110基础生物化学实验@中科大实验五 植物叶片过氧化物同工酶的PAGE分析

大培养皿中染色。
注意：为保持同工酶的活性，要将电泳槽 接上冷却水。
4.8 染色
取1.5ml联苯胺母液+ 28.5ml H2O＋0.03ml 30%
H2O2。混匀后倒入盛有凝胶的培养皿．此时可以看到 胶条上出现蓝色或棕褐色条带，即过氧化物酶带，约 2~5min后用自来水冲洗，这时蓝色带也慢慢变成棕褐 色。 联苯胺有毒，该步骤应戴手套操作
光聚合：使用核黄素作催化剂，聚合反应需光照， 适用于制备
浓缩胶(大孔胶)。 应控制AP和TEMED的用量，使凝胶在40min-1hr之间聚合完全 为宜。
2.2.2 凝胶孔径的可调性及其有关性质
(1)凝胶性能与总浓度及交联度的关系： T%（Acr和Bis总浓度）= (a+b)/m× 100 C% (交联剂百分比) = b/(a+b) × 100 其中，a= Acr克数，b= Bis克数，m=缓冲液体积（ml） 欲制备完全透明而又有弹性的凝胶， 应控制a/b=30左右。 经验公式: C = 6.5 － 0.3 T
实验5 聚丙烯酰胺凝胶电泳
(Polyacryamide gel electrophoresis PAGE)
分离植物过氧化物酶同工酶
1. 目的要求
(1)了解聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。 (2)掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的操作技术。 (3)了解同工酶研究在理论和实践中的重要意义。
PAGE实验中用到的试剂：
酶同工酶谱。
3. 试剂和样品
1 测试样品 新鲜植物叶片。 2 试剂 (1) 分离胶缓冲液: 3M Tris（HCl） pH8.8 (2) 分离胶贮液（30% Acr-0.8% Bis）：4℃贮存，一般可放置1个月左右。 (3)浓缩胶缓冲液: 0.5M Tris(HCl) pH6.7 (4)浓缩胶贮液（10% Acr-2.5% Bis）: 4℃贮存，一般可放置1个月左右。
4.6 加样
石楠叶S1 40 μl + 40%蔗糖40 μl ，混匀，分3孔：10、20、30μl 桂花叶S2 40 μl + 40%蔗糖40 μl ，混匀，分3孔：10、20、30μ l
垂柳叶S3 40 μl + 40%蔗糖40 μl ，混匀，分3孔：10、20、30μ l
加样时.用枪分别取10、20、30μl样品蔗糖混合液，通过缓冲液，小心地 将样品加到三个凝胶凹形样品槽内
实验原理图
1 样品浓缩效应
(1)凝胶孔径不连续性 (2)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性 (3)电位梯度的不连续性
(1)凝胶孔径不连续性: 浓缩胶 T=3% 孔径大 分离胶T=7%或7.5% 孔径小
在2层凝胶交界处，由于凝胶
孔径的不连续性使样品迁移受 阻而压缩成很窄的区带。
(2)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性:
(2) 过氧化物酶同工酶的测定
过氧化物酶是植物体内常见的氧化酶。植物体内许多生理 代谢过程常与它的活性及其同工酶的种类有关。 利用过氧化物酶能催化H2O2把联苯胺氧化成蓝色或棕褐色 产物的原理，将经过电泳后的凝胶置于有H2O2及联苯胺的 溶液染色，出现蓝色或棕褐色产物的部位即为过氧化物酶 同工酶在凝胶中存在的位置，多条有色带即构成过氧化物
Cl-及NH2CH2COO-沿着离子界面继续前进。蛋白质分子由于分子量大，被留
在后面,然后再分成多个区带. 大多数蛋白质在pH6.7或8.3时均带负电荷，在电场中，都向正极移动。
(3)电位梯度的不连续性
V(电泳速度)=E(电位梯度)8 * m(迁移率) E高m慢≈E低m快 由于蛋白质的有效迁移率恰 好介于快、慢离子之间，因 此也就聚集在这个移动的界 面附近，被浓缩形成一个狭 小的中间层。
5
适用的凝胶浓度（%）
20～30 15～20 10～15 5～10 2～5
核酸（RNA） 〈10
4 4 5
15～20 5～10 2～2.6
10 ～10
105～2×106
2.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理
PAGE电泳根据其有无浓缩效 应，分为连续系统与不连续 系统2大类， 本次实验利用 不连续系统. PAGE不连续电泳胶由浓缩胶 和分离胶组成，具有较高的 分辨率，是因为在电泳体系 中集“样品浓缩效应、分子 筛效应及电荷效应”为一体。
4.4
将完成聚合的胶板由制胶架上取下，安装到电极组件上，
带凹槽的内板面向U形硅胶框，两侧用夹子夹紧。一个电极组件
可同时带两个胶板。 在胶板与电极组件之间的内槽中加入1X 的
稀释电极液（pH8.3）至超过内板0.5cm，但不要漫过电极组件. 在底盘中加入电极液至没过胶板底缘0.5cm.
