，悬浮菌液的用量为(0.1*500)/0.4=125 ul，则需要渗透液为375 ul。

7.在1.5ml离心管中，配好最终悬浮菌液，准备侵染；

8.侵染前，将烟草放于白色荧光灯下1 h，使其气孔打开；

9.选择倒三叶和倒四叶，用于侵染(于两叶脉之间侵染)，一株选两叶，侵染一种菌液；

10.用去掉针头的注射器，轻柔地摩擦待转叶片的背部(0.5 cm2)，或用小针头刺穿，以去除其蜡质层；

11.侵染前，用记号笔标记待转区域；

12.将第7步中的最终悬浮菌液吸入1ml去针头的注射器中

13.将注射器对着叶片背面的待转区域，一手按着叶片上面，另一手轻轻推动活塞，直到看到液体扩散，再侵染其他部位，侵染后，用记号笔圈定侵染区域；

14.将侵染后的烟草放回培养室

15.2-3天后：

1). 亚细胞定位实验：切掉侵染区域，制片，荧光显微镜观察；

2). 启动子GUS活性：GUS染色，75%酒精脱色，观察结果。

参考文献：Nature Protocols, 2006: 2019-2025.