每组需配1X 的稀释电极液（pH8.3）250ml
(10) 联苯胺染色母液：联苯胺1g + 冰醋酸18ml + H2O 2ml溶解储于棕 色瓶中。
注意：（1）联苯胺的毒性很强，其固体和蒸气都能通过皮肤迅速进 入体内，引起恶心、呕吐，损害肝和肾脏。联苯胺及它的盐都是致 癌物质。 （2）联苯胺染色液要当天配制。
4. 操作方法
4.1 制胶架装配 4.2 分离胶制备 7.5％，配12ml，混合后的凝胶溶液，用枪加至两层 玻璃板间的窄缝内，加胶高度距样品模板梳齿下缘约0.5cm，上覆盖 1－2mm高的蒸馏水或水饱和的异丁醇，用于隔绝空气，使胶面平整， 静置30分钟-1小时使其聚合。 4.3 浓缩胶制备 4%，配4ml ，混合均匀后用枪将凝胶溶液加到长、 短玻璃板的窄缝内(即分离胶上方)，插入加样梳，梳齿下不要有气泡 存在，光下静置30分钟-1小时使其凝合。
简称 化学名称 作用
Acr
Bis AP
丙烯酰胺
甲叉双丙烯酰胺 过硫酸铵
单体
交联剂 催化剂
TEMED
Tris SDS
四甲基乙二胺
三羟甲基氨基甲烷 十二烷基硫酸钠
加速剂
缓冲配对离子 变性剂
2. 原理
2.1 生物大分子性质 生物大分子如蛋白质、核酸、多糖等常以颗粒分散在
溶液中，它们的净电荷取决于介质的H+浓度或与其它大分
子的相互作用。在电场中，带电颗粒向阴极或阳极迁移，
迁移方向取决与它们带电的符号。
纸电泳、琼脂糖电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管电泳
2.2
聚丙烯酰胺凝胶聚合原理及有关特性
聚丙烯酰胺是由单体(Acr)、交联剂(Bis)，在催化剂(AP或核黄素)
2.2.1 聚合反应
和加速剂(TEMED)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。 ①丙烯酰胺（Acr）：是凝胶的最主要成分，单体聚合形成 长链。
植物组织中的同工酶（isoenzyme）是基因表达的产物。
每一种植物都有相同的遗传信息，其表达产物与植物的发育和所处的环 境有十分密切的关系，植物不同组织和器官有不同的形态特征和化学组 成，从而合成不同的酶蛋白。 在研究植物基因调控与生长发育、与环境条件的关系以及许多生理生化 和遗传问题时，常常需要分析同工酶谱的差异。
7.5%分离胶和2.5%浓缩胶的配方
试剂用量（ml) 分离胶缓冲液(PH8.8) 30%分离胶贮液 浓缩胶缓冲液(PH6.7) 10%浓缩胶贮液 ddH2O 0.14% 过硫酸胺（AP） TEMED 1.5 6.0 0.004 7.5%分离胶 1.5 3.0 0.5 1.0 0.5 2.0 0.002 2.5%浓缩胶
4.5 制备样品（过氧化物酶的提取）
称取1g待测植物新鲜样本置于冰浴上的研钵内，加入1ml 0.05 mol/l Tris-HCl缓冲液（PH 6.7） 研成匀浆，转入离心管，再用2 ml前述溶液将附着在研钵壁上的研磨样品洗下并全部转入离心管， 12000 rpm 离心5 min，其上清液即为酶的提取液，供电泳分析 用。
在第一个样品槽加５μl溴酚蓝 作为指示剂上样与电泳
4.7 电泳： 正确连通电泳仪与电泳槽(电极红 红，黑 黑，
Hale Waihona Puke 切勿接错)，打开电泳仪开关，将电压调至90V，稳压。
待样品进入分离胶时，将电压调至150V。当蓝色染料迁 移至距离胶板下缘0.5cm时，将电压调回到零，关电。 倒掉电极液，取下胶板，用牛角勺柄轻轻将一块玻璃板 撬开移去，在胶板一端切除一角作为标记，将胶板移至
②甲叉双丙烯酰胺(Bis)：是交联剂，将聚丙烯酰胺链交联成三维网状结构。
③过硫酸铵(AP)或核黄素(Vb2)：提供自由基，引发聚合反应。 ④四甲基乙二胺（TEMED）：是加速剂，它催化过硫酸铵形成自由基。 对核黄素引发的光聚合也有加速作用。
化学聚合：使用AP作催化剂，常用于制备分离胶（小孔胶）。 过量氧会影响链的延长和聚合，所以过硫酸铵(AP)催化的化学 聚合要水封以隔O2。
4.9 实验结果分析：
清洗干净的凝胶用凝胶成像仪照相记录
实验结果，并计算各同工酶的相对迁移率。
(5) Tris-Gly电极缓冲液 pH8.3
注意：Acr和Bis是对中枢神经系统有毒的试剂，操作时应避免直接接触和吸 入它的粉末。
(6)
40% 蔗糖溶液(W/V)。
(7) TEMED(浓度≥98%) (8) 0.14% 过硫酸胺（AP）： 4℃贮存仅能用一周，最好当天配制。
(9) 0.1%溴酚蓝指示剂
（2）凝胶浓度与孔径的关系： T浓度大，孔径小，移动颗粒穿过网孔阻力大。 T浓度小，孔径大，移动颗粒穿过网孔阻力小。
（3）凝胶浓度与被分离物分子量的关系： 由于凝胶浓度不同，平均孔径不同，能通过可移动颗粒 的分子量也不同.
表 1 分子量范围与凝胶浓度的关系
分子量范围 蛋白质 〈104 1～4×104 1～5×104～1×105 1×105 〉5×10
3 电荷效应
进入pH8.9的分离胶中，各种蛋白质所 带净电荷不同，而有不同的迁移率。
表面电荷多，则迁移快；反之，则慢
各种蛋白质按电荷多少、分子量及形 状，以一定顺序排成一个个条型的区 带，从而达到分离的目的